基因治療醫(yī)學PPT

基因治療醫(yī)學PPT基因療法是指將外源正常基因?qū)氚屑毎?，通過替代異常基因、封閉致病基因、剪去致病基因、修復受損基因和重建基因調(diào)控系統(tǒng)等，以糾正或補償因基因缺陷和異常所引起的疾病，從而達到治療的目的

2021/4/272全世界已獲準的基因治療臨床試驗方案達一千多項，其中，66%是針對癌癥的治療

2021/4/273二、基因治療的必要條件發(fā)病機制在DNA水平上已經(jīng)清楚要轉(zhuǎn)移的基因已經(jīng)克隆分離，其表達產(chǎn)物有詳盡的了解該基因正常表達的組織可在體外進行遺傳操作2021/4/274三.基因治療方式直接基因治療和間接基因治療1、直接基因治療(致病基因的原位置換)：糾正突變基因

在原位修復缺陷的基因，以達到治療目的。為較理想的基因治療策略，由于存在某些問題，目前正在努力之中。（未實現(xiàn)）2021/4/275基因敲出技術(shù)（geneknockout)是指通過基因同源重組的過程定向的在活細胞中從基因組上移出特定基因的過程，從而建立基因剔除細胞和基因剔除生物2021/4/276

2、間接基因治療：

導入外源正常基因，代替有缺陷的基因。而對靶細胞而言，沒有去除或修復有缺陷的基因。直接抑制有害基因的表達2021/4/277基因增補：將目的基因?qū)氩∽兗毎?，并在細胞?nèi)表達，不需將缺陷基因替換出來，只要目的基因在細胞中能夠表達，就達到了治療的目的。這是目前基因治療大多采用的方法，對單拷貝基因遺傳病有效。如血友病。2021/4/278基因干預(geneinterference)：指采用特定的方式抑制某個基因的表達，或者通過破壞某個基因而使之不表達，以達到治療疾病的目的。基因干預2021/4/279基因干預的種類：反義RNA：封閉基因表達核酶：裂解特異的靶mRNARNA干涉技術(shù)：

2021/4/2710反義RNA(antisenseRNA):是指與mRNA互補的RNA分子,通常由15-20個核苷酸組成。這種反義RNA能與mRNA分子特異性地互補結(jié)合形成二聚體,從而阻止靶核酸的表達。兩種機制:1.反義寡聚核苷酸可以激活RNaseH，該酶可以切割DNA·RNA雜合分子中的RNA鏈，導致靶mRNA降解2.反義寡聚核苷酸可以通過空間位阻效應阻止核糖體結(jié)合來抑制靶mRNA的翻譯2021/4/27112021/4/2712靶RNA上的結(jié)合位點必須是暴露的反義試劑必須被保護起來免遭核酸酶攻擊必須保證反義試劑能夠被細胞攝取并在胞內(nèi)正確定位需克服技術(shù)問題:2021/4/27132001，2002連續(xù)兩年被美國《Science》雜志評選為年度10大突破技術(shù)RNA干涉RNA干涉（RNAinterference，RNAi）是一種由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，從而抑制該基因的表達。2021/4/2714

2006年10月2日，現(xiàn)年47歲的AndrewZ.Fire和45歲的CraigC.Mello由于在基因沉默現(xiàn)象研究領(lǐng)域的杰出貢獻而獲得諾貝爾醫(yī)學獎。

2021/4/2715RNA干涉機制:

外源dsRNA

進入細胞后可激活Dicer(多種核酸酶、解螺旋酶、RNA依賴的RNA聚合酶）,可以切割雙鏈RNA，雙鏈RNA再與Dicer形成沉默復合物(RISC)，RISC具有結(jié)合和切割mRNA的作用而介導RNA干涉的過程。

2021/4/27162個步驟：（1）長雙鏈RNA被細胞源性的雙鏈RNA特異的核酸酶(Dicer)切成21-23個堿基對的短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA（smallinterferingRNA）（2）小干擾性RNA與細胞源性的某些酶和蛋白質(zhì)形成復合體，稱為RNA誘導的沉默復合體（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC），該復合體可識別與小干擾性RNA有同源序列的mRNA，并在特異的位點將該mRNA切斷2021/4/2717RNA干涉機制2021/4/27182021/4/27192021/4/2720目前RNA干擾技術(shù)主要應用于探查基因功能和探索治療腫瘤或感染性疾病的可能性.初步的實驗結(jié)果提示RNA干擾技術(shù)可用于治療有異?；虻娜四[瘤。用RNA干擾技術(shù)可以阻礙K-RAS蛋白的表達從而抑制腫瘤發(fā)生，或殺死有bcr/ab1的人白血病細胞系。通過RNA干擾抑制某些內(nèi)源性基因的表達能促進白血病細胞系的細胞凋亡或增加其對化療藥物的反應性。2021/4/2721將RNA干擾技術(shù)用于臨床治療人類疾病還有許多研究工作要做，如何將小干擾性RNA或能在細胞內(nèi)生成小干擾性RNA樣轉(zhuǎn)錄物的質(zhì)粒DNA或病毒載體安全、有效地導入靶組織或靶細胞就是一個必須解決的問題。RNA干擾技術(shù)用于治療人類疾病的安全性仍是個未知數(shù)。2021/4/2722四、基因治療的基本程序

目的基因的選擇與獲得載體的選擇將目的基因克隆到載體基因表達的檢測治療效果的體外研究建立動物模型治療效果的體內(nèi)研究藥代及藥理毒理研究中試研究申報及進行臨床試驗擴大規(guī)模進行試生產(chǎn)2021/4/2723(一)、目的基因的選擇：你感興趣的任何與疾病相關(guān)的基因2021/4/27241.能改變腫瘤細胞的惡性表型的基因

腫瘤細胞主要有癌基因的突變、擴增、過度表達，對此可采用反義核酸或核酶；抑癌基因的突變、失活等，可采用野生型的正?；蜃鳛橹委熁颍谜；蛱蕹蛱鎿Q缺陷基因。

2021/4/27252.能提高腫瘤細胞的免疫原性的基因

向腫瘤細胞轉(zhuǎn)導參與細胞免疫的細胞因子（如IL-2、GM-CSF）基因，共刺激分子B7基因等，以增強宿主的抗癌免疫反應，可統(tǒng)稱為免疫基因治療。

2021/4/27263.腫瘤藥物增敏基因

腫瘤藥物敏感基因治療是將編碼某一敏感性因子的基因轉(zhuǎn)入腫瘤細胞，使腫瘤細胞對某種原本無毒或低毒的藥物產(chǎn)生特異的敏感性而死亡。這一表達敏感性因子的基因也被稱為自殺基因.常用的自殺基因有單純皰疹病毒胸苷激酶（HSK-TK）基因

,該基因能將無細胞毒性的原藥丙氧鳥苷（GCV）磷酸化，對細胞產(chǎn)生毒性作用2021/4/2727理想的治療基因還必須：基因可有效導入靶細胞基因能在靶細胞中長期穩(wěn)定存留導入基因能適量表達導入基因的方法及載體對宿主細胞安全無害2021/4/2728(二)基因載體的選擇

有病毒載體有非病毒體兩類，多用病毒載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒載體。2021/4/2729常用病毒載體的比較

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體腺病毒載體腺相關(guān)病毒載體載體大小8.5kb36kb(大)5kb(小)核酸類型RNADNADNA外源基因容量＜7kb2～7kb＜3.5kb(小)靶細胞要求分裂細胞；

表面須有特殊受體分裂或非分裂細胞分裂或非分裂細胞基因整合隨機整合不整合定點整合于19號染色體長臂外源基因表達情況瞬時表達/穩(wěn)定表達瞬時表達穩(wěn)定表達基因轉(zhuǎn)染效率高高不明2021/4/2730(三)選擇基因治療的靶細胞體細胞：目前基因治療的現(xiàn)狀僅限于體細胞。基因型的改變只限于患者本人，不會遺傳到下代。生殖細胞：理論上這是基因治療的重點，對生殖細胞中缺陷基因的糾正，不僅使患者本人（當代）的缺陷得以更正，而且能將正常基因遺傳到下代，是一種徹底根治缺陷的方法。但是由于風險大，問題復雜，至今仍未有人敢實驗。2021/4/27311、發(fā)病的器官及位置2、容易取出和植入3、容易在體外培養(yǎng)4、容易被轉(zhuǎn)導5、壽命較長基因治療中體細胞的選擇2021/4/2732免疫細胞

外周血淋巴細胞是惡性腫瘤、獲得性及遺傳性免疫系統(tǒng)紊亂性徉病的基因治療的主要靶細胞。主要以T淋巴細胞為主成纖維細胞

成纖維細胞位于全身并具有較強的自我更新能力。優(yōu)點有：①易于獲得；②容易體外培養(yǎng)和擴增；③分裂中的成纖維細胞易與逆轉(zhuǎn)錄病毒一起穩(wěn)定轉(zhuǎn)導，并能較穩(wěn)定的表達外源目的基因；④攜帶外源基因后能穩(wěn)定地回植體內(nèi)并進行表達；⑤回植的成纖維細胞容易取出，等。主要缺點是在體內(nèi)由于細胞凋亡而引起的基因表達失活。2021/4/2733骨骼肌細胞

易于獲得及在體個可大量擴增，可用于治療累及肌肉的遺傳病及一旦插入分泌性基因可使基因產(chǎn)物直接分泌進入血液等。

血管平滑肌細胞

血管平滑肌細胞易于獲得、培養(yǎng)和移植，故是基因治療常用的靶細胞。造血干細胞

造血干細胞是基因治療遺傳病、自身免疫性疾病及癌癥常用的靶細胞。在腫瘤基因治療中，造血干細胞是耐藥基因、細胞因子基因等較理想的受體細胞。

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(四)基因轉(zhuǎn)移

應用物理、化學或生物學等技術(shù)和方法將外源目的基因（可以是基因的DNA片段或序列）轉(zhuǎn)移到受體菌或者細胞內(nèi)，并在細菌或細胞內(nèi)實現(xiàn)轉(zhuǎn)入基因的擴增和表達，稱為基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。2021/4/27351、非病毒導入法：直接注射法、電穿孔法、脂質(zhì)體法、陽離子多聚體2、病毒載體導入法2021/4/2736遺傳病的基因治療研究1990.9.14首例基因治療4歲女孩嚴重免疫缺陷癥(SCID)缺乏腺苷酸脫氨酶(ADA)2--脫氧腺苷含量升高毒性嚴重破壞免疫功能ADA基因LN逆轉(zhuǎn)錄病毒載體靶細胞為病人淋巴細胞回輸五、基因治療的臨床應用2021/4/2737腺苷脫氨酶缺乏癥adenosinedeaminasedeficiency(ADA)2021/4/27382021/4/2739㈠修正腫瘤相關(guān)基因的功能糾正癌基因的表達恢復抑癌基因的功能㈡導入特定的基因產(chǎn)生腫瘤特異的藥物敏感性自殺基因療法HSV-tk

P53基因

腫瘤的基因治療2021/4/27402021/4/2741六.基因治療的問題與前景

基因治療是一門新興學科，研究歷史較短，無論從技術(shù)上還是倫理學上都涉及到許多新概念、新問題和新挑戰(zhàn)，其安全性一直以來都是爭論最為激烈的問題之一，其治療效果也還差強人意；但基因治療有巨大的潛力和廣闊的前景2021/4/2742在這當中，其中最具有挑戰(zhàn)性的問題是運送治療基因的載體系統(tǒng)，2000年時，賓州大學有病人在基因治療中死亡，2002年在法國又發(fā)生先天免疫不全癥bubbleboys基因治療臨床試驗發(fā)生白血病的副作用。這兩件失敗的案例，皆被歸因于病毒載體的不安全性.理想載體應具備下列條件：安全無毒害；不引起免疫反應；高濃度或高滴度；能高效轉(zhuǎn)移外源基因,持續(xù)有效表達外源基因；可靶向特定組織細胞；可調(diào)控；容納外源基因可大可?。豢晒w內(nèi)注射（包括全身性靜脈注射）；便于規(guī)模生產(chǎn)供臨床應用，可惜目前所應用的載體尚沒有一個能符合上述全部的條件。這是今后努力研究的方向。

2021/4/2743從理論上來說基因治療是治療癌癥的最好辦法，但由于其是新生事物，有些問題仍在探索之中，例如如何將病毒給到腫瘤的局部腫塊部位，產(chǎn)生高濃度病毒攻擊腫瘤細胞？每次要注入多少劑量的病毒？隔多長時間注入一次