基因治療醫(yī)學(xué)PPT

基因治療醫(yī)學(xué)PPT基因療法是指將外源正常基因?qū)氚屑?xì)胞，通過(guò)替代異?；?、封閉致病基因、剪去致病基因、修復(fù)受損基因和重建基因調(diào)控系統(tǒng)等，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常所引起的疾病，從而達(dá)到治療的目的

2021/4/272全世界已獲準(zhǔn)的基因治療臨床試驗(yàn)方案達(dá)一千多項(xiàng)，其中，66%是針對(duì)癌癥的治療

2021/4/273二、基因治療的必要條件發(fā)病機(jī)制在DNA水平上已經(jīng)清楚要轉(zhuǎn)移的基因已經(jīng)克隆分離，其表達(dá)產(chǎn)物有詳盡的了解該基因正常表達(dá)的組織可在體外進(jìn)行遺傳操作2021/4/274三.基因治療方式直接基因治療和間接基因治療1、直接基因治療(致病基因的原位置換)：糾正突變基因

在原位修復(fù)缺陷的基因，以達(dá)到治療目的。為較理想的基因治療策略，由于存在某些問(wèn)題，目前正在努力之中。（未實(shí)現(xiàn)）2021/4/275基因敲出技術(shù)（geneknockout)是指通過(guò)基因同源重組的過(guò)程定向的在活細(xì)胞中從基因組上移出特定基因的過(guò)程，從而建立基因剔除細(xì)胞和基因剔除生物2021/4/276

2、間接基因治療：

導(dǎo)入外源正?；?，代替有缺陷的基因。而對(duì)靶細(xì)胞而言，沒(méi)有去除或修復(fù)有缺陷的基因。直接抑制有害基因的表達(dá)2021/4/277基因增補(bǔ)：將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，不需將缺陷基因替換出來(lái)，只要目的基因在細(xì)胞中能夠表達(dá)，就達(dá)到了治療的目的。這是目前基因治療大多采用的方法，對(duì)單拷貝基因遺傳病有效。如血友病。2021/4/278基因干預(yù)(geneinterference)：指采用特定的方式抑制某個(gè)基因的表達(dá)，或者通過(guò)破壞某個(gè)基因而使之不表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。基因干預(yù)2021/4/279基因干預(yù)的種類(lèi)：反義RNA：封閉基因表達(dá)核酶：裂解特異的靶mRNARNA干涉技術(shù)：

2021/4/2710反義RNA(antisenseRNA):是指與mRNA互補(bǔ)的RNA分子,通常由15-20個(gè)核苷酸組成。這種反義RNA能與mRNA分子特異性地互補(bǔ)結(jié)合形成二聚體,從而阻止靶核酸的表達(dá)。兩種機(jī)制:1.反義寡聚核苷酸可以激活RNaseH，該酶可以切割DNA·RNA雜合分子中的RNA鏈，導(dǎo)致靶mRNA降解2.反義寡聚核苷酸可以通過(guò)空間位阻效應(yīng)阻止核糖體結(jié)合來(lái)抑制靶mRNA的翻譯2021/4/27112021/4/2712靶RNA上的結(jié)合位點(diǎn)必須是暴露的反義試劑必須被保護(hù)起來(lái)免遭核酸酶攻擊必須保證反義試劑能夠被細(xì)胞攝取并在胞內(nèi)正確定位需克服技術(shù)問(wèn)題:2021/4/27132001，2002連續(xù)兩年被美國(guó)《Science》雜志評(píng)選為年度10大突破技術(shù)RNA干涉RNA干涉（RNAinterference，RNAi）是一種由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。在此過(guò)程中，與雙鏈RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，從而抑制該基因的表達(dá)。2021/4/2714

2006年10月2日，現(xiàn)年47歲的AndrewZ.Fire和45歲的CraigC.Mello由于在基因沉默現(xiàn)象研究領(lǐng)域的杰出貢獻(xiàn)而獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

2021/4/2715RNA干涉機(jī)制:

外源dsRNA

進(jìn)入細(xì)胞后可激活Dicer(多種核酸酶、解螺旋酶、RNA依賴(lài)的RNA聚合酶）,可以切割雙鏈RNA，雙鏈RNA再與Dicer形成沉默復(fù)合物(RISC)，RISC具有結(jié)合和切割mRNA的作用而介導(dǎo)RNA干涉的過(guò)程。

2021/4/27162個(gè)步驟：（1）長(zhǎng)雙鏈RNA被細(xì)胞源性的雙鏈RNA特異的核酸酶(Dicer)切成21-23個(gè)堿基對(duì)的短雙鏈RNA，稱(chēng)為小干擾性RNA（smallinterferingRNA）（2）小干擾性RNA與細(xì)胞源性的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，稱(chēng)為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC），該復(fù)合體可識(shí)別與小干擾性RNA有同源序列的mRNA，并在特異的位點(diǎn)將該mRNA切斷2021/4/2717RNA干涉機(jī)制2021/4/27182021/4/27192021/4/2720目前RNA干擾技術(shù)主要應(yīng)用于探查基因功能和探索治療腫瘤或感染性疾病的可能性.初步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示RNA干擾技術(shù)可用于治療有異常基因的人腫瘤。用RNA干擾技術(shù)可以阻礙K-RAS蛋白的表達(dá)從而抑制腫瘤發(fā)生，或殺死有bcr/ab1的人白血病細(xì)胞系。通過(guò)RNA干擾抑制某些內(nèi)源性基因的表達(dá)能促進(jìn)白血病細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡或增加其對(duì)化療藥物的反應(yīng)性。2021/4/2721將RNA干擾技術(shù)用于臨床治療人類(lèi)疾病還有許多研究工作要做，如何將小干擾性RNA或能在細(xì)胞內(nèi)生成小干擾性RNA樣轉(zhuǎn)錄物的質(zhì)粒DNA或病毒載體安全、有效地導(dǎo)入靶組織或靶細(xì)胞就是一個(gè)必須解決的問(wèn)題。RNA干擾技術(shù)用于治療人類(lèi)疾病的安全性仍是個(gè)未知數(shù)。2021/4/2722四、基因治療的基本程序

目的基因的選擇與獲得載體的選擇將目的基因克隆到載體基因表達(dá)的檢測(cè)治療效果的體外研究建立動(dòng)物模型治療效果的體內(nèi)研究藥代及藥理毒理研究中試研究申報(bào)及進(jìn)行臨床試驗(yàn)擴(kuò)大規(guī)模進(jìn)行試生產(chǎn)2021/4/2723(一)、目的基因的選擇：你感興趣的任何與疾病相關(guān)的基因2021/4/27241.能改變腫瘤細(xì)胞的惡性表型的基因

腫瘤細(xì)胞主要有癌基因的突變、擴(kuò)增、過(guò)度表達(dá)，對(duì)此可采用反義核酸或核酶；抑癌基因的突變、失活等，可采用野生型的正?；蜃鳛橹委熁?，用正?；蛱蕹蛱鎿Q缺陷基因。

2021/4/27252.能提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性的基因

向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)參與細(xì)胞免疫的細(xì)胞因子（如IL-2、GM-CSF）基因，共刺激分子B7基因等，以增強(qiáng)宿主的抗癌免疫反應(yīng)，可統(tǒng)稱(chēng)為免疫基因治療。

2021/4/27263.腫瘤藥物增敏基因

腫瘤藥物敏感基因治療是將編碼某一敏感性因子的基因轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞，使腫瘤細(xì)胞對(duì)某種原本無(wú)毒或低毒的藥物產(chǎn)生特異的敏感性而死亡。這一表達(dá)敏感性因子的基因也被稱(chēng)為自殺基因.常用的自殺基因有單純皰疹病毒胸苷激酶（HSK-TK）基因

,該基因能將無(wú)細(xì)胞毒性的原藥丙氧鳥(niǎo)苷（GCV）磷酸化，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用2021/4/2727理想的治療基因還必須：基因可有效導(dǎo)入靶細(xì)胞基因能在靶細(xì)胞中長(zhǎng)期穩(wěn)定存留導(dǎo)入基因能適量表達(dá)導(dǎo)入基因的方法及載體對(duì)宿主細(xì)胞安全無(wú)害2021/4/2728(二)基因載體的選擇

有病毒載體有非病毒體兩類(lèi)，多用病毒載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒載體。2021/4/2729常用病毒載體的比較

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體腺病毒載體腺相關(guān)病毒載體載體大小8.5kb36kb(大)5kb(小)核酸類(lèi)型RNADNADNA外源基因容量＜7kb2～7kb＜3.5kb(小)靶細(xì)胞要求分裂細(xì)胞；

表面須有特殊受體分裂或非分裂細(xì)胞分裂或非分裂細(xì)胞基因整合隨機(jī)整合不整合定點(diǎn)整合于19號(hào)染色體長(zhǎng)臂外源基因表達(dá)情況瞬時(shí)表達(dá)/穩(wěn)定表達(dá)瞬時(shí)表達(dá)穩(wěn)定表達(dá)基因轉(zhuǎn)染效率高高不明2021/4/2730(三)選擇基因治療的靶細(xì)胞體細(xì)胞：目前基因治療的現(xiàn)狀僅限于體細(xì)胞?；蛐偷母淖冎幌抻诨颊弑救?，不會(huì)遺傳到下代。生殖細(xì)胞：理論上這是基因治療的重點(diǎn)，對(duì)生殖細(xì)胞中缺陷基因的糾正，不僅使患者本人（當(dāng)代）的缺陷得以更正，而且能將正?；蜻z傳到下代，是一種徹底根治缺陷的方法。但是由于風(fēng)險(xiǎn)大，問(wèn)題復(fù)雜，至今仍未有人敢實(shí)驗(yàn)。2021/4/27311、發(fā)病的器官及位置2、容易取出和植入3、容易在體外培養(yǎng)4、容易被轉(zhuǎn)導(dǎo)5、壽命較長(zhǎng)基因治療中體細(xì)胞的選擇2021/4/2732免疫細(xì)胞

外周血淋巴細(xì)胞是惡性腫瘤、獲得性及遺傳性免疫系統(tǒng)紊亂性徉病的基因治療的主要靶細(xì)胞。主要以T淋巴細(xì)胞為主成纖維細(xì)胞

成纖維細(xì)胞位于全身并具有較強(qiáng)的自我更新能力。優(yōu)點(diǎn)有：①易于獲得；②容易體外培養(yǎng)和擴(kuò)增；③分裂中的成纖維細(xì)胞易與逆轉(zhuǎn)錄病毒一起穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)，并能較穩(wěn)定的表達(dá)外源目的基因；④攜帶外源基因后能穩(wěn)定地回植體內(nèi)并進(jìn)行表達(dá)；⑤回植的成纖維細(xì)胞容易取出，等。主要缺點(diǎn)是在體內(nèi)由于細(xì)胞凋亡而引起的基因表達(dá)失活。2021/4/2733骨骼肌細(xì)胞

易于獲得及在體個(gè)可大量擴(kuò)增，可用于治療累及肌肉的遺傳病及一旦插入分泌性基因可使基因產(chǎn)物直接分泌進(jìn)入血液等。

血管平滑肌細(xì)胞

血管平滑肌細(xì)胞易于獲得、培養(yǎng)和移植，故是基因治療常用的靶細(xì)胞。造血干細(xì)胞

造血干細(xì)胞是基因治療遺傳病、自身免疫性疾病及癌癥常用的靶細(xì)胞。在腫瘤基因治療中，造血干細(xì)胞是耐藥基因、細(xì)胞因子基因等較理想的受體細(xì)胞。

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(四)基因轉(zhuǎn)移

應(yīng)用物理、化學(xué)或生物學(xué)等技術(shù)和方法將外源目的基因（可以是基因的DNA片段或序列）轉(zhuǎn)移到受體菌或者細(xì)胞內(nèi)，并在細(xì)菌或細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)入基因的擴(kuò)增和表達(dá)，稱(chēng)為基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。2021/4/27351、非病毒導(dǎo)入法：直接注射法、電穿孔法、脂質(zhì)體法、陽(yáng)離子多聚體2、病毒載體導(dǎo)入法2021/4/2736遺傳病的基因治療研究1990.9.14首例基因治療4歲女孩嚴(yán)重免疫缺陷癥(SCID)缺乏腺苷酸脫氨酶(ADA)2--脫氧腺苷含量升高毒性嚴(yán)重破壞免疫功能ADA基因LN逆轉(zhuǎn)錄病毒載體靶細(xì)胞為病人淋巴細(xì)胞回輸五、基因治療的臨床應(yīng)用2021/4/2737腺苷脫氨酶缺乏癥adenosinedeaminasedeficiency(ADA)2021/4/27382021/4/2739㈠修正腫瘤相關(guān)基因的功能糾正癌基因的表達(dá)恢復(fù)抑癌基因的功能㈡導(dǎo)入特定的基因產(chǎn)生腫瘤特異的藥物敏感性自殺基因療法HSV-tk

P53基因

腫瘤的基因治療2021/4/27402021/4/2741六.基因治療的問(wèn)題與前景

基因治療是一門(mén)新興學(xué)科，研究歷史較短，無(wú)論從技術(shù)上還是倫理學(xué)上都涉及到許多新概念、新問(wèn)題和新挑戰(zhàn)，其安全性一直以來(lái)都是爭(zhēng)論最為激烈的問(wèn)題之一，其治療效果也還差強(qiáng)人意；但基因治療有巨大的潛力和廣闊的前景2021/4/2742在這當(dāng)中，其中最具有挑戰(zhàn)性的問(wèn)題是運(yùn)送治療基因的載體系統(tǒng)，2000年時(shí)，賓州大學(xué)有病人在基因治療中死亡，2002年在法國(guó)又發(fā)生先天免疫不全癥bubbleboys基因治療臨床試驗(yàn)發(fā)生白血病的副作用。這兩件失敗的案例，皆被歸因于病毒載體的不安全性.理想載體應(yīng)具備下列條件：安全無(wú)毒害；不引起免疫反應(yīng)；高濃度或高滴度；能高效轉(zhuǎn)移外源基因,持續(xù)有效表達(dá)外源基因；可靶向特定組織細(xì)胞；可調(diào)控；容納外源基因可大可??；可供體內(nèi)注射（包括全身性靜脈注射）；便于規(guī)模生產(chǎn)供臨床應(yīng)用，可惜目前所應(yīng)用的載體尚沒(méi)有一個(gè)能符合上述全部的條件。這是今后努力研究的方向。

2021/4/2743從理論上來(lái)說(shuō)基因治療是治療癌癥的最好辦法，但由于其是新生事物，有些問(wèn)題仍在探索之中，例如如何將病毒給到腫瘤的局部腫塊部位，產(chǎn)生高濃度病毒攻擊腫瘤細(xì)胞？每次要注入多少劑量的病毒？隔多長(zhǎng)時(shí)間注入一次