手足口病的實(shí)驗(yàn)診斷

手足口病的實(shí)驗(yàn)診斷手足口病的病原手足口病〔,〕由人腸道病毒感染引起。人腸道病毒為小病毒科〔〕，腸道病毒屬〔〕的一組單股正鏈病毒。其中包括埃可病毒〔31個(gè)血清型〕、柯薩奇病毒A組〔23個(gè)血清型〕和B組〔5個(gè)血清型〕，還包括3個(gè)脊髓灰質(zhì)炎病毒血清型和人腸道病毒68-71型。M.,,~30二十面體對(duì)稱無(wú)包膜人腸道病毒的毒粒構(gòu)造人腸道病毒發(fā)現(xiàn)的歷史脊髓灰質(zhì)炎病毒：1909年首次鑒定出該病毒，1949年，利用細(xì)胞培養(yǎng)的方法增殖病毒，為疫苗的研制奠定了根底?？滤_奇病毒：1948年在美國(guó)紐約鎮(zhèn)，將兩名麻痹患兒的標(biāo)本接種至乳鼠體內(nèi)，別離出來(lái)的一組病毒定名為柯薩奇病毒。根據(jù)它們?cè)谌槭笊袭a(chǎn)生的組織病理學(xué)變化和在細(xì)胞培養(yǎng)上的能力，分為柯薩奇病毒A組和B組。埃可病毒：1951年在一名無(wú)病癥的兒童的糞便標(biāo)本中別離到，在細(xì)胞培養(yǎng)上可以造成致細(xì)胞病變，但對(duì)乳鼠和靈長(zhǎng)類動(dòng)物不致病。新腸道病毒：隨后新發(fā)現(xiàn)的病毒被按照序號(hào)命名〔69~71〕，最近，已經(jīng)命名至102型腸道病毒主要血清型手足口病的常見(jiàn)致病病原多種腸道病毒都可引起，主要為：柯薩奇病毒A組的4～7、9、10、16型B組的1～3、5型?？刹《镜木植垦逍湍c道病毒71型最常見(jiàn)的為16和71腸道病毒的抵抗力腸道病毒無(wú)包膜，乙醚、75%酒精、外表活性劑等均不能將其滅活。對(duì)紫外線及枯燥敏感；各種氧化劑〔高錳酸鉀、漂白粉等〕、甲醛或56℃30都能滅活病毒病毒在4℃可存活1年，-20℃可長(zhǎng)期保持感染性病毒有感染性?！惨弧臣S便標(biāo)本采集病人發(fā)病7日內(nèi)的糞便標(biāo)本，用于病原檢測(cè)。糞便標(biāo)本采集量5～8份，采集后立即放入無(wú)菌采便管內(nèi)，4℃暫存立即(12h內(nèi))送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于－70℃冰箱?！捕衬X脊液標(biāo)本出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)病癥的病例，要采集腦脊液標(biāo)本，進(jìn)展病原和抗體檢測(cè)。采集時(shí)間為出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)病癥后3日內(nèi)，采集量為1.0～2.0。采集后立即裝入無(wú)菌帶墊圈的凍存管中，4℃暫存立即(12h內(nèi))送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于－70℃冰箱。手足口病的標(biāo)本采集手足口病的標(biāo)本采集〔三〕血清標(biāo)本采集急性期(發(fā)病0～5天)和恢復(fù)期(發(fā)病14～30天)雙份配對(duì)血清用于抗體檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，采集(發(fā)病7～20天)血。靜脈采集3～5全血，置于真空無(wú)菌采血管中，自凝后，別離血清，將血清置于－20℃以下冰箱中冷凍保存?！菜摹逞适米訕?biāo)本采集病人發(fā)病3日內(nèi)的咽拭子標(biāo)本，用于病原檢測(cè)。用專用采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，應(yīng)防止觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有3～5保存液〔細(xì)胞維持液〕的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，4℃暫存立即(12h內(nèi))送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于－70℃冰箱?！参濉嘲捳钜嚎赏瑫r(shí)采集多個(gè)皰疹作為一份標(biāo)本，用消毒針將皰疹挑破用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉簽放入內(nèi)裝有3～5保存液〔維持液或生理鹽水〕的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封。所采集標(biāo)本4℃暫存立即(12h內(nèi))送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于－70℃冰箱。手足口病的標(biāo)本采集標(biāo)本采集器械要求注射器：醫(yī)用〔5和10〕一次性注射器棉拭子：塑料桿全血收集管：10螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)血清保存管：2螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)，可耐深低溫〔液氮保存〕糞便保存管：5-20螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)，可耐深低溫〔液氮保存〕-全國(guó)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室鼻咽拭子保存管：10螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)，可耐深低溫〔液氮保存〕痰液保存管：50螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)，可耐深低溫〔液氮保存〕尸檢組織凍存管：50螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)；尸檢〔每一個(gè)樣品換手術(shù)刀〕記號(hào)筆：油性，防水標(biāo)本采集器械要求病人標(biāo)本的采集運(yùn)輸和保藏在手足口病的實(shí)驗(yàn)室診斷中，從皰疹液或腦脊液中別離病毒具有很高的診斷價(jià)值。用于采集咽拭子的無(wú)菌拭子要放在適當(dāng)?shù)谋４嬉褐?，如維持液或生理鹽水，以防枯燥。標(biāo)本采集本卷須知標(biāo)本采集本卷須知為了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和有效性，標(biāo)本應(yīng)在病例發(fā)病后盡早采集，盡快檢測(cè)。不能立即檢測(cè)的標(biāo)本應(yīng)冷凍保存。對(duì)于血清學(xué)診斷，急性期血清應(yīng)該在發(fā)病后盡早采集，恢復(fù)期血清在發(fā)病2-4周后采集。手足口病的診斷一般是通過(guò)采集適當(dāng)?shù)呐R床標(biāo)本后進(jìn)展基因檢測(cè)、抗原檢測(cè)、血清學(xué)抗體檢測(cè)、病毒別離和病鑒定手足口病的實(shí)驗(yàn)室診斷手足口病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法病毒別離抗體檢測(cè)核酸檢測(cè)蛋白/核酸芯片標(biāo)本病毒分離CPE陽(yáng)性RT-PCR及序列測(cè)定腸道病毒非腸道病毒測(cè)雙份血清中和抗體滴度RT-PCRRealtimeRT-PCR檢測(cè)病毒核酸序列測(cè)定無(wú)CPE常規(guī)實(shí)驗(yàn)補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)中和定型手足口病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)流程病毒別離培養(yǎng)用于病毒別離的標(biāo)本：包括糞便、咽拭子和皰疹液，如果患者出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)病癥，可以采集腦脊液標(biāo)本適用的細(xì)胞細(xì)胞〔人胚胎橫紋肌肉瘤細(xì)胞〕、2細(xì)胞〔人喉上皮癌細(xì)胞〕病毒別離培養(yǎng)標(biāo)本的處理3、腦脊液和皰疹液：直接接種病毒別離培養(yǎng)培養(yǎng)觀察：36℃培養(yǎng)逐日觀察，第1代培養(yǎng)見(jiàn)可疑至觀察滿7天后再繼續(xù)凍融傳代，待穩(wěn)定出現(xiàn)后,-20℃或-70℃凍存以備進(jìn)一步鑒定；如果7天之后沒(méi)有出現(xiàn)，需盲傳2代繼續(xù)觀察，盲傳2代后仍不出現(xiàn)那么判定為陰性；鑒定：中和試驗(yàn)血清抗體檢測(cè)方法中和實(shí)驗(yàn)、：?jiǎn)畏菅杭毙云冢弘p份血：急性期，恢復(fù)期陰轉(zhuǎn)陽(yáng)，四倍升高，四倍降低均可診斷近期感染病毒核酸檢測(cè)—()用于病毒的檢測(cè)，酶促催化使逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈，逆轉(zhuǎn)錄與第一次在同一系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)展，逆轉(zhuǎn)錄完成后，加熱滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，然后開(kāi)場(chǎng)擴(kuò)增。一條寡聚脫氧核苷酸引物先與雜交，然后由依賴的聚合酶催化合成相應(yīng)互補(bǔ)的拷貝，后者能進(jìn)一步用于擴(kuò)增。病毒核酸檢測(cè)—方法特點(diǎn)：快捷、簡(jiǎn)便高度靈敏、特異具有病原診斷意義高效的通用型技術(shù)平臺(tái)糞便標(biāo)本：采用氯仿進(jìn)展處理。肛拭子/咽拭子標(biāo)本：咽拭子要在標(biāo)本保存液中充分?jǐn)噭?dòng)，然后在4℃下，10000離心20。

皰疹液和腦脊液：直接用于提取。標(biāo)本的預(yù)處理可使用商業(yè)化試劑盒從臨床標(biāo)本中提取病毒簡(jiǎn)化操作、標(biāo)準(zhǔn)方法、條件一致、排除干擾〔：52904〕適合臨床標(biāo)本和病毒培養(yǎng)物標(biāo)本〔：74104〕適合組織和咽拭子標(biāo)本的提取引物人腸道病毒〔包括71、16、24v、70〕核酸檢測(cè)通用引物2〔上游〕：5`-C-3`1〔下游〕：5`--3`71核酸檢測(cè)引物序列：71〔上游〕：5`--3`71〔下游〕：5`--3`引物16核酸檢測(cè)引物序列：A16〔上游〕：5`3`A16〔下游〕；5`3`引物根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況建立各自反響體系配以下試劑主溶液：反響體系在儀上進(jìn)展反響，反響步驟如下：42℃························4595℃························395℃························20s50℃························25s×32個(gè)循環(huán)72℃························30s72℃························104℃························溫度循環(huán)參數(shù)通過(guò)比較標(biāo)本的產(chǎn)物與陽(yáng)性對(duì)照的產(chǎn)物在凝膠上的位置以及大小來(lái)解釋結(jié)果。結(jié)果解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果解釋實(shí)驗(yàn)室診斷原那么人腸道病毒在自然界廣泛存在且種類繁多，一病多原、一原多癥是腸道病毒感染的重要特征。因而應(yīng)對(duì)血清診斷及病原診斷的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果作嚴(yán)格評(píng)價(jià)，必須結(jié)合臨床病癥及環(huán)境因素流行病學(xué)分析，以確立病毒與疾病的病原學(xué)關(guān)系。一般采取的原那么為：〔1〕病毒別離陽(yáng)性率遠(yuǎn)高于對(duì)照人群；〔2〕病程中有特異性抗體變化并排除其他病毒感染；〔3〕從病變組織中別離出病毒。從疑為腸道病毒感染的腦炎/腦膜炎患者的腦脊液中檢測(cè)到相應(yīng)的腸道病毒核酸〔法〕，或別離到病毒或腸道病毒陽(yáng)性，即可證明是該腸道病毒引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染。從疑為死于71〔或其它腸道病毒〕的尸檢標(biāo)本中檢測(cè)到相應(yīng)的腸道病毒核酸，或別離到病毒或腸道病毒陽(yáng)性，即可證明是該腸道病毒是病因。從患者的皰疹液中檢測(cè)到相應(yīng)的腸道病毒核酸，或別離到病毒，那么該病毒就是病因病原。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的診斷意義實(shí)驗(yàn)結(jié)果的診斷意義當(dāng)無(wú)法進(jìn)展病毒別離或未別離到病毒時(shí)，血清學(xué)診斷方法可以作為病毒感染的間接證據(jù)。腸道病毒有時(shí)引起無(wú)病癥感染，只從個(gè)別患者糞便標(biāo)本中別離到71〔或其它腸道病毒〕時(shí)，不能輕易下結(jié)論71是病因，應(yīng)該擴(kuò)大樣本量，所以實(shí)驗(yàn)結(jié)果的實(shí)際意義應(yīng)結(jié)合臨床過(guò)程和流行病學(xué)資料進(jìn)展解釋。手足口病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室相關(guān)問(wèn)題1、實(shí)驗(yàn)室生物平安問(wèn)題：必須重視的問(wèn)題實(shí)驗(yàn)人員受過(guò)生物平安培訓(xùn)①有防范潛在生物危害的意識(shí)②熟悉生物平安規(guī)程，掌握生物平安技能實(shí)驗(yàn)室自己的生物平安指南合格的生物平安實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室文件化的規(guī)程及方法〔包括常規(guī)的和特殊的〕2、實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制問(wèn)題：保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠的必要手段實(shí)驗(yàn)對(duì)照：陽(yáng)性、陰性、試劑、空白對(duì)照控制實(shí)驗(yàn)室核酸污染⑴試劑污染⑵器械污染⑶實(shí)驗(yàn)過(guò)程