酶分離純化第二節(jié) 發(fā)酵液預(yù)處理

第二節(jié)發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離1懸浮液的預(yù)處理1.1懸浮液的基本特性

(1)產(chǎn)物濃度低,1%-10%；(2)懸浮物顆粒小，相對密度與液相相差不大；（3）固體離子可壓縮性大；（4）液相粘度大，多為非牛頓流體；（5）性質(zhì)不穩(wěn)定1懸浮液的預(yù)處理1.2預(yù)處理目的

a改變發(fā)酵液物理性質(zhì)b產(chǎn)物轉(zhuǎn)入液相中c除去發(fā)酵液中部分雜質(zhì)1.3預(yù)處理方法1.3.1高價無機離子的去除Ca2+草酸Mg2+三聚磷酸鈉Fe3+黃血鹽（普魯士藍）1.3.2蛋白質(zhì)去除加熱調(diào)pH(草酸，無機酸或堿)有機溶劑蛋白沉淀劑1.3.3凝聚與絮凝

使細胞、細胞碎片及大分子物質(zhì)聚結(jié)成較大顆粒，便于提高過濾速率凝聚：指在電解質(zhì)作用下，由于膠體粒子(10-100nm)之間雙電層排斥作用降低，電位下降，而使膠體體系不穩(wěn)定相互聚集成大粒子（1mm）的現(xiàn)象。

機理：

a中和粒子表面電荷

b消除雙電層結(jié)構(gòu)絮凝：高分子聚合物將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)狀，形成絮凝團的過程。

機理：架橋作用絮凝劑應(yīng)用優(yōu)化a用量控制最佳用量為粒子表面積約有一半被聚合物覆蓋時所用的絮凝劑量。bpH控制c固體濃度與粒子尺寸分布d電解質(zhì)含量e后續(xù)工藝要求

常用的凝聚劑與絮凝劑凝集劑：鋁鹽，鐵鹽，鈣鹽，鋅鹽絮凝劑：

陽離子型：陽離子聚丙烯酰胺，聚丙烯酸二烷基胺乙酯，聚二烯丙基四胺鹽。

陰離子型：聚丙烯酸鈉，聚苯乙烯磺酸，木質(zhì)素磺酸鹽

非離子型：聚氧乙烯

天然類：甲殼素

2固液分離

常用的分離方法有：

過濾與膜分離、離心分離等2.1過濾過濾是借助過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)。常用的有濾紙、濾布、纖維、多空陶瓷和各種高分子膜(膜分離)過濾的分類與特性類別截留顆粒的大小截留的主要物質(zhì)過濾介質(zhì)粗濾＞2微米酵母、霉菌、動植物細胞、固形物濾紙、濾布、纖維，多空陶瓷微濾0.2-2微米細菌、灰塵微濾膜超濾20A-0.2微米病毒，生物大分子超濾膜反滲透＜20A生物小分子、鹽、離子反滲透膜影響過濾的因素菌種：真菌，放線菌，細菌培養(yǎng)基：黃豆，花生，淀粉，后期加油，培養(yǎng)基未用完發(fā)酵時間：菌絲自溶前放罐改善過濾方法助濾劑：質(zhì)地堅硬不可壓縮性固體

機理：表面吸附膠體及不可壓縮型格子結(jié)構(gòu)

使用方法：

a預(yù)先制成濾餅

b助濾劑混入懸浮液中一起過濾

常用助濾劑：硅藻土，珍珠巖，活性炭

應(yīng)用優(yōu)化因素

a單位質(zhì)量助濾劑的濾液最大產(chǎn)量

b使用周期

c流速2.2離心分離

指借助于離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小和不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)。離心是研究如細胞核、線粒體、高爾基體、溶酶體和微體，以及各種大分子基本手段。一般認為，轉(zhuǎn)速為10~25Kr/min的離心機稱為高速離心機；轉(zhuǎn)速超過25Kr/min，離心力大于89Kｇ者稱為超速離心機。目前超速離心機的最高轉(zhuǎn)速可達100Kr/min，離心力超過500Kg。（一）、差速離心（differentialcentrifugation）在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的物質(zhì)。由于各種物質(zhì)在大小和密度上相互重疊，而且某些慢沉降顆粒常常被快沉降顆粒裹到沉淀塊中，一般重復(fù)2～3次效果會好一些。差速離心只用于分離大小懸殊的物質(zhì)，更多用于分離細胞器。通過差速離心可將細胞器初步分離，常需進一步通過密度梯離心再行分離純化。速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀（二）、密度梯度離心（densitygradientcentrifugation）用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種。密度梯度離心常用的介質(zhì)為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖。A等速度沉降，B等密度沉降1、速度沉降速度沉降（velocitysedimentation）主要用于分離密度相近而大小不等的物質(zhì)。這種降方法所采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。顆粒在十分平緩的密度梯度介質(zhì)中按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達到分離。2、等密度沉降等密度沉降（isopycnicsedimentation）適用于分離密度不等的顆粒。顆粒物質(zhì)在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和是夠長時間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達到平衡，從而將不同密度的顆粒分離。2、等密度沉降等密度沉降通常在較高密度的介質(zhì)中進行。介質(zhì)的最高密度應(yīng)大于被分離組分的最大密度，而且介質(zhì)的梯度要求較高的陡度，不能太平緩。再者，這種方法所需要的力場通常比速率沉降法大10~100倍，故往往需要高速或超速離心，離心時間也較長。大的離心力、長的離心時間都對細胞不利。密度梯度混合器

貯藏室

混合室BA密度梯度混合器操作1、稀溶液置于B室，濃溶液置于混合室B，保持液面平等2、開動攪拌器3、同時打開兩閥門4、離心管收集注意：1、若濃溶液置于B室，稀溶液置于A室，則梯度液導流管須插入離心管底部，讓后流入的高濃度混合液將先流入的低濃度的混合液頂起來。密度梯度混合器操作2、離心過程中，區(qū)帶位置和寬度隨離心時間的不同而改變。若離心時間過長由于顆粒的擴散作用，會使區(qū)帶變寬，影響離心效果，可適當增加離心力縮短離心時間加以解決密度梯度混合器A=B截面積B＞A濃度體積B＜A線性梯度凸形梯度凹形梯度固液分離設(shè)備板框鼓式真空過濾機錯流過