ELISA基礎知識和注意事項

ELISA基礎知識和注意事項

類容ELISA的基本原理和相關概念特別說說捕獲法ELISA結果的影響因素ELISA結果的處理2/2/2023ELISA的基本原理和相關概念將抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體后，這種酶標抗原或抗體既能保留與相應抗體或抗原結合的免疫活性，又同時保留酶的活性。

由于酶具有很高的催化效率，因此可放大抗原抗體反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感性。2/2/2023ELISA的基本原理抗原或抗體在體外結合到某種固相載體表面后，仍然能保持其免疫學活性而能相互特異性結合。2/2/2023抗原抗體復合物與酶標的二抗結合，加入合適的底物在酶的作用下顯色，顏色的深淺與特異性抗體水平成比例關系，可進行定性和定量分析。

2/2/2023ELISA的分類測抗原：競爭法（也可用于測抗體）、雙抗體夾心法。測抗體：間接法、捕獲法、雙抗原夾心法2/2/2023競爭法elisa競爭法ELISA原理——標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合，標本中的抗原含量越多，結合在固相上的酶標抗原越少，顯色越淺。要用于小分子抗原或半抗原的定量測定，也可對抗體進行測定。2/2/2023

包被特異性抗體

酶標抗原檢測抗原孵育洗滌后顯色加樣AB競爭法ELISA3.顯色3.孵育1.加樣2/2/2023雙抗體夾心法雙抗體夾心法ELISA——將特異性抗體包被于固相載體表面，與標本中相應抗原相結合，洗滌后再加入酶標的第二特異性抗體與抗原結合，加入底物后顯色。檢測測抗原要有至少具有2個抗原決定簇2/2/2023包被特異性抗體雙抗體夾心法ELISA檢測抗原1.加樣2.孵育3.洗滌4.加入二抗5.孵育6.顯色酶標特異性抗體2/2/2023雙抗原夾心法雙抗原夾心法ELISA——檢測標本中的總抗體（包括IgM和IgG型抗體）。將特異性抗原包被于固相載體表面，與標本中特異性IgM和IgG型抗體結合，洗滌后加入酶標的特異性抗原與相應的抗體結合，洗滌后加入底物顯色2/2/20233.洗滌1.加樣2.孵育6.顯色5.孵育4.加入酶標抗原雙抗原夾心法ELISA2/2/2023間接法間接法

ELISA（IndirectELISA）——將特異性抗原包被于固相載體表面，與標本中相應特異性抗體結合，洗滌后再加入酶標的抗人IgG或IgM抗體與之結合，洗滌后加入底物顯色。酶標二抗是針對一類免疫球蛋白分子只需要變換包被抗原，就可用一種酶標二抗檢測各種與抗原結合的抗體2/2/20231.加樣2.孵育3.洗滌4.加入二抗5.孵育6.顯色間接法ELISA2/2/2023捕獲法ELISA（CaptureELISA）——專門用來檢測IgM型抗體的方法。將抗人IgM抗體包被于固相載體表面，與標本中所有人IgM抗體結合，洗滌后加入特異性抗原與相應的特異性IgM抗體結合，洗滌后再加入酶標的抗原特異性抗體與之結合，洗滌后加入底物顯色。2/2/20231.加樣2.孵育3.洗滌4.加入抗原孵育5.加入二抗孵育6.顯色捕獲法ELISA2/2/2023區(qū)別理解檢測抗原？抗體？包被什么？標記什么？

2/2/2023間接法和捕獲法比較間接法：假陰性，假陽性捕獲法：酶標抗體的要求較高2/2/2023間接法的假陽性麻疹IgG麻疹抗原麻疹IgM抗人酶標IgM抗體類風濕因子陽性結果假陽性結果2/2/2023間接法的假陰性麻疹IgG麻疹抗原麻疹IgM酶標抗人IgM抗體陽性結果假陰性結果2/2/2023ELISA的有關名詞概念質控血清：質控血清是為了對實驗結果進行控制而配制的血清。質控血清可以是定值也可以是不定值，可以購置也可以自配。自己配制時要注意選用無脂血的血清或血漿，不能用試劑盒內的陽性對照。若用稀釋的血清作為質控血清，應考慮稀釋基質成分對結果的影響。因質控血清與臨床標本不一致，應該注意對結果的分析，應該注意質控血清只能用于質控活動，不可用于標定儀器或評價方法。用于室內質控的質控血清一般選取CUTOFF值2-3倍的質控品。2/2/2023室內質控：實驗室內部使用控制實驗結果可靠性的一種質量控制。室間質評：用于考核各個實驗室結果可靠性的一種考核，可分為國家級和地方級的室間質評?？梢岳斫鉃椤案鱾€實驗室的質量評比”。2/2/2023臨界值（CUTOFF值）：臨界值是判斷陰陽性或有臨床意義水平的數(shù)值，臨界值的確定是測定大量數(shù)據(jù)后應用統(tǒng)計學方法確定的。許多試劑都會給出臨界值或臨界值的計算方法。本底：就是底色。如ELISAHBsAg，陽性顯色，陰性不顯色，本底就是整個陰性顯色的情況。ELISA抗–HBcAb，陽性不顯色，陰性顯色，本底就是整個陽性顯色的情況。2/2/2023靈敏度：能檢測到的分析物的最小量，表示檢測下限的能力。相對靈敏度=真陽性/（真陽性+假陰性）×100%測定方法及表示方法：靈敏度標準品、質控血清、陽性標本稀釋終點、血清盤（pannel）及臨床標本陽性率。2/2/2023特異性：真陰性標本的檢出能力。相對特異性=真陰性/（真陰性+假陽性）×100%測定及表示方法：質控血清、血清盤、臨床標本陰性率。2/2/2023Elisa結果的影響因素

試劑盒的選擇標本加樣與稀釋溫育洗版顯色質控2/2/2023試劑盒的選擇同行的試劑使用情況上級部門對試劑實際使用的綜合評價使用臨界值質控血清進行實際檢測比較,選擇林敏度和準確度高、特異性強試劑盒2/2/2023標本應注意避免溶血在5天內測定的血清標本可放置于4℃、超過一周測定的需－20℃保存盡量避免反復凍融（少量分裝）2/2/2023加樣和稀釋加樣本的準確性（個人因素和實驗條件）盡可能排除主關因素（盡可能用加樣槍，避免直接使用滴瓶）各種試劑盒標本的稀釋使用，嚴格按照說明是操作2/2/2023溫育溫度水浴箱發(fā)硬板應漂浮于水上或水面應高于反應板2/2/2023洗版

手洗洗板機（微孔液體殘留<2ul、浸泡時間>45s）2/2/2023顯色通常是A、B兩種液體，不穩(wěn)定，又顏色應立即丟棄先加A后加B，顯色時間嚴格按說明書進行終止后15內比色2/2/2023質控室內質控血清即刻法2/2/2023ELISA試劑的常見問題原因及其解決顯色淺，靈敏度低假陽性多，本底高甚至花板重復性不好白板2/2/2023顯色淺靈敏度低序號原因解決方法1試劑盒運輸時間過長，受高溫天氣影響，酶的活性降低。試劑運輸過程加放足夠冰袋并盡可能縮短運輸時間。2試劑盒（包括未用完的板條及其他組分）保藏條件不正確。試劑盒內所有組分都應當在4℃冷藏，未使用完的板條要密封保存。3試劑盒使用時已超出有效期。過期試劑盒不可以使用。4溫育時間不夠。嚴格按照說明書操作。5恒溫箱溫度達不到37℃。注意控制恒溫箱溫度，盡可能讓其穩(wěn)定在37±0.5℃。盡量避免頻繁開關恒溫箱門。經常注意水箱中合適的水位。在保證水不沒過酶標板的前提下，使水位盡量高，以保證反應溫度。2/2/20236加樣量不足；移液時抽吸排放過快，有氣泡、或吸頭內殘留液體過多。經常校正移液器。注意吸頭要與移液器吻合。移液不宜過快，排放要完全。7顯色劑加量不足，或加入順序顛倒。按照說明書要求，先加入A液、后加入B液，并保證加入量。8樣品用NaN3防腐，影響了酶的活性。不可以使用NaN3防腐。9試劑、樣品使用前未平衡至室溫。試劑、樣品從低溫保藏條件中拿出來后，要先平衡至室溫方可以使用。10試劑開啟時間過長，污染。試劑開啟后應該在盡可能短的時間內用完，在保證正確貯存的前提最長不要超過。12不同批號試劑中混用不同批號試劑不能混用2/2/2023假陽性多，本底高甚至花板序號原因解決方法1試劑過期過期試劑不能使用2加樣時污染注意更換吸頭。盡可能避免污染。3加酶時污染對先加樣后加酶的操作，加酶時要注意吸頭不要接觸標本，造成污染。當可能造成污染時，一定要更換吸頭，切忌僥幸心理。4恒溫箱溫度過高注意控制恒溫箱溫度，盡可能讓其穩(wěn)定在37±0.5℃。5整個操作時間過長、造成反應時間不同（第一孔與最后一孔反應時間相差很懸殊）。氣溫高時更明顯。在盡可能短的時間內完成操作。盡量不要堆積多塊板子操作（尤其手工操作時）。2/2/20236洗液稀釋倍數(shù)過高按照要求倍數(shù)稀釋洗液7洗板次數(shù)不夠按試劑要求，不可任意減少洗板次數(shù)8洗板時浸泡時間不夠按要求操作，并適當延長浸泡時間。9手工洗板方式不正確洗板時，垂直加入洗液，保證一定的沖擊力；洗液要注滿板孔，并保證30-60秒的浸泡時間。10洗板機調試不正確或者有故障（可通過手工洗板判定）手工洗板，并聯(lián)系儀器廠家維修。11酶被污染防止組分的污染。如使用容器，注意容器的清潔。12顯色液B液被污染13顯色完后沒有終止反應。顯色完立即終止反應。2/2/2023重復性不好1加樣量多少不一，操作時間長短不一。重復同一樣品時，加樣量與加樣時間相同；同時注意移液器的校準。加樣后應該將酶標板放置在微量振蕩器上，充分混合；標本保證一致、無污染；盡可能由同一名操作人員操作。盡可能模擬相同的反應條件。2加入標本后沒有混勻。3重復實驗的操作人員不同，操作習慣不同。4反應時間、溫度等不相同。5標本不同（被混淆或者處理不同）6精密度測定方法不標準采用正確的方法操作2/2/2023白板1忘記加酶嚴格按照說明書操作。2忘記加顯色液3酶或A、B液被污染失效防止組分被污染，注意保存。4把終止液當A液注意液體組分加樣順序。2/2/2023結果處理OD值出現(xiàn)負值陰性對照值比空白小樣本OD值和cutoff接近

2/2/2023OD值出現(xiàn)負值

波長不對，酶標儀上顯示的波長和實際的濾光片不對應溶液里有沉淀

板子臟了，如果有能沖洗的洗板機可以沖洗bottom