第1章基因工程

基因工程概論

參考教材

1.基因與基因工程的定義2.基因工程的理論基礎(chǔ)3.基因工程的技術(shù)基礎(chǔ)及誕生4.基因工程技術(shù)的發(fā)展5.基因工程的研究?jī)?nèi)容6.基因工程的應(yīng)用和面臨問(wèn)題主要內(nèi)容第一章導(dǎo)論1.基因與基因工程的定義★

基因：核酸分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列，是遺傳物質(zhì)的最小功能單位。

按照是否能轉(zhuǎn)錄、翻譯分類：

轉(zhuǎn)錄、翻譯蛋白質(zhì)

轉(zhuǎn)錄、不翻譯反義RNA等

不轉(zhuǎn)錄、不翻譯調(diào)控序列如：操縱基因

孟德?tīng)枺荷锩恳粋€(gè)性狀都是通過(guò)遺傳因子來(lái)傳遞的，遺傳因子是一些獨(dú)立的遺傳單位。1940s：“一個(gè)基因一種酶”的假說(shuō)，認(rèn)為基因?qū)π誀畹目刂剖峭ㄟ^(guò)基因控制酶的合成來(lái)實(shí)現(xiàn)的。（多個(gè)基因一個(gè)酶，一個(gè)基因多個(gè)酶）RNA基因的發(fā)現(xiàn)：

ribozymes,

microRNA等；RNA基因組的發(fā)現(xiàn)

Amodernworkingdefinitionofageneis"a

locatableregion

of

genomic

sequence,correspondingtoaunitofinheritance,whichisassociatedwithregulatoryregions,transcribedregions,andorotherfunctionalsequenceregions

基因工程：在體外對(duì)不同生物的遺傳物質(zhì)（基因）進(jìn)行剪切、重組、連接，然后插入到載體分子中（細(xì)菌質(zhì)粒、病毒或噬菌體DNA)，轉(zhuǎn)入微生物、植物或動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行無(wú)性繁殖，并使之行使正常功能和穩(wěn)定遺傳，從而構(gòu)建出新的物種或菌株的遺傳學(xué)技術(shù)。

按照工程學(xué)的方法設(shè)計(jì)和操作DNA，形成新的組合，并能引入新的宿主中行使功能，克服了基因信息在生物物種之間的固有限制。Geneticengineeringaltersthegeneticmakeupofanorganismusingtechniquesthatremove

heritable

materialorthatintroduceDNApreparedoutsidetheorganismeitherdirectlyintothehostorintoacellthatisthen

fused

orhybridized

withthehost.

1.基因與基因工程的定義2.基因工程的理論基礎(chǔ)3.基因工程的技術(shù)基礎(chǔ)及誕生4.基因工程技術(shù)的發(fā)展5.基因工程的研究?jī)?nèi)容6.基因工程的應(yīng)用和面臨問(wèn)題主要內(nèi)容2.基因操作技術(shù)建立的理論基礎(chǔ)理論基礎(chǔ)（19世紀(jì)后期到20世紀(jì)50s初）2.1確定了蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要基礎(chǔ)物質(zhì)2.2確定了生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA

1952年Hershey和Chase利用同位素標(biāo)記的噬菌體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，傳遞遺傳信息的是DNA而不是蛋白質(zhì)。赫爾希也由于這一研究而榮獲1969年的諾貝爾醫(yī)學(xué)生理學(xué)獎(jiǎng)。1944年，Avery等人發(fā)表了"脫氧核糖型的核酸是III型肺炎球菌轉(zhuǎn)化要素的基本單位“,即DNA是細(xì)菌的轉(zhuǎn)化因子，第一次證明了DNA是遺傳物質(zhì)。肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)噬菌體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)★肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1928年,Griffith設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)：

光滑型菌株注入小鼠體內(nèi)：死亡粗糙型菌株注入小鼠體內(nèi)：無(wú)害光滑型菌株加熱殺死后，再注入小鼠體內(nèi)：無(wú)害殺死的光滑型菌株與粗糙型菌株一起注入小鼠體內(nèi)：死亡說(shuō)明被殺死的光滑型菌株含有某種因子，它進(jìn)入了粗糙型菌株中將它轉(zhuǎn)化成了致死的光滑型菌株，但沒(méi)有證明這種因子是什么物質(zhì)。

1934年，Avery實(shí)驗(yàn)從加熱殺死的光滑型菌株中提取DNA，然后將除去了蛋白質(zhì)的DNA與粗糙型菌株混合后，再注入小鼠體內(nèi)：死亡。說(shuō)明帶有有毒性的和能使莢膜形成的信息分子DNA整合進(jìn)了無(wú)毒菌株的染色體里，使它轉(zhuǎn)化成了有毒的菌株。實(shí)驗(yàn)證明了Griffith所說(shuō)的轉(zhuǎn)化因子就是DNA。理論基礎(chǔ)（20世紀(jì)50s初～60s）2.3DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的建立

1953年，Watson和Crick在《自然》雜志上發(fā)表DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的論文，并發(fā)現(xiàn)了DNA的復(fù)制機(jī)理。1958年諾貝爾獎(jiǎng)

2.4遺傳信息傳遞中心法則的建立

從1961年開(kāi)始，以Nirenberg等為代表的一批科學(xué)家，確定遺傳信息是以密碼方式傳遞的，每三個(gè)核苷酸組成一個(gè)密碼子，代表一種氨基酸。到1966年全部破譯了64個(gè)密碼，編排了一個(gè)震驚世界的密碼字典，闡述了中心法則，提出的遺傳信息流是DNA→RNA→蛋白質(zhì)。2.5對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)

1956-58年Anfinsen和White根據(jù)對(duì)酶蛋白的變性和復(fù)性實(shí)驗(yàn)，提出蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)是由其氨基酸序列來(lái)確定的原則2.基因操作技術(shù)建立的理論基礎(chǔ)1.基因與基因工程的定義2.基因工程的理論基礎(chǔ)3.基因工程的技術(shù)基礎(chǔ)及誕生4.基因工程技術(shù)的發(fā)展5.基因工程的研究?jī)?nèi)容6.基因工程的應(yīng)用和面臨問(wèn)題主要內(nèi)容3.1限制性內(nèi)切酶（restrictionenzymes）1968年第一個(gè)限制酶EcoK馬特·梅索森1970年H.O.Smith等分離出第一種限制性核酸內(nèi)切酶WernerArber理論預(yù)見(jiàn)限制酶DanielNathans用限制酶切得SV40DNA片斷HamiltonO.Smith得到第一個(gè)限制酶1978年Nobel生理與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)3.基因工程的技術(shù)基礎(chǔ)和誕生★3.2DNA連接酶（ligase）1967年MartinGellert從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)DNA連接酶3.3載體（vector）1972年前后使用小分子量的細(xì)菌質(zhì)粒和噬菌體作載體，在細(xì)菌細(xì)胞里的大量擴(kuò)增。3.4感受態(tài)體系1970年M.Mandel和A.Higa發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)氯化鈣處理的大腸桿菌容易吸收噬菌體DNA。1972年S.Cohen發(fā)現(xiàn)這種處理過(guò)的細(xì)菌同樣能吸收質(zhì)粒DNA。3.5瓊脂糖凝膠電泳1960s發(fā)明了瓊脂糖凝膠電泳，可將不同長(zhǎng)度的DNA分離開(kāi)。1980年Nobel化學(xué)獎(jiǎng)1972年斯坦福大學(xué)的PaulBerg小組完成了首次體外重組實(shí)驗(yàn)：將SV-40病毒DNA與噬菌體P22DNA

片斷連接起來(lái)。1.Berg的開(kāi)創(chuàng)性實(shí)驗(yàn)基因工程的誕生★構(gòu)筑了第一個(gè)重組的DNA分子，這意味著生物體的遺傳性狀可以人為地改造2.Boyer-Cohen實(shí)驗(yàn)1973年斯坦福大學(xué)的S.Cohen小組將含有卡那霉素抗性基因的大腸桿菌R6-5質(zhì)粒與含有四環(huán)素抗性基因的另一種大腸桿菌質(zhì)粒pSC101連接成重組質(zhì)粒，具有雙重抗藥性。后來(lái)又把非洲爪蟾核糖體基因片斷同pSC101質(zhì)粒重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并在菌體內(nèi)成功轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA。這是第一次成功的應(yīng)用質(zhì)粒進(jìn)行外源基因克隆與表達(dá)實(shí)驗(yàn)，打破了基因的物種界限。StanleyCohen1986Nobel生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)（和此無(wú)關(guān)）HerbBoyerBoyer-Cohen實(shí)驗(yàn)R6-51976年，Boyer與斯旺遜共同組建了Genentech公司，促進(jìn)了基因工程的發(fā)展：1977年該公司成功實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中表達(dá)人類蛋白質(zhì)——生長(zhǎng)激素抑制素的成就，首次實(shí)現(xiàn)在其他物種中表達(dá)人類蛋白質(zhì)，具有里程碑意義。

1978年，公司又成功生產(chǎn)出人胰島素1979年生長(zhǎng)素1980年干擾素1.基因與基因工程的定義2.基因工程的理論基礎(chǔ)3.基因工程的技術(shù)基礎(chǔ)及誕生4.基因工程技術(shù)的發(fā)展5.基因工程的研究?jī)?nèi)容6.基因工程的應(yīng)用和面臨問(wèn)題主要內(nèi)容4.基因操作技術(shù)的發(fā)展☆1975年，DNA測(cè)序技術(shù)

F.Sanger、A.Maxam和W.Gilbert發(fā)明了DNA快速測(cè)序技術(shù)1975～1981各種印跡技術(shù)（DNA、RNA、蛋白質(zhì)）1980年：顯微注射培育出第一個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：轉(zhuǎn)基因小鼠1983年：農(nóng)桿菌介導(dǎo)培育出第一例轉(zhuǎn)基因植物：轉(zhuǎn)基因煙草1980年Nobel化學(xué)獎(jiǎng)1983年，PCR技術(shù)美國(guó)人KaryB.Mullis發(fā)明PCR儀，建立了DNA體外擴(kuò)增技術(shù)。1987年發(fā)表了“SpecificsynthesisofDNAinvitroviaapolymerase-catalyzedchainreaction”，于1993年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。1987年，基因敲除技術(shù)

Thompsson首次建立了完整的胚胎干細(xì)胞基因敲除的小鼠模型。直到現(xiàn)在，運(yùn)用基因同源重組進(jìn)行基因敲除依然是構(gòu)建基因敲除動(dòng)物模型中最普遍的使用方法。

1992年，基因芯片技術(shù)

Affymatrix公司Fodor領(lǐng)導(dǎo)的小組運(yùn)用半導(dǎo)體照相平板技術(shù)，對(duì)原位合成制備的DNA芯片作了首次報(bào)道，這是世界上第一塊基因芯片。1995年，Stanford大學(xué)的P.Brown實(shí)驗(yàn)室發(fā)明了第一塊以玻璃為載體的基因微矩陣芯片。標(biāo)志著基因芯片技術(shù)進(jìn)入了廣泛研究和應(yīng)用的時(shí)期。LIC（LigationIndependentCloning)技術(shù)基因組編輯技術(shù)4.基因操作技術(shù)的發(fā)展1.基因與基因工程的定義2.基因工程的理論基礎(chǔ)3.基因工程的技術(shù)基礎(chǔ)及誕生4.基因工程技術(shù)的發(fā)展5.基因工程的研究?jī)?nèi)容6.基因工程的應(yīng)用和面臨問(wèn)題主要內(nèi)容5.基因操作的研究?jī)?nèi)容

5.1基礎(chǔ)研究

(1)克隆、表達(dá)載體開(kāi)發(fā)：原核、真核微生物的克隆載體；Ti質(zhì)粒及其衍生載體（植物基因工程）；動(dòng)物病毒克隆載體（動(dòng)物基因工程）；構(gòu)建新載體（適于高等動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體和定位整合載體），應(yīng)大力發(fā)展。簡(jiǎn)化操作，提高克隆和表達(dá)效率（2）受體系統(tǒng)：

克隆載體的宿主：外源目的基因表達(dá)場(chǎng)所

原核,如大腸桿菌，早期的藍(lán)藻

真核單細(xì)胞生物如酵母菌。人和高等動(dòng)、植物復(fù)雜基因組文庫(kù)的受體系統(tǒng)

小球藻和衣藻，高等植物受體（愈傷組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體、部分組織和器官），雙子葉植物擬南芥、煙草，單子葉植物水稻、玉米等。

動(dòng)物體細(xì)胞再分化能力差，主要是生殖細(xì)胞或胚細(xì)胞受體，已獲轉(zhuǎn)基因鼠、魚(yú)等。

人體細(xì)胞受體。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系作病理研究，以異常生長(zhǎng)細(xì)胞作受體，通過(guò)轉(zhuǎn)基因使其回復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)（基因治療）。

擴(kuò)展基因操作的對(duì)象（3）目的基因

開(kāi)發(fā)人們特殊需要的基因，即目的基因（優(yōu)良性狀的基因、致病基因）。發(fā)達(dá)國(guó)家激烈競(jìng)爭(zhēng)的焦點(diǎn)，有限的戰(zhàn)略性資源，可申請(qǐng)新基因?qū)＠?/p>

自然界調(diào)取，構(gòu)建基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)；PCR直接從某生物基因組擴(kuò)增；DNA改組通過(guò)人工進(jìn)化獲取新基因；人工設(shè)計(jì)與合成已獲目的基因大致種類：與醫(yī)藥相關(guān)的基因；抗病、蟲(chóng)害和惡劣環(huán)境的基因；編碼特殊營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的蛋白或多肽基因等。

2008年發(fā)現(xiàn)一種粉紅粘帚霉能將纖維素變成生物燃料，成分與柴油等燃料相似粉紅粘帚霉排出的氣體大部分都是碳?xì)浠衔铮渲兄辽儆?種化合物是柴油中最豐富的成分

基因組：某種生物的全部基因：

1990年開(kāi)始實(shí)施“人類基因組計(jì)劃”，2000年6月已繪制“工作框架圖”。意義：人生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖，遺傳性疾病的病因（基因治療），優(yōu)生優(yōu)育。（P6)“水稻基因組計(jì)劃”：中國(guó)水稻（秈稻）基因組“工作框架圖”和數(shù)據(jù)庫(kù)已完成。中、英兩國(guó)合作“家豬基因組計(jì)劃”。

（4）工具酶

指體外進(jìn)行DNA合成、切割、修飾和連接等系列過(guò)程中所需要的酶（DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶、修飾酶和連接酶等）。

限制性核酸內(nèi)切酶：有規(guī)律地切割DNA，獲得特定末端的DNA片段。研究熱點(diǎn)：耐熱內(nèi)切酶和長(zhǎng)識(shí)別序列稀切酶。

DNA連接酶、重組酶

DNA聚合酶：人工合成序列、引物等DNA小片段以及含基因的較大的DNA片段，制備DNA探針。已發(fā)現(xiàn)的多種耐熱性DNA聚合酶有Taq、Tth、Bst、Pwo、pfu等。

DNA修飾酶：修飾DNA分子的有甲基化酶，修飾末端的有堿性磷酸酯酶、轉(zhuǎn)移酶、核酸外切酶等。5.2新技術(shù)開(kāi)發(fā)：

基因?qū)爰夹g(shù)：一系列用于不同類型受體細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)化方法和病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)方法；基因槍、電激儀等克服了某些克隆載體應(yīng)用的物種局限性，提高外源DNA轉(zhuǎn)化的效率。

基因的檢測(cè)技術(shù)：放射性同位素標(biāo)記探針，非放射性標(biāo)記DNA探針和熒光探針技術(shù)。

基因分離技術(shù)：凝膠電泳可分開(kāi)幾萬(wàn)堿基的DNA分子或DNA片段；脈沖電泳能分開(kāi)上百萬(wàn)堿基的DNA分子或片段或完整的染色體。

DNA分子連接技術(shù)：多片段一步克隆法無(wú)痕修飾技術(shù)：沒(méi)有任何多余的序列殘留在DNA上基因組編輯技術(shù)：同源重組和非同源重組，新型人工核酸酶

☆1.基因與基因工程的定義2.基因工程的理論基礎(chǔ)3.基因工程的技術(shù)基礎(chǔ)及誕生4.基因工程技術(shù)的發(fā)展5.基因工程的研究?jī)?nèi)容6.基因工程的應(yīng)用和面臨問(wèn)題主要內(nèi)容

藥物(活性肽、疫苗等）、診斷與治療(見(jiàn)下表）生物基化學(xué)品、酶工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)（生物乙醇、有機(jī)酸等)

環(huán)保（降解廢、毒物等）農(nóng)業(yè)、食品（抗逆、抗病蟲(chóng)害、性狀改良的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物等）觀賞娛樂(lè)6.基因操作技術(shù)的應(yīng)用和問(wèn)題

☆在美國(guó)