日本工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)JISL19022002

PAGEPAGE17日本工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)JISL1902：2002紡織品抗菌性能的檢測與評價Testingforantibacterialactivityandefficacyontextileproducts序紡織品抗菌性能的檢測方法始建于1990年。起初作為定性檢測的標(biāo)準(zhǔn)，是利用抑菌環(huán)來判斷抑菌除臭加工過的紡織品的抗菌性能。在1998年的版本中，增加了抗菌加工過紡織品的檢測，另外，又增加了菌液吸收法作為定量的檢測方法之一。菌轉(zhuǎn)印法作為一種新的定量檢測方法添加到本版本中，并據(jù)此來評價其抗菌性能。1、適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了對用抑菌除臭加工和抗菌加工過的紡織品抗菌性能進(jìn)行評價的試驗方法。2、參考標(biāo)準(zhǔn)下述標(biāo)準(zhǔn)雖然是本標(biāo)準(zhǔn)的參考標(biāo)準(zhǔn)，但也是本標(biāo)準(zhǔn)的組成和延續(xù)，應(yīng)用這些標(biāo)準(zhǔn)的大多數(shù)較新的版本（含修正版）。JISK0950滅菌塑料平皿JISK0970活塞式微量移液器JISK3800II級生物安全操作臺JISK8101乙醇（99.5）JISK8150氯化鈉JISK8180鹽酸JISK8263瓊脂JISK8355乙酸JISK8576氫氧化鈉JISK9007磷酸二氫鉀JISK9009二水合磷酸二氫鈉JISL0803纖維染色牢固度試驗標(biāo)準(zhǔn)JISR3505玻璃量器的校準(zhǔn)JISZ8401數(shù)據(jù)修約規(guī)則3、檢測類型抗菌性能的評價試驗可分為以下兩類，根據(jù)檢測目的選擇合適的試驗方法。定性試驗（抑菌環(huán)法）本法利用抑菌環(huán)來評價經(jīng)抑菌除臭加工的紡織品的抗菌性能，要求該抑菌除臭劑易于擴(kuò)散并進(jìn)入營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。定量試驗菌液吸收法本法利用抑菌或殺菌活性值，來評價較高濕度環(huán)境下抗菌、抑菌除臭加工過的紡織制品的抗菌性能。菌轉(zhuǎn)印法本法利用細(xì)菌減少值來評價較低濕度下用抗菌加工過的紡織制品的抗菌性能。4、定義本標(biāo)準(zhǔn)涉及的主要術(shù)語定義如下：抑菌除臭加工一種用于阻礙、抑制紡織品表面細(xì)菌的生長和去除臭味的紡織品加工方法?？咕庸ひ环N用于扼制或扼殺紡織品表面細(xì)菌生長的紡織品加工方法。抑菌環(huán)由于紡織品使用的抑菌除臭試劑擴(kuò)散進(jìn)入瓊脂平板培養(yǎng)基，在細(xì)菌培養(yǎng)后，導(dǎo)致樣品周圍產(chǎn)生透明、不長細(xì)菌的部分；該區(qū)域就是抑菌環(huán)?？咕钚岳靡志艏庸ざ怪破帆@得抑制細(xì)菌繁殖的能力。抑菌活性值分別在經(jīng)抑菌除臭加工過和標(biāo)準(zhǔn)對照的紡織制品上接種細(xì)菌，經(jīng)培養(yǎng)后活菌計數(shù)，利用兩者間活菌數(shù)目的對數(shù)差值表示抑菌活性值。殺菌活性值分別在經(jīng)抗菌加工過和標(biāo)準(zhǔn)對照的紡織制品上接種細(xì)菌，培養(yǎng)后活菌計數(shù)，利用接種的活菌數(shù)與培養(yǎng)后抗菌加工制品的活菌數(shù)目之間的對數(shù)差值來表示殺菌活性值。細(xì)菌減少值分別在經(jīng)抑菌除臭加工和標(biāo)準(zhǔn)對照的紡織制品表面轉(zhuǎn)印上細(xì)菌，培養(yǎng)后經(jīng)活菌計數(shù)，利用兩者間活菌數(shù)目的對數(shù)差值表示細(xì)菌減少值?？咕Ч咕Ч褪且志艏庸さ目咕钚?，是通過抑菌環(huán)、抑菌活性值、殺菌活性值、細(xì)菌減少值等來表征。平皿計數(shù)法本法是通過10倍梯度稀釋法，經(jīng)培養(yǎng)后對活菌菌落數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計的方法。熒光測量法通過定量測定菌液中細(xì)菌細(xì)胞的ATP（三磷酸腺苷）總含量來換算得到活菌的濃度。5、抗菌效果抗菌效果的評價見下：定性試驗（抑菌環(huán)法）根據(jù)下文步驟9，檢測抑菌環(huán)的存在與否來評價抗菌效果。定量試驗按下述方法來評價抗菌效果?？咕庸ぶ破返脑u價可通過殺菌活性值或細(xì)菌減少值來表征。菌液吸收法根據(jù)下文步驟10.1來檢測時，抑菌除臭加工制品的抑菌活性值應(yīng)≥2.0；抗菌加工制品的殺菌活性值應(yīng)≥0。菌轉(zhuǎn)印法根據(jù)下文步驟10.2來檢測時，經(jīng)抗菌加工制品的細(xì)菌減少值應(yīng)≥0。6、試驗用菌6.1、細(xì)菌種類可用細(xì)菌種類見下：金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapneumoniae）銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）大腸桿菌（Escherichiacoli）耐甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌（MethicillinresistantStaphylococcusaureus）6.2、試驗用菌用于試驗的細(xì)菌應(yīng)該符合下表1所示。表1、試驗用細(xì)菌抗菌整理種類細(xì)菌種類抑菌除臭加工金黃色葡萄球菌抗菌加工通用型金黃色葡萄球菌肺炎克雷伯氏菌銅綠假單胞菌*大腸桿菌*特殊用途金黃色葡萄球菌肺炎克雷伯氏菌耐甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌*大腸桿菌*注釋：1、帶*的菌可以省略；2、試驗用細(xì)菌菌株必須與國際微生物菌株保藏聯(lián)盟或日本微生物菌株保藏聯(lián)盟保存的菌株具有相同的系列。7、試驗準(zhǔn)備7.1、細(xì)菌試驗的操作條件在進(jìn)行細(xì)菌試驗操作前，將兩只袖子都挽到胳膊肘附近，用70％～90％（體積比）的酒精或0.1％～1％的倒置肥皂液對雙手及胳膊都進(jìn)行消毒。7.2、藥品、材料和器具除特別指定的外，試驗所用到的藥品、器材見下：酒精：按JISK8101規(guī)定的非常純凈或較純的。倒置的肥皂液：符合日本藥典第13次修訂版所提到的。瓊脂：必須符合JISK8263的規(guī)定。牛肉膏：用于微生物試驗。蛋白胨：用于微生物試驗。氯化鈉：必須符合JISK8150的規(guī)定。純水：符合日本藥典第13次修訂版所提到的。水：符合日本藥典第13次修訂版所提到的普通水。酵母浸膏：用于微生物試驗。胰蛋白胨：用于微生物試驗。葡萄糖：用于微生物試驗。酪蛋白胨：用于微生物試驗。大豆蛋白胨：用于微生物試驗。卵磷脂：用于微生物試驗。非離子表面活性劑：吐溫80。磷酸二氫鉀：必須符合JISK9007的規(guī)定。二水合磷酸二氫鈉：必須符合JISK9009的規(guī)定。氫氧化鈉：必須符合JISK8576的規(guī)定。氯化氫（鹽酸）：必須符合JISK8180的規(guī)定。乙酸（醋酸）：必須符合JISK8355的規(guī)定。三水合（5’三羥甲基氨基甲烷：用于生化試驗。二水合四乙酸乙烯基二銨二鈉鹽：用于生化試驗。四水合乙酸鎂：用于生化試驗。二硫蘇糖醇（DL-Dithiothreitol）對映體：用于生化試驗。熒光（素）酶（EC編號1.13.12.7）：用于生化試驗。D-蟲熒光素：用于生化試驗。牛血清白蛋白：用于生化試驗。蔗糖：用于生化試驗。三磷酸腺苷雙磷酸酶（EC編號3.6.1.5）：用于生化試驗。腺苷脫氨酶（EC編號3.5.1.4）：用于生化試驗。10％苯扎氯胺（潔爾滅）水溶液：符合日本藥典第13次修訂版所提到的。棉塞：使用OME棉塞、硅橡膠塞、金屬塞或莫頓（morten）塞。培養(yǎng)皿：用內(nèi)徑為90mm的玻璃制品或符合JISK0950中規(guī)定的90A或90B標(biāo)準(zhǔn)。干熱滅菌器：能保持在160℃～170℃高壓滅菌器：能保持在121℃生物安全柜：符合JISK3800的要求或等同的性能。分光光度計：能在660nm測量。潔凈工作臺：用于生化試驗。鉑金接種環(huán)：端部大約有4mm左右的圓環(huán)。培養(yǎng)箱：能夠保溫在37℃±1℃小瓶：玻璃制容積30ml，帶PP制有內(nèi)螺紋的蓋子，并可加聚四氟乙烯或硅橡膠密封。不銹鋼圓片：不銹鋼制，直徑大約28mm，約20g重。標(biāo)準(zhǔn)織物：100％棉纖維制，著色牢度符合JISL0803的規(guī)定，即用洗衣機(jī)60℃玻璃棒：直徑大約18mm，重約40g～50g。移液管：符合A級或JISK0970、JISR3505標(biāo)準(zhǔn)，或者具有等同的精度。鑷子：用于膜濾器的操作。濾膜：由聚碳酸酯制成，直徑47mm具有0.4um的微孔。過濾裝置：上部有一個帶濾膜的漏斗，下面是帶抽濾的緩沖瓶。轉(zhuǎn)印裝置：能以4N的力拓印到檢測樣品表面上，并可在3s內(nèi)旋轉(zhuǎn)180o。熒光光度計：能在300nm～650nm測量，在熒光顯色劑作用下分辨精度為10-13mol/l～10-7mol/l的ATP。（具體可參考步驟7.5）試管振蕩器：用于微生物試驗。PH測量儀：用于微生物試驗。注：試管、小瓶、燒瓶、移液管、鑷子或其類似物品應(yīng)仔細(xì)用堿性或中性洗滌劑洗滌，然后漂洗干凈，烘干，用前必須經(jīng)高溫干熱法或高壓濕熱法滅菌。7.3、滅菌方法7.3.1、干熱滅菌將需要滅菌處理的物品放入干熱滅菌器中，在160℃～170℃下保持1h～2h，直至棉塞或包裝紙注(1)：滅菌后，如果棉塞或包裝紙不小心被水弄濕，相關(guān)器皿請不要繼續(xù)使用。7.3.2、高壓蒸汽滅菌在高壓鍋中裝上水，把需要滅菌的物體在金屬網(wǎng)筐中擺好，放置在高壓鍋中的架子上。蓋緊高壓鍋，開始加熱，在121℃下（壓力大約103kPa）保持15min～20min。然后停止加熱，自然冷卻至溫度低于100為保證高壓鍋的清潔，避免沾染抗菌劑和培養(yǎng)基，必要時可采用中性洗滌劑洗滌，并用大量水沖洗干凈。7.3.3、火焰滅菌將物品放入煤氣焰或酒精焰中滅菌。若是鉑金接種環(huán)，應(yīng)充分滅菌；若是試管，讓其接觸火焰2s～3s。7.3.4、酒精滅菌將棉花或紗布蘸取75％（體積比）的酒精，輕輕擠壓并擦拭需要滅菌的物體。7.4、細(xì)菌培養(yǎng)基和生理鹽水細(xì)菌培養(yǎng)基和生理鹽水應(yīng)按如下的步驟配制和使用。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基A按如下步驟配制：取5.0g牛肉膏，10.0g蛋白胨，5.0g氯化鈉，15.0g瓊脂粉，加到盛有1000ml純水的燒瓶中，并在沸騰水浴中加熱至完全溶解；用0.1mol/l氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.0±0.2（25℃下）；塞好棉塞，用高壓蒸汽滅菌器滅菌。若配好后不立即使用，要在5℃～10℃下保存。不要使用配制完存放一個月或以上的培養(yǎng)基。若該培養(yǎng)基用于接種細(xì)菌時，將此培養(yǎng)基加熱至45℃～營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基A按如下步驟配制：取5.0g牛肉膏，10.0g蛋白胨，5.0g氯化鈉，加到盛有1000ml純水的燒瓶中，混合攪勻后用0.1mol/l氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.0±0.2（25℃下）；并分裝在試管中，塞好棉塞，置于高壓蒸汽滅菌器中滅菌。若配好后不立即使用，要在5℃～10營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基B按如下步驟配制：取3.0g牛肉膏，5.0g蛋白胨，加到盛有1000ml純水的燒瓶中，混合攪勻后用0.1mol/l氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.8±0.2（25℃下）；若需要就分裝在試管中，塞好棉塞，置于高壓蒸汽滅菌器中滅菌。若配好后不立即使用，要在5℃～10營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基B按如下步驟配制：取3.0g牛肉膏，5.0g蛋白胨，15.0g瓊脂粉，加到盛有1000ml純水的燒瓶中，并在沸騰水浴中加熱至完全溶解；用0.1mol/l氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.8±0.2（25℃下）；塞好棉塞，用高壓蒸汽滅菌器滅菌。若配好后不立即使用，要在5℃～10℃下保存。不要使用配制完存放一個月或以上的培養(yǎng)基。當(dāng)此培養(yǎng)基用于接種細(xì)菌時，將此培養(yǎng)基預(yù)熱至45℃～營養(yǎng)瓊脂斜面按如下步驟配制：向試管中加入事前準(zhǔn)備好并經(jīng)預(yù)熱的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基A（步驟a）或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基B（步驟d）約10ml；塞好棉塞，用高壓蒸汽滅菌器滅菌。滅菌后，將此試管放入潔凈間，并將其相對水平面傾斜15o，至冷卻凝固。若配好后不立即使用，要在5℃～10℃SCDLP培養(yǎng)基按如下步驟配制：取17.0g酪蛋白胨，3.0g大豆蛋白胨，5.0g氯化鈉，2.5g磷酸二氫鉀，2.5g葡萄糖，1.0g卵磷脂，加到盛有1000ml純水的燒瓶中；混合攪勻后，加入7.0g非離子表面活性劑；完全溶解后，用氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.0±0.2（25℃下）；若需要就分裝在試管中，塞好棉塞，置于高壓蒸汽滅菌器中滅菌。若配好后不立即使用，要在5℃～瓊脂培養(yǎng)基按如下步驟配制：取20.0g瓊脂粉加入到盛有1000ml純水的燒瓶中；并在沸騰水浴中加熱至完全溶解；塞好棉塞，用高壓蒸汽滅菌器滅菌。若配好后不立即使用，要在5℃～10℃生理鹽水按如下步驟配制：取8.5g氯化鈉加入到盛有1000ml純水的燒瓶中；完全溶解；若需要就分裝在試管中，塞好棉塞，置于高壓蒸汽滅菌器中滅菌。若準(zhǔn)備好后不立即使用，要在5℃～10℃洗脫用生理鹽水按如下步驟配制：取8.5g氯化鈉加入到盛有1000ml純水的燒瓶中；完全溶解之；再加入2.0g非離子表面活性劑，溶解完后按20ml分裝在試管或錐形瓶中，塞好棉塞，置于高壓蒸汽滅菌器中滅菌。若配好后不立即使用，要在5℃～10℃用于制備ATP標(biāo)準(zhǔn)試劑的SCDLP培養(yǎng)基按如下步驟配制：在潔凈工作臺中，取10ml的SCDLP培養(yǎng)基（步驟f）到經(jīng)滅菌處理的試管中，再加入1ml的ATP消除劑（參見7.5d），混勻后在37℃下靜置1h，注意防止微生物污染。然后，將其放于70℃～907.5、熒光測量劑，緩沖溶液以及類似試劑熒光測量劑，緩沖溶液以及類似試劑按下述方法配制和使用。ATP標(biāo)準(zhǔn)試劑的儲放（2×10-6mol/l）將59.7mg的三水合（5’-）三磷酸腺苷二鈉鹽溶于盛有100ml純水的燒瓶中。小心塞好塞子，并將其存放在－20ATP熒光試劑及類似試劑按步驟7.2的規(guī)定，熒光光度計所采用的ATP熒光試劑應(yīng)能夠分辨10-13mol/l～10-7mol/l濃度的ATP。其成分和準(zhǔn)備步驟見下。ATP熒光試劑的緩沖液分別稱取760mg三羥甲基氨基甲烷，370mg二水合四乙酸乙烯基二銨二鈉鹽，800mg四水合乙酸鎂，8mg二硫蘇糖醇（DL-Dithiothreitol）對映體，溶于240ml純水中，并用稀醋酸把pH調(diào)節(jié)為7.5±0.2（25℃ATP熒光試劑分別稱取10mg熒光（素）酶，15mgD-蟲熒光素，60mg牛血清白蛋白溶于30mlATP熒光試劑的緩沖液中（步驟1制備）。溶解完全后在室溫下靜置15min后使用。注意配好的ATP熒光試劑必須在3h內(nèi)使用。ATP萃取劑能從接種用的試驗菌細(xì)胞中萃取ATP，效率不低于80％。其成分和準(zhǔn)備步驟見下文舉例。用純水將10％的苯扎氯胺（潔爾滅）水溶液稀釋10倍。ATP消除劑在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基B（步驟7.4c）中加入1/10的本試劑，可將培養(yǎng)基中的ATP在15min內(nèi)降低到低于10-13mol/l的水平。其成分和準(zhǔn)備步驟見下：在10ml含有0.037％蔗糖、0.005mol/l的磷酸二氫鈉緩沖溶液中（pH＝7.2±0.2，25℃接種準(zhǔn)備的緩沖液該緩沖液含有0.037％蔗糖、0.005mol/l的磷酸二氫鈉（pH＝7.2±0.2，25℃7.6、細(xì)菌的轉(zhuǎn)接與保存細(xì)菌的轉(zhuǎn)接應(yīng)在無菌條件下按下述步驟進(jìn)行。一只手拿一貯藏菌株的試管和一斜面培養(yǎng)基試管（步驟7.4e）（對于定性試驗，用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基A；對于定量試驗，用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基B），另一只手握住鉑金接種環(huán)的莖部，取下試管的棉塞，并在火焰上對試管口進(jìn)行滅菌。然后將鉑金接種環(huán)用火焰滅菌并將其插入斜面培養(yǎng)基中有冷凝水的地方(2)，冷卻后用其從貯藏菌株的試管中刮一環(huán)培養(yǎng)基表面的細(xì)菌，接種并分散(3)到新鮮的斜面培養(yǎng)基表面，再次用火焰對試管口滅菌，并塞好塞子。對用過的鉑金接種環(huán)再次進(jìn)行火焰滅菌。轉(zhuǎn)接好細(xì)菌的斜面培養(yǎng)基在37℃±1℃下培養(yǎng)24h～48h，并在5℃一個月內(nèi)應(yīng)按上文的步驟再次進(jìn)行轉(zhuǎn)接，但轉(zhuǎn)接的代數(shù)應(yīng)控制在10代以內(nèi)；若轉(zhuǎn)接的斜面保存超過一個月，則不得用于下次的轉(zhuǎn)接。注(2)：參見圖1。注(3)：如圖1所示，用冷凝水分散細(xì)菌，并沿斜面畫一直線直至端部。再次用接種環(huán)打散細(xì)菌，然后插入冷凝水中，再畫一條Z形折線直至端部。參考資料：為長期貯藏細(xì)菌，需采用凍干管或經(jīng)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后，培養(yǎng)基上部用滅菌石蠟封好。圖1、在斜面培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接細(xì)菌8、試驗用接種液的培養(yǎng)和制備以及活菌計數(shù)8.1、試驗用接種液的培養(yǎng)和制備8.1.1、試驗用接種液的培養(yǎng)按以下步驟進(jìn)行細(xì)菌接種的培養(yǎng)。菌培養(yǎng)物A用鉑金接種環(huán)從保藏菌株（符合步驟7.6）上刮一環(huán)轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基（步驟7.4e）上，然后在37℃±1℃菌培養(yǎng)物B從培養(yǎng)好的斜面上（步驟a）刮一環(huán)轉(zhuǎn)接到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基A（步驟7.4b）上，并在37℃±1℃下培養(yǎng)活化24h±菌培養(yǎng)物C用鉑金接種環(huán)從保藏菌株（符合步驟7.6）上刮一環(huán)轉(zhuǎn)接到含有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基B（步驟7.4d）的平皿上，在37℃±1℃下培養(yǎng)24h～48h。然后將此平皿在5℃～10菌培養(yǎng)物D取20ml的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基B（步驟7.4c）到100ml錐形瓶中，再用鉑金接種環(huán)從菌培養(yǎng)物C的平皿上刮一菌落的細(xì)菌接種到肉湯中，并開始活化培養(yǎng)(4)。注(4)：活化培養(yǎng)條件見下溫度：37℃±1振蕩轉(zhuǎn)速：110轉(zhuǎn)/分，振幅3cm培養(yǎng)時間：18h～24h菌培養(yǎng)物E取20ml的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基B（步驟7.4c）到100ml錐形瓶中，加入菌培養(yǎng)物D得到的細(xì)菌液0.4ml，菌液濃度為（1～2）×108cfu/ml，并開始培養(yǎng)(5)。注(5)：接種培養(yǎng)條件見下溫度：37℃±1振蕩轉(zhuǎn)速：110轉(zhuǎn)/分，振幅3cm培養(yǎng)時間：3h±1h培養(yǎng)后菌液濃度：約107cfu/ml參考資料：該活化好的菌液在冰點(diǎn)保存條件下，可在8h內(nèi)使用。8.1.2、試驗用接種液的制備定性試驗的接種（抑菌環(huán)法）通過吸光度法(6)或熒光光譜法(7)來確定菌培養(yǎng)物B中的細(xì)菌濃度，并在室溫下用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基A（步驟7.4b）稀釋至（106～107）cfu/ml。定量試驗的接種（菌液吸收法）通過吸光度法(6)或熒光光譜法(7)來確定菌培養(yǎng)物D中的細(xì)菌濃度，并在室溫下用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基B（步驟7.4c）稀釋至（1～2）×108cfu/ml。然后，通過吸光度法(8)或熒光光譜法(9)來確定菌培養(yǎng)物E中的細(xì)菌濃度。用純水將營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基B（步驟7.4c）稀釋20倍，并在冰浴下用稀釋液將菌培養(yǎng)物E得到的菌濃度稀釋至（1±0.3）×105cfu/ml，用于接種試驗。該接種試驗菌液在0℃注(6)：吸光度法步驟見下。取1ml步驟8.1.2a掌握光吸收度與細(xì)菌濃度的關(guān)系曲線。注(7)：熒光光譜法步驟見下。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸公式。1）用純水稀釋步驟7.5a）得到的ATP標(biāo)準(zhǔn)試劑分別至2×10-8mol/l，2×10-9mol/l，2×10-10mol/l，并置于塑料試管中。2）分別取稀釋后的ATP標(biāo)準(zhǔn)試劑2×10-8mol/l，2×10-9mol/l，2×10-10mol/l各0.1ml于塑料試管中，加入步驟7.5e得到的緩沖溶液0.9ml，并充分振蕩。分別取上述濃度的溶液各0.1ml于塑料試管中，以其作樣品測量稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)ATP試劑。3）加入0.1ml純水，0.8ml接種緩沖液，0.1mlATP消除劑到塑料試管中，充分振蕩后，取3支塑料試管分別加入0.1ml上述溶液，靜置5min～30min，作為測量空白使用。4）加入0.1mlATP萃取劑到步驟3）得到的測量空白中，搖勻后加入0.1ml的ATP熒光試劑，用旋渦振蕩器分散5s后，立即用熒光光度計測量發(fā)光度。5）取0.1mlATP萃取劑分別加入到用來測量稀釋后標(biāo)準(zhǔn)ATP試劑的樣品（步驟2）中，按濃度升序的次序加入；搖勻，然后加入0.1mlATP熒光試劑，用旋渦振蕩器分散5s后，立即用熒光光度計測量發(fā)光度。6）通過測量稀釋后標(biāo)準(zhǔn)ATP試劑（濃度為1×10-8mol/l，2×10-9mol/l，2×10-10mol/l）的發(fā)光度的平均值來除以ATP濃度，可得到平均值的系數(shù)A。系數(shù)B可以通過下式（1）在Y＝0時得到。校準(zhǔn)曲線表達(dá)式Y(jié)＝AX＋B………………（1）其中，Y：ATP濃度（mol/l）X：發(fā)光度（RLU=RelativeLightUnit為相關(guān)光量）接種的ATP濃度按下述步驟測量。1）準(zhǔn)備1支ATP消除試驗用試管和3支測試用試管。2）為評價ATP消除效果，取0.1ml步驟8.1.2a3）取0.1ml的ATP萃取劑到步驟2）中的測試用試管中，振蕩5s；然后再加入0.1ml的ATP熒光試劑，用旋渦振蕩器分散5s后，立即用熒光光度計測量發(fā)光度。4）得到ATP濃度Y，根據(jù)式（1）并結(jié)合下式（2）將ATP濃度轉(zhuǎn)化為細(xì)菌濃度。P＝10×Y×10-3/Q…………………（2）其中，P：細(xì)菌濃度（cfu/ml）Q：每種細(xì)菌細(xì)胞的ATP總量（mol/cell），具體數(shù)據(jù)見下金黃色葡萄球菌：2.4×10-18mol/cell肺炎克雷伯氏菌：1.7×10-18mol/cell耐甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌：9.6×10-19mol/cell銅綠假單胞菌：8.6×10-19mol/cell大腸桿菌：2.4×10-18mol/cell10：稀釋倍率10-3：升到毫升的轉(zhuǎn)換系數(shù)注(8)：菌液吸收法說明見下。充分振蕩菌培養(yǎng)物E得到的接種液，用純水稀釋5倍，然后用旋渦振蕩器分散均勻；靜置30s后，用分光光度計在660nm處測量吸收度。注(9)：熒光測量法按注(7)步驟測量；但Q值按下面數(shù)據(jù)處理。Q：每種細(xì)菌細(xì)胞的ATP總量（mol/cell），具體數(shù)據(jù)見下金黃色葡萄球菌：9.5×10-18mol/cell肺炎克雷伯氏菌：4.7×10-17mol/cell耐甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌：3.5×10-18mol/cell銅綠假單胞菌：9.8×10-17mol/cell大腸桿菌：2.8×10-16mol/cell定量試驗的接種（菌轉(zhuǎn)印法）假定菌培養(yǎng)物D中接種用的細(xì)菌濃度和菌培養(yǎng)物E中接種用的細(xì)菌濃度與步驟8.1.2b）中是相同的。用純水稀釋營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基B（步驟7.4c）20倍，在冰浴中用稀釋的營養(yǎng)肉湯調(diào)整菌培養(yǎng)物E，得到接種用菌液，使其細(xì)菌濃度達(dá)到（1～2）×107cfu/ml，制成試驗用接種液。該試驗用接種液應(yīng)在冰浴下存放并在4h內(nèi)使用。8.2、活菌計數(shù)法通過10倍梯度稀釋傾注平板培養(yǎng)基的方法或通過熒光測量法來測定洗脫后菌液中細(xì)菌濃度。8.2.1、傾注培養(yǎng)基法傾注培養(yǎng)基法是通過10倍梯度稀釋法來測定的，按下述步驟操作。用滅過菌的移液管取1ml來自步驟10.1.3c）、步驟10.1.3d）、步驟10.2.4d）、步驟10.2.4e）洗脫后的菌液，加入到盛有9ml±0.1ml生理鹽水（步驟7.4h）的試管中，充分振蕩。用移液管取1ml上述混勻的菌液，加到另一支盛有9ml±0.1ml生理鹽水（步驟7.4h）的試管中，并振蕩均勻。重復(fù)上述操作，用10倍梯度稀釋法制備好一系列濃度，用移液管從系列梯度稀釋的試管中連續(xù)取1ml，分別放于2個平皿中，然后各加入預(yù)熱至45℃～46℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基B（步驟7.4d）15ml，蓋好上蓋，室溫靜置15min。培養(yǎng)基固化后，將平皿倒轉(zhuǎn)，在37P＝Z×R……………………（3）其中，P：細(xì)菌濃度（cfu/ml）Z：平行試驗的兩個平皿計數(shù)的平均值（菌落數(shù)）R：稀釋比例（倍數(shù)）8.2.2、熒光光譜法熒光光譜法按以下步驟操作。確定校準(zhǔn)曲線表達(dá)式。稀釋ATP標(biāo)準(zhǔn)試劑（步驟7.5a）到2×10-8mol/l，2×10-9mol/l，2×10-10mol/l至塑料試管中。若采用接種菌液吸收法則用（步驟7.4i）的洗脫用生理鹽水來稀釋；若采用菌轉(zhuǎn)印法則用（步驟7.4j）的用于制備ATP標(biāo)準(zhǔn)試劑的SCDLP培養(yǎng)基來稀釋。分別取2×10-8mol/l，2×10-9mol/l，2×10-10mol/l的ATP標(biāo)準(zhǔn)試劑0.1ml到塑料試管中，加入0.9ml的緩沖溶液（步驟7.5e），充分振蕩。取0.1ml上述溶液到3支塑料試管中作為樣品測量稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)ATP試劑。對于接種菌液吸收法取0.1ml洗脫用生理鹽水（步驟7.4i），或者對于菌轉(zhuǎn)印法則取0.1ml（步驟7.4j）的用于制備ATP標(biāo)準(zhǔn)試劑的SCDLP培養(yǎng)基；0.8ml的緩沖溶液（步驟7.5e），0.1ml的ATP消除劑置于塑料試管中，混勻后各取0.1ml溶液到3支塑料試管中，靜置5min～30min后作為測試用空白樣品。在步驟3）的空白樣品試管中加入0.1ml的ATP萃取劑，混勻后加入0.1mlATP熒光試劑，用旋渦振蕩器分散5s后，立即用熒光光度計測量發(fā)光度。按濃度的升序在步驟2）用于測量稀釋后標(biāo)準(zhǔn)ATP試劑的樣品中各加入0.1ml的ATP萃取劑，振蕩5s后，加入0.1ml的ATP熒光試劑，用旋渦振蕩器分散5s后，立即用熒光光度計測量發(fā)光度。用不同濃度ATP標(biāo)準(zhǔn)試劑的發(fā)光度的平均值除以ATP濃度，得到平均值的系數(shù)A。系數(shù)B可以通過式（1）在Y＝0時得到。測定洗脫液中的ATP濃度。每組試驗均需準(zhǔn)備ATP消除效果試驗用試管1支，測量試驗用試管3支。取步驟10.1.3c）、10.1.3d）、10.取0.1ml的ATP萃取劑到步驟2）中的測量用試管中，振蕩5s后，加入0.1mlATP熒光試劑，用旋渦振蕩器分散5s后，立即用熒光光度計測量發(fā)光度。.根據(jù)式（1）得到ATP濃度Y。根據(jù)式（2）和下面的Q值可得到細(xì)菌濃度值。菌液吸收法中的Q值：金黃色葡萄球菌：2.4×10-18mol/cell肺炎克雷伯氏菌：1.7×10-18mol/cell耐甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌：9.6×10-19mol/cell銅綠假單胞菌：8.6×10-19mol/cell大腸桿菌：2.4×10-18mol/cell菌轉(zhuǎn)印法中的Q值：金黃色葡萄球菌：9.5×10-18mol/cell肺炎克雷伯氏菌：4.7×10-18mol/cell耐甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌：3.5×10-18mol/cell銅綠假單胞菌：9.8×10-17mol/cell大腸桿菌：2.8×10-18mol/cell9、定性試驗（抑菌環(huán)法）9.1、試驗樣片的制備9.1.1、試樣的大小、形狀和數(shù)量試驗用樣品的大小、形狀參見下表2。對每種測試細(xì)菌，各準(zhǔn)備3片經(jīng)抑菌除臭加工的樣品和3片標(biāo)準(zhǔn)布樣品。表2、試驗用樣品的大小和形狀試樣種類試驗用樣品的大小和形狀機(jī)織織物、針織織物、非機(jī)織織物直徑28mm圓形(10)。紗線如圖2所示，在一塊38mm×26mm載玻片的中間單層纏繞28mm寬的紗線（約3.3g）(11)。纖維填料、長絨取大約0.2g，裁成3mm～5mm，混合均勻，放在如圖3所示的內(nèi)徑為28mm的圓筒中，均勻鋪開，施加壓力使之形成28mm直徑的圓形(12)。注(10)：織物樣品也可以是28mm×28mm的正方形。(11)：如圖4所示，取大約0.2g重5cm長的紗線，成束平行放置，分別在離兩端約5mm處用相同的紗線綁?。ǔ衫Π鼱睿?。也可用這種樣品。(12)：裁好后用大約63.7MPa的壓強(qiáng)保持10min，模壓后可以使用。單位：mm圖2、試樣在載玻片上的纏繞圖3、制備試樣用容器圖4、捆包狀測試樣9.1.2、試樣預(yù)處理對于用鋁箔包好步驟9.1.1中得到纏繞的試樣或放在培養(yǎng)皿中的樣品，放置在高壓蒸汽滅菌器中滅菌。若紗線試樣經(jīng)過抗菌整理并纏繞在載玻片上，則本步驟可以省略。9.2、試驗操作9.2.1、傾注平板培養(yǎng)基的制備在潔凈工作臺中，取1ml步驟8.1.2a）中的菌液到經(jīng)滅菌處理的平皿中，加入15ml預(yù)熱至45℃～46℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基A（步驟7.4a），充分混合，室溫靜置直至固化。將平皿翻轉(zhuǎn)(13)，保持上蓋傾斜注(13)：見圖5(14)：見圖6圖5圖69.2.2、試樣的試驗操作用無菌紗布蘸酒精對鑷子進(jìn)行消毒，小心取經(jīng)步驟9.1.2處理的試樣放置于步驟9.2.1制備的平板培養(yǎng)基的中心，使樣品緊貼在培養(yǎng)基表面并注意不要擦壞表面。在此過程中若樣品在處理時容易卷曲或具有纖維填料、長絨等，可在試樣(15)上面放置一經(jīng)過滅菌處理的不銹鋼圓片。注(15)：若不銹鋼圓片比試樣大，可將該圓片放置到幾個堆砌起來的試樣上，保證不銹鋼圓片不會接觸到培養(yǎng)基表面。9.3、培養(yǎng)試驗將步驟9.2.2得到的平皿倒置(16)，在37℃±1注(16)：當(dāng)試驗樣品上放有不銹鋼圓片或樣品纏繞在載玻片上時，平皿不需翻轉(zhuǎn)。9.4、確定試驗用菌的活性狀況按步驟9.3培養(yǎng)完后，若標(biāo)準(zhǔn)布所在的培養(yǎng)基表面沒有顯著的細(xì)菌增殖，則該試驗無效，應(yīng)重復(fù)本試驗。9.5、試驗結(jié)果9.5.1、抑菌環(huán)的測量在按步驟9.3培養(yǎng)完成后，從平皿底部看在試驗樣品周圍有抑菌環(huán)出現(xiàn)；如下圖7所示測量T值和D值，以mm為單位的整數(shù)；根據(jù)下式（4）來計算抑菌環(huán)寬度。這樣可以得到抗菌樣品的3個片的抑菌環(huán)寬度平均值，注意保留一位小數(shù)。W＝（T－D）/2……………………（4）其中，W：抑菌環(huán)寬度（mm）T：試樣和抑菌環(huán)的總寬度（mm）D：試樣的長度（mm）圖7、抑菌環(huán)的測量9.5.2、抑菌環(huán)存在的評價根據(jù)表3來對步驟9.5.1的抑菌環(huán)結(jié)果進(jìn)行評價。表3試驗結(jié)果抑菌環(huán)存在的判定抑菌環(huán)寬度平均值＞0存在抑菌環(huán)寬度平均值＝0不存在9.5.3、試驗結(jié)果的記錄記錄細(xì)菌名稱、保藏號、接種細(xì)菌濃度、抗菌處理樣品的抑菌環(huán)寬度平均值、是否存在抑菌環(huán)、試驗樣品的形狀和種類等。若在樣品上放置了不銹鋼圓片，在試驗結(jié)果記錄中應(yīng)該標(biāo)明（參考下面的示例）。示例：檢測結(jié)果試驗細(xì)菌名稱（保藏號）金黃色葡萄球菌（ATCC6538P）肺炎克雷伯氏菌（ATCC4352）細(xì)菌濃度（cfu/ml）2.3×1063.5×106抑菌環(huán)平均寬度（mm）3.52.0抑菌環(huán)存在的判定存在存在樣品種類、形狀等描述針織織物，直徑28mm的圓形（用不銹鋼圓片蓋壓）10、定量試驗10.1、菌液吸收法10.1.1、試驗樣片的準(zhǔn)備制備6片標(biāo)準(zhǔn)布樣片(17)和3片經(jīng)抑菌除臭加工的樣片，重約0.4g尺寸在18mm的正方形。制作樣片時注意避免污染。注(17)：在6片標(biāo)準(zhǔn)布樣片中，3片用作接種后立刻進(jìn)行活菌計數(shù)，剩下3片用作培養(yǎng)試驗后的活菌計數(shù)。10.1.2、樣片的滅菌取步驟10.1.1中得到的每片樣品(18)~(21)分別放到小瓶中。將去蓋小瓶按口朝上放入金屬筐中，筐上部加以鋁箔封裝，瓶蓋也單獨(dú)用鋁箔封包，并用高壓鍋滅菌。滅菌完畢后，立即從高壓鍋取出，去掉鋁箔，置于潔凈工作臺上干燥60min，然后旋緊小瓶蓋子。注(18)：若試樣容易卷曲，按方形取0.4g，對折得到約18mm的正方形，將其放于小瓶中，上面壓一只玻璃棒，或者折疊成18mm的正方形，重約0.4g的樣片，并用線固定一端或兩端。注(19)：若是羽毛或纖維填料的試樣，取0.4g放于小瓶中，并放一個玻璃棒在上面。注(20)：對于紗線樣品，取若干束成捆，并壓一只玻璃棒在上面。注(21)：若是地毯或者類似物，疊起來裁，取0.4g重的一疊放入小瓶中，其上壓一只玻璃棒。10.1.3、試驗操作接種試驗的培養(yǎng)用移液管準(zhǔn)確量取0.2ml步驟8.1.2b）中制備的試驗用接種液，按點(diǎn)樣接種(22)到步驟10.1.2準(zhǔn)備的樣品上，并蓋緊瓶蓋。注(22)：為充分浸透樣品，可在接種液中加入0.05％的非離子表面活性劑。若接種液中加入了表面活性劑，則在檢測結(jié)果和報告中要如實記錄。培養(yǎng)試驗接種后開始培養(yǎng)試驗（3個標(biāo)準(zhǔn)布對照樣，3個經(jīng)抑菌除臭加工的試樣），在溫度為37℃±1℃下培養(yǎng)18h±接種完成后立即洗脫取20ml洗脫用生理鹽水（步驟7.4i制備）加入到步驟a）中3個標(biāo)準(zhǔn)布對照樣的瓶中，旋緊瓶蓋，用力振蕩（振幅30cm振蕩30次）或用旋渦振蕩器（每次5s振蕩5次）來洗脫每個試樣表面的細(xì)菌。培養(yǎng)完成后的洗脫各取20ml冰冷的生理鹽水（步驟7.4i制備）分別加入到步驟b）中的6個樣片的小瓶中，旋緊瓶蓋，用力振蕩（振幅30cm振蕩30次）或用旋渦振蕩器（每次5s振蕩5次）來洗脫每個試樣表面的細(xì)菌?；罹嫈?shù)結(jié)合步驟8.2并根據(jù)式（5）得到活菌濃度。M＝P×20………（5）其中，M：活菌數(shù)目（cell）P：按步驟8.2得到的細(xì)菌濃度（cells/ml）20：洗脫用生理鹽水的體積（ml）10.1.4、檢測結(jié)果試驗有效性的判定根據(jù)細(xì)菌增殖數(shù)量來判定試驗結(jié)果的有效性。按式（6）得到細(xì)菌增殖數(shù)量，并按JISZ8401的標(biāo)準(zhǔn)修約成兩位有效數(shù)字。若增長值大于1.5，則試驗有效；若增長值小于或等于1.5，則試驗結(jié)果無效。若試驗結(jié)果無效，需要重復(fù)試驗。F＝Mb－Ma……………………（6）其中，F(xiàn)：細(xì)菌增長值Mb：3個標(biāo)準(zhǔn)對照布樣品經(jīng)18h培養(yǎng)試驗后得到活菌數(shù)目的常用對數(shù)之平均值。Ma：3個標(biāo)準(zhǔn)對照布樣品在接種后立即洗脫得到活菌數(shù)目的常用對數(shù)之平均值?；钚灾档挠嬎闳粼囼炗行?，根據(jù)式（7）可得到抑菌活性值；根據(jù)式（8）可得到殺菌活性值；注意只保留2位有效數(shù)字。S＝Mb－Mc……………………（7）L＝Ma－Mc……………………（8）其中，S：抑菌活性值L：殺菌活性值Ma：3個標(biāo)準(zhǔn)對照布樣品在接種后立即洗脫得到活菌數(shù)目的常用對數(shù)之平均值。Mb：3個標(biāo)準(zhǔn)對照布樣品經(jīng)18h培養(yǎng)試驗后得到活菌數(shù)目的常用對數(shù)之平均值。Mc：3個經(jīng)抑菌除臭加工的樣品在18h培養(yǎng)試驗后得到活菌數(shù)目的常用對數(shù)之平均值。試驗結(jié)果的記錄記錄細(xì)菌名稱、保藏號、接種細(xì)菌濃度、抑菌或殺菌活性值、活菌計數(shù)方法、試驗樣品的種類等（參考下面的示例）。若在接種菌液中加入了非離子表面活性劑，要記錄其名稱和濃度。

示例1、試驗結(jié)果（抑菌活性值）試驗細(xì)菌名稱（保藏號）金黃色葡萄球菌（ATCC6538P）肺炎克雷伯氏菌（ATCC4352）細(xì)菌濃度（cfu/ml）1.2×1051.1×105細(xì)菌增長值（F）2.73.2抑菌活性值（S）2.32.5活菌計數(shù)方法平板計數(shù)法樣品的種類材料短襪100％純棉示例2、試驗結(jié)果（殺菌活性值）試驗細(xì)菌名稱（保藏號）金黃色葡萄球菌（ATCC6538P）肺炎克雷伯氏菌（ATCC4352）細(xì)菌濃度（cfu/ml）1.0×1050.9×105細(xì)菌增長值（F）2.73.1殺菌活性值（L）1.51.2活菌計數(shù)方法熒光光譜法樣品的種類材料窗簾100％聚酯接種試驗用非離子表面活性劑的種類濃度聚氧乙烯山梨醇單油酸酯0.05％10.2、菌轉(zhuǎn)印法10.2.1、試驗用樣品制備每片60mm見方的試樣，共6片標(biāo)準(zhǔn)布樣片(23)和3片抗菌加工的樣品。制作樣片時注意避免污染。注(23)：在6片標(biāo)準(zhǔn)布樣片中，3片用作轉(zhuǎn)印接種后立刻進(jìn)行活菌計數(shù)，剩下3片用作培養(yǎng)試驗后的活菌計數(shù)。10.2.2、樣片的滅菌