【課件】3.2基因工程的基本操作程序課件2021-2022學年高二下學期生物人教版選擇性必修3

3.2基因工程的基本操作程序非轉基因抗蟲棉轉基因抗蟲棉從社會中來1997年，我國政府首次批準商業(yè)化種植轉基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉基因抗蟲棉新品種100多個，減少農藥用量40萬噸，增收節(jié)支社會經濟效益450億元。你知道轉基因抗蟲棉抗蟲的機制是什么嗎？培育轉基因抗蟲棉一般需要哪些步驟？與載體拼接

普通棉花（無抗蟲特性）棉花細胞抗蟲棉

（有抗蟲特性）導入抗蟲基因重組DNA分子培育轉基因抗蟲棉的簡要過程1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達載體的構建3.將目的基因導入受體細胞4.目的基因的

檢測與鑒定從社會中來第一步：目的基因的篩選與獲取目的基因：用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因。主要是編碼蛋白質的基因△根據不同的需要，

目的基因是不同的[資料一]棉花本身不具有抗蟲基因。蘇云金桿菌有一種抗蟲基因，能

表達出抗蟲蛋白來殺死棉鈴蟲。利用基因工程將抗蟲基因導

入棉花細胞，培育出自身就能抵抗蟲害的棉花新品種。[資料二]胰島素是治療糖尿病的特效藥。健康人含有胰島素基因，能

表達胰島素，從而降低血糖濃度。大腸桿菌本身不具有胰島

素基因。1978年，科學家將編碼人胰島素的基因導入大腸桿

菌細胞中，使大腸桿菌表達重組人胰島素。什么是目的基因？第一步：目的基因的篩選與獲取

實例如生物抗逆性、優(yōu)良品質、生產藥物、毒物降解、工業(yè)用酶等相關的基因。人胰島素基因、人干擾素基因等抗蟲基因、抗病基因、抗除草劑基因等第一步：目的基因的篩選與獲取

如何篩選目的基因？蘇云金桿菌通過產生蘇云金桿菌伴孢晶體蛋白(Bt抗蟲蛋白)，破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲。蘇云金桿菌制成的生物殺蟲劑廣泛用于防治棉花蟲害。研究表明，蘇云金桿菌的殺蟲作用與Bt基因有關。Bt基因是培育轉基因抗蟲棉較為合適的目的基因科學家不僅掌握Bt基因的序列信息，也對Bt基因的表達產物——Bt抗蟲蛋白有了較為深入的了解。第一步：目的基因的篩選與獲取

相關信息Bt抗蟲蛋白會對人畜產生不良影響嗎？當Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細胞的特異性受體結合，導致細胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡。Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細胞也沒有特異性受體。因此，Bt抗蟲蛋白不會對人畜產生上述影響。蘇云金桿菌伴孢晶體蛋白目的基因的篩選：從相關的已知結構和功能清晰的基因中篩選。DNA測序儀核苷酸序列比對氨基酸序列比對序列數據庫

明確了目的基因后，該怎么獲得它?第一步：目的基因的篩選與獲取DNA合成儀在我國首批具有較高抗蟲活性的轉基因抗蟲棉的培育過程中，科學家采用的是人工合成的方法。第一步：目的基因的篩選與獲取摘要

根據蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白Cry1A(b)和Cry1A(c)的氨基酸序列，采用植物偏愛密碼子，人工合成了全長1824bp的融合GFMCry1ABt殺蟲基因，并構建了帶有多個表達調控元件的該基因高效植物表達載體pGB11214AB，以及該基因和修飾豇豆胰蛋白酶抑制劑(CpTI)基因的雙價殺蟲基因植物表達載體pGB11214ABC。經在煙草中驗證，這兩種表達載體在植物中可高效表達并賦予轉基因煙草抗蟲性。為我國抗蟲棉的研究打下了基礎。獲取目的基因Bt基因較小，序列已知DNA自動合成儀第一步：目的基因的篩選與獲取基因文庫的概念：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，成為基因文庫?；蚪M文庫一種生物的所有基因多針對原核生物部分基因組文庫一種生物的部分基因多針對真核生物基因文庫的種類：第一步：目的基因的篩選與獲取基因文庫的構建：第一步：目的基因的篩選與獲取第一步：目的基因的篩選與獲取cDNA文庫和基因組文庫的比較：文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小小大基因中啟動子無有基因中內含子無有基因多少某種基因的部分基因某種生物的全部基因物種間基因交流可以部分基因可以蘇云金桿菌Bt基因？快速獲得大量Bt基因PCR——聚合酶鏈式反應PCR是一項根據DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。利用PCR獲取和擴增目的基因第一步：目的基因的篩選與獲取提取獲取目的基因的三種方法：①人工合成獲取②從基因文庫獲?、弁ㄟ^PCR技術獲取DNA體內復制的條件第一步：目的基因的篩選與獲取DNA體內復制的條件第一步：目的基因的篩選與獲取引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。體內復制的引物為RNA單鏈。第一步：目的基因的篩選與獲取DNA體外復制（PCR）的條件第一步：目的基因的篩選與獲取解旋5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’DNA體外復制（PCR）的條件水解產生的能量為合成DNA子鏈提供能量，因此體系中不需要添加ATP。體外復制的引物一般為DNA單鏈。第一步：目的基因的篩選與獲取耐高溫的DNA聚合酶4種脫氧核苷酸引物待擴增的DNA片段5’5’變性復性延伸溫度上升到90℃以上，雙鏈DNA解聚為單鏈當溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈。第一步：目的基因的篩選與獲取思考：

PCR技術獲取目的基因時至少要經過幾次循環(huán)才能從DNA分子中分離出目的基因？5’3’5’5’第一次循環(huán)第二次循環(huán)3’5’第三次循環(huán)3’3’第一步：目的基因的篩選與獲取思考：用PCR可以擴增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴增，需要將它逆轉錄成cDNA再進行擴增。第二步：基因表達載體的構建不能。游離的DNA進入受體細胞，一般會直接被分解，即使可以轉錄翻譯成蛋白質，游離的DNA片段也無法隨著細胞分裂而進行復制，導致子代細胞中不再含有目的基因。

獲得了足量的Bt基因后，是否能直接將Bt基因導入棉花細胞呢？（核心工作）思考：各個元件有什么作用？

因此，獲取Bt基因后，還需要借助載體將其導入棉花細胞，才能使棉花植株獲得抗蟲特性。第二步：基因表達載體的構建目的基因：能控制表達所需要的特殊性狀啟動子：位置：基因的上游功能：RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA。復制原點：DNA復制的起始位點終止子：位置：基因的下游功能：終止轉錄標記基因：便于重組DNA分子的篩選。第二步：基因表達載體的構建第二步：基因表達載體的構建

如何構建抗蟲棉的基因表達載體？①

用一定的限制酶切割載體，使其出現一個切口。②

用同種限制酶或能產生相同末端的限制酶切割含有Bt基因的DNA片段。③

將切下的Bt基因片段拼接到載體的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子。第二步：基因表達載體的構建同一限制酶切割獲得的目的基因和載體混合后加DNA連接酶會出現的連接方式有（僅考慮兩兩連接）切割質粒和含目的基因的DNA片段的限制酶一般是同一種酶，也可以是不同限制酶，只要獲得能互補的末端即可。但有時可用兩種限制酶同時切割質粒和含目的基因的DNA片段，這樣可保證目的基因和質粒的定向連接，防止目的基因和質粒的自我環(huán)化。當堂練習——牛刀小試癌癥患者進行化療或放療之后，體內白細胞數量大幅度降低，可以注射粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)增加白細胞的數量。在自然條件下，此細胞因子的含量很低，很難獲得。某科研團隊將人的GM-CSF基因導入大腸桿菌，大量生產重組GM-CSF，滿足了臨床需求請問構建GM-CSF表達載體需要()①同一種限制性內切核酸酶②具有某些標記基因的質粒③RNA聚合酶④人GM-CSF基因⑤DNA連接酶⑥啟動子

⑦終止子

A.①②③④⑤⑥⑦B.①②④⑤C.②④⑥⑦D.①②④⑤⑥⑦D第三步：將目的基因導入受體細胞花粉管通道法（我國科學家獨創(chuàng)）花粉管通道法的兩種操作方式：方法一：用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中方法二：在植物授粉后一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴在花柱切面，目的基因借助花粉管通道進入胚囊。第三步：將目的基因導入受體細胞農桿菌轉化法目的基因Ti質粒表達載體農桿菌植物細胞植物細胞染色體DNA新性狀植株構建轉入導入插入表達第三步：將目的基因導入受體細胞植物細胞：目的基因導入受體細胞的方法：動物細胞：微生物細胞：花粉管通道法、農桿菌轉化法顯微注射法Ca2+處理

感受態(tài)細胞(能吸收周圍環(huán)境DNA分子的生理狀態(tài))第四步：目的基因的檢測與鑒定思考：結合基因表達的過程，推測可以從哪些方面進行檢測與鑒定？目的基因檢測示意圖第四步：目的基因的檢測與鑒定思考：結合基因表達的過程，推測可以從哪些方面進行檢測與鑒定？DNA分子雜交技術

分子雜交技術第四步：目的基因的檢測與鑒定思考：結合基因表達的過程，推測可以從哪些方面進行檢測與鑒定？抗原-抗體雜交技術第四步：目的基因的檢測與鑒定思考：結合基因表達的過程，推測可以從哪些方面進行檢測與鑒定？個體生物學水平鑒定抗蟲接種實驗采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲，觀察棉鈴蟲生存情況，以確定是否抗蟲和抗性程度。)第四步：目的基因的檢測與鑒定方法歸納：Bt基因mRNABt抗蟲蛋白抗蟲棉PCR、分子雜交技術抗原—抗體雜交技術分子水平抗蟲鑒定（個體水平）當堂練習——牛刀小試利用外源基因在受體細胞中表達，可生產人類所需要的產品。下列各項中能說明目的基因完成了在受體細胞中表達的是（

）A．番茄細胞中檢測到魚的抗凍蛋白B．大腸桿菌中檢測到人干擾素基因mRNAC．山羊乳腺細胞中檢測到人生長激素DNA序列D．酵母菌細胞中提取到人胰島素基因A課堂小結基因工程的基本操作程序：獲取質粒、噬菌體等載體篩選和獲取目的基因檢測和鑒定目的基因是否穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性將含有目的基因的表達載體導入受體細胞用限制酶切割載體和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA連接酶連接，構建基因表達載體目的基因的篩選與獲取基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞目的基因的檢測與鑒定到社會中去轉基因抗蟲棉在世界范圍內被廣泛種植，有效控制了棉鈴蟲的種群數量，顯著減少了農藥的用量。面對棉鈴蟲的危害，有了抗蟲棉是否就可以一勞永逸、高枕無憂呢？根據棉鈴蟲對傳統(tǒng)農藥產抗性的發(fā)展歷史，科研人員推測棉鈴蟲存在對抗蟲蛋白產生抗性的可能。請你查閱資料，了解以下問題。1、在實際種植過程中，棉鈴蟲是否對轉Bt基因的抗蟲棉產生了嚴重的抗性？證據是什么？2、科研工作者在沒有發(fā)現棉鈴蟲出現抗性之前，就應該想辦法應對。他們想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？到社會中去1、在實際種植過程中，棉鈴蟲是否對轉Bt基因的抗蟲棉產生了嚴重的抗性？證據是什么？科研人員對長江流域種植的轉基因抗蟲棉進行了監(jiān)測，2011年的數據顯示，大部分轉基因抗蟲棉品種的抗蟲性屬于中抗及高抗水平；2013年的數據表明，如果棉田周圍存在大量天然庇護所，靶標害蟲棉鈴蟲、紅鈴蟲等并未對轉Bt基因的抗蟲棉產生明顯抗性。在我國、澳大利亞、印度等國的多個實驗室中，通過毒素的連續(xù)抗性篩選，已經培育出多個高抗水平的轉基因抗蟲棉品種。到社會中去科研人員想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產生抗性的措施有很多，主要可以分為以下幾個方面。（1）基因策略。該策略是在分子水平上提高轉基因抗蟲棉的抗蟲性和抗蟲持久性。包括在棉花中轉入多個殺蟲基因、構建組織特異性表達的啟動子、提高殺蟲基因的表達量等。（2）田間策略。這是在種植時采取的措施，如提供庇護所、與其他作（非抗品種）輪作或套作等。（3）國家宏觀調控策略。該策略包括實施分區(qū)種植管理、加強抗性監(jiān)測、進行嚴格的安全性評價等。2、科研工作者在沒有發(fā)現棉鈴蟲出現抗性之前，就應該想辦法應對。他們想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？練習與應用八氫番茄紅素合酶（其基因用psy表示）和胡蘿卜素脫飽和酶（其基因用crtⅠ表示）參與β-胡蘿卜素的合成。pmi為磷酸甘露醇異構酶基因，它編碼的蛋白質可使細胞在特殊培養(yǎng)基上生長?？茖W家將psy和crtⅠ基因轉入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡蘿卜素，由此生產出的大米稱為“黃金大米”。請根據以上信息回答下列問題。練習與應用（1）科學家在培育“黃金大米”時，將ctrⅠ和psy基因導入含pmi基因的質粒中，構建了質粒pSYN12424。該項研究的目的基因是______________________，標記基因是________，質粒pSYN12424的作用是______________________。（2）在構建質粒載體時，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的識別序列？為什么？ctrⅠ基因和psy基因pmi基因將目的基因送入水稻細胞不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的識別序列，限制酶可能將它切斷。1、轉Bt基因抗蟲棉可以有效地用于棉鈴蟲的防治。有科學家預言，此轉基因抗蟲棉獨立種植若干代以后，也將出現不抗蟲的植株。目前，在農業(yè)生產中，大田種植轉基因抗蟲棉的同時，會間隔種植少量非轉基因的棉花或其他作物，供棉鈴蟲取食。間隔種植少量非轉基因棉花的主要目的是()

A.維持棉田物種多樣性B.減緩棉鈴蟲抗性基因頻率增加的速度C.使食蟲鳥有蟲可食D.維持棉田生態(tài)系統(tǒng)中的能量流動B練習提升2、在下列基因工程的操作中，一定不進行堿基互補配對的步驟是

（

）A．目的基因的篩選與獲取B．