實(shí)驗(yàn)二十一細(xì)菌的芽孢和莢膜染色法fg

實(shí)驗(yàn)二十一細(xì)菌的芽孢和莢膜染色法

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

1、繼續(xù)學(xué)習(xí)微生物涂片的制作方法；2、掌握芽孢、莢膜染色的基本原理及方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理：

芽孢、莢膜染色法都是利用細(xì)菌

各部位（分）的構(gòu)造不同，它們對(duì)染料的親和力也不同。因此，可以采用各種特殊染色方法，使細(xì)菌細(xì)胞的不同構(gòu)造能在顯微鏡下顯示出來(lái)，便于觀察和區(qū)別。

三、實(shí)驗(yàn)材料：

1、菌種：枯草桿菌、鉀細(xì)菌；2、染色液：孔雀綠、蕃紅溶液、碳素墨水、甲醇、生理鹽水等；3、器材：試管夾、酒精燈、接種針、載玻片、顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙等。

四、方法及步驟：

1、芽孢染色法：某些細(xì)菌（革蘭氏染色陽(yáng)性桿菌）生長(zhǎng)到一定時(shí)間（對(duì)數(shù)期后期），在細(xì)胞內(nèi)形成一個(gè)圓形、橢圓形或圓柱形的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)稱為芽孢，由于在細(xì)胞內(nèi)也叫內(nèi)生孢子。

芽孢的特點(diǎn)是不能繁殖，休眠體，含水少、含脂高、不透明，對(duì)外界環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗能力，有的芽孢在一定條件下可保持活力數(shù)年甚至數(shù)十年之久，芽孢尤其能耐高溫，像枯草桿菌的芽孢，在沸水中可存活1小時(shí)，破傷風(fēng)芽孢桿菌可存活3小時(shí)，而肉毒梭狀芽孢桿菌的芽孢可忍受6小時(shí)，即使在180℃干燥箱中仍可存活10分鐘，這主要是2.6-吡啶二羧酸與鈣的復(fù)合物占芽孢干重5-15%的原理。芽孢有的長(zhǎng)在中央或近中央，圓形或橢圓形，芽孢的大小，位置，在分類鑒定上有一定的意義，它僅僅是芽孢細(xì)菌生活史的一個(gè)環(huán)節(jié)，它還是檢驗(yàn)培養(yǎng)基滅菌徹底不徹底的依據(jù)。芽孢染色的原理是利用細(xì)菌的芽孢和菌體對(duì)染料的親和力不同的原理，用不同的染料進(jìn)行著色，使芽孢和菌體呈不同的顏色而便于區(qū)別。細(xì)菌的芽孢壁比營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞壁厚，致密、透性低，著色和脫色都比營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞困難。因此，一般采用一種堿性染料（孔雀綠）并在微火上加熱或延長(zhǎng)染色時(shí)間。我們采用加熱的方法，使菌體和芽孢同時(shí)都染上色后，再用水沖洗脫去菌體的染料，此時(shí)仍保留芽孢的顏色，并用對(duì)照染料來(lái)染菌體，這樣就將芽孢和菌體分別染成兩種不同的顏色。其步驟如下：⑴取枯草桿菌制成涂片、干燥、固定；⑵用試管夾夾住玻片的一端，在涂片上滴加孔雀綠3-4滴；⑶加熱5分鐘使冒蒸汽，切勿煮干；⑷冷卻、水洗（細(xì)水）；⑸蕃紅溶液復(fù)染2-3分鐘，水洗；⑹干燥、鏡檢；⑺結(jié)果：芽孢呈綠色，菌體呈紅色。芽孢的孔雀綠染色2、莢膜染色法：有些細(xì)菌生活在一定營(yíng)養(yǎng)條件下，可向細(xì)胞壁表面分泌一層松散透明、疏松、柔軟、粘度極大，粘液狀或膠質(zhì)狀的物質(zhì)即為莢膜。莢膜的化學(xué)成分，主要是多糖、多肽、蛋白質(zhì)、脂以及由它們組成的復(fù)合物-脂多糖、脂蛋白等。莢膜雖不是細(xì)胞的主要結(jié)構(gòu)，但它是細(xì)胞外碳源和能源性貯藏物質(zhì)，并能保護(hù)細(xì)胞免受干燥的影響，同時(shí)能增加默某些病原菌的致病能力，使之抵御宿主吞噬細(xì)胞的吞噬。產(chǎn)莢膜細(xì)菌，常常給生產(chǎn)帶來(lái)麻煩，食品工業(yè)中的粘性面包，粘性牛奶，都是由于染了此類細(xì)菌引起的，對(duì)制糖工業(yè)威脅更大，由于產(chǎn)莢膜細(xì)菌的大量繁殖，增加了糖液粘度，影響了過(guò)濾速度，使生產(chǎn)蒙受損失。但在一定條件下，有害的東西可變?yōu)橛幸娴奈镔|(zhì)，如腸膜明串珠菌，在人為控制下，讓其利用蔗糖合成大量產(chǎn)莢膜物質(zhì)—葡聚糖。葡聚糖是生產(chǎn)右旋糖酐的原料，而右旋糖酐是帶代血漿的主要成分，具有維持血液滲透壓和增加血溶量的作用，臨床上還用于抗休克、消腫和解毒，所以在醫(yī)學(xué)上十分重要。莢膜比菌體要大。其染色原理是莢膜包圍在細(xì)菌細(xì)胞外面的一層粘液性物質(zhì)，它是由多糖類衍生物、糖原或多肽所聚積而成，此層對(duì)染料結(jié)合力很弱，因此不易染色，故一般采用負(fù)染色的方法，使細(xì)菌和背景著色，背景與菌體之間形成一透明區(qū)即莢膜，便于觀察，由于莢膜很薄，容易變形，在制片是一般不用加熱固定。其步驟如下：方法一.⑴取鉀細(xì)菌一環(huán)，做成涂片，自然干燥（不能加熱干燥）；→⑵碳素墨水（用平整載玻片順菌液刮過(guò)）；→⑶風(fēng)干；⑷甲醇固定；⑸水洗；→⑹蕃紅溶液1-2分鐘；→⑺自然干燥、鏡檢；→⑻結(jié)果：背景黑色、莢膜無(wú)色、菌體紅色。方法二.取少許菌苔與一滴無(wú)菌水，在玻片上混合，攤平，待自然風(fēng)干后，用石炭酸復(fù)紅染液染2～3min，水洗（注意水不要直接沖洗涂菌處），用濾紙吸干。鏡檢，菌體紅色，莢膜為淡紅色。

五、繪圖：繪芽孢染色、莢膜染色的結(jié)果；六、預(yù)習(xí)：

放線菌、霉菌、酵母菌的形態(tài)觀察

實(shí)驗(yàn)二十二放線菌、霉菌、酵母菌的形態(tài)觀察一、實(shí)驗(yàn)的目的學(xué)習(xí)和掌握觀察放線菌、霉菌形態(tài)的基本方法，并觀察它們的個(gè)體形態(tài)特征。二、實(shí)驗(yàn)原理

1、放線菌：放線菌是介于細(xì)菌與絲狀真菌之間而又接近于細(xì)菌的一類絲狀原核生物，因菌落呈放射狀而得名。

放線菌的菌落在培養(yǎng)基上著生牢固，不易被接種針挑取，由于孢子的存在，常使菌落表面呈粉末狀。它和細(xì)菌單染色一樣，可用石炭酸復(fù)紅和呂氏美藍(lán)等染料著色后，在顯微鏡下觀察它們的形態(tài)。放線菌是由不同長(zhǎng)短的纖細(xì)的菌絲所組成的單細(xì)胞菌絲體，菌絲內(nèi)無(wú)隔膜，菌絲體分為兩部分，即潛入培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)菌絲（基內(nèi)菌絲）和有營(yíng)養(yǎng)菌絲向上生長(zhǎng)的氣生菌絲，有些氣生菌絲分化成各種孢子絲，呈螺旋狀、波浪形或分枝狀等，著生形式有叢生、互生和輪生三種。孢子的表面光滑或粗糙，圓或橢圓和干形。孢子有各種顏色。這些形態(tài)特點(diǎn)都是鑒別放線菌的重要依據(jù)。

⑴營(yíng)養(yǎng)菌絲：又叫初級(jí)菌絲體或一級(jí)菌絲體，匍匐生長(zhǎng)于培養(yǎng)基內(nèi)，主要生理功能是吸收營(yíng)養(yǎng)物，故亦稱基內(nèi)菌絲。營(yíng)養(yǎng)菌絲一般無(wú)隔膜，直徑0.2—0.8μ，但長(zhǎng)度相差很大，短的小于100μ，長(zhǎng)的可達(dá)600μ以上，有的無(wú)色素，有的產(chǎn)生黃、橙、紅、紫、蘭、綠、褐、黑等不同色素，若是水溶性的色素，還可透入培養(yǎng)基內(nèi)，將培養(yǎng)基染上相應(yīng)的顏色，如果是非水溶性（脂溶性）色素，則使菌落呈現(xiàn)相應(yīng)的顏色，因此，色素是鑒定菌種的重要依據(jù)。⑵氣生菌絲：又稱二級(jí)菌絲體。營(yíng)養(yǎng)菌絲體發(fā)育到一定時(shí)期，長(zhǎng)出培養(yǎng)基外并伸向空間的菌絲為氣生菌絲。⑶孢子絲：當(dāng)氣生菌絲體發(fā)育到一定程度，其上分化出可形成孢子的菌絲即孢子絲，又名產(chǎn)孢絲或繁殖絲。放線菌最突出的特性之一是產(chǎn)生大量的、種類繁多的抗生素，根據(jù)估計(jì)，全世界共發(fā)現(xiàn)4000多種抗生素，其中絕大部分是由放線菌產(chǎn)生的。2、霉菌：霉菌是一些“絲狀真菌”的統(tǒng)稱，不是分類學(xué)上的名詞。凡是在基質(zhì)上長(zhǎng)成毛狀、棉絮狀或蜘蛛網(wǎng)狀的絲狀真菌統(tǒng)稱霉菌。霉菌形態(tài)比細(xì)菌、放線菌復(fù)雜，個(gè)體比較大，具有分枝的菌絲體和分化的繁殖器官。因此，在觀察是要注意菌絲的直徑大小，菌絲體有無(wú)隔膜，營(yíng)養(yǎng)菌絲有無(wú)假根，無(wú)性繁殖或有性繁殖時(shí)形成的孢子是哪一種，孢子是怎樣著生的。由于霉菌的菌絲較粗大，而且孢子容易飛散，如將菌體置于水中容易變形，故觀察時(shí)狀不用水浸法制片，而將菌體置于乳酸石炭酸棉蘭染液中，使細(xì)胞不易干燥，并有殺菌作用。三、材料1、菌種：5406放線菌、青霉菌、黑曲霉、根霉、酵母菌；2、染料：石炭酸復(fù)紅、0.1%呂氏美藍(lán)、乳酸石炭酸棉蘭；3、器材：載玻片、蓋玻片、酒精燈、鑷子、接種針、接種鏟等。四、方法及步驟1、放線菌：用接種鏟切取5406放線菌一塊（帶有培養(yǎng)基）→在載玻片上輕壓一下，棄去培養(yǎng)基，制成印