第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法1

第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法進(jìn)行初步觀察形成可驗(yàn)證的假說設(shè)計(jì)對(duì)照試驗(yàn)收集資料解釋結(jié)果作出合理結(jié)論查閱已有知識(shí)生物學(xué)研究模式生物不同物種享有共同分子機(jī)制CaenorhabditiselegansDrosophilamelanogasterArabidopsisthaliana細(xì)胞破碎細(xì)胞器組份形態(tài)觀察細(xì)胞培養(yǎng)離心分離染色免疫技術(shù)分子生物學(xué)標(biāo)記掌握各種顯微鏡的用途、幾種細(xì)胞組分的主要分析方法的原理及技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞融合的方法了解電子顯微鏡的觀察方法及顯微操作技術(shù)的基本原理。教學(xué)目的、要求本章內(nèi)容提要第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法第二節(jié)細(xì)胞及其組分的分析方法第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程

第一節(jié)

細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法1cm1mm100um10um1um100nm10nm1nm0.1nm光學(xué)顯微鏡電子顯微鏡掃描隧道顯微鏡肉眼分辨率：0.2mm光學(xué)顯微鏡分辨率：0.2μm

電子顯微鏡分辨率：0.2nm幾種顯微鏡的分辨范圍一、光學(xué)顯微鏡1.普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡2.熒光顯微鏡4.激光共焦點(diǎn)掃描顯微境3.暗視野顯微鏡5.相差顯微鏡偏光顯微鏡6.微分干涉差顯微鏡7.倒置顯微鏡各種光學(xué)顯微鏡的特性比較當(dāng)代顯微鏡的發(fā)展趨勢(shì)普通生物顯微鏡由三部分構(gòu)成：照明系統(tǒng)光學(xué)放大系統(tǒng)機(jī)械裝置原理：經(jīng)物鏡形成倒立實(shí)像，經(jīng)目鏡進(jìn)一步放大成像。1.普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡分辨率N=介質(zhì)折射率；α=鏡口角（標(biāo)本對(duì)物鏡鏡口的張角鏡口角總是要小于140?，所以sina/2的最大值必然小于1。分辨力數(shù)值不會(huì)小于0.2μm，人眼的分辨力為0.2mm,因此顯微鏡的最大設(shè)計(jì)倍數(shù)為1000X。指顯微鏡能分辨物體最小間隔的能力。0.61λ分辨率DN.sin（α/2）=樣品的制作制片：固定（甲酫）、包埋（石蠟）切成厚約5μm的薄片以便觀察。染色：伊紅和美藍(lán)特異地與不同蛋白質(zhì)結(jié)合，品紅特異地顯示DNA的所在部位。2.熒光顯微鏡Fluorescencemicroscope特點(diǎn)：光源為短波光(紫外光)；有兩個(gè)特殊的濾光片；用一定波長(zhǎng)的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光原理:利用一定波長(zhǎng)的光,照射被檢樣品,激發(fā)熒光物質(zhì)發(fā)出可見的熒光,視場(chǎng)中所見像主要是樣品的熒光映像.自發(fā)熒光:生物體內(nèi)有些物質(zhì)受激發(fā)光照射后可直接發(fā)出的熒光.木質(zhì)素,葉綠素次發(fā)熒光:標(biāo)本本身不發(fā)熒光，經(jīng)熒光染料處理后,那些對(duì)熒光染料有選擇性吸收的部分經(jīng)激發(fā)后發(fā)出的熒光.常用熒光物質(zhì)：酸性品紅，甲基綠，中性紅，EB等。4.激光共焦點(diǎn)掃描顯微境（laserscanningconfocalmicroscopy,LCSM

）共焦點(diǎn)是指物鏡和聚光鏡同時(shí)聚焦到同一個(gè)小點(diǎn)，即它們互相共焦點(diǎn)。LCSM

激光光源通過一個(gè)微小縫隙，打到一個(gè)二向色鏡。由鏡子反射的光線通過物鏡、聚焦在樣品的一個(gè)層面上。樣品被激發(fā)后發(fā)出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的光，通過物鏡成像、聚焦在顯微鏡中的一個(gè)針孔縫隙中，而來自其它層面的光線被擋板擋住。圖像通過信號(hào)放大傳輸?shù)接?jì)算機(jī)中。LCSM照片，藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色為微管比普通熒光顯微鏡的分辨率提高1.4-1.7倍。由于可自動(dòng)改變觀察的焦平面而且縱向分辨率（axialresolution）得到改善，所以可以通過“光學(xué)切片”觀察較厚樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。將改變焦點(diǎn)獲得一系列細(xì)胞不同切面上的圖像，經(jīng)疊加后便可重構(gòu)出樣品的三維結(jié)構(gòu)。相差顯微鏡(phasecontrastmicroscope)FritsZernike1953年Nobel物理學(xué)獎(jiǎng)1.分離直射光和衍射光2.使直射光和衍射光之間產(chǎn)生干涉，使相位差變成振幅差,表現(xiàn)為明與暗的對(duì)比秀麗桿線蟲C.elegans——用于觀察未染色樣品,能夠觀察到無色透明的活的物體。相差顯微鏡基本原理：把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)清晰可見。在構(gòu)造上，相差顯微鏡不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個(gè)特殊之處：環(huán)形光闌(annular

diaphragm)相位板(annularphaseplate)A+相板B+相板5.微分干涉差顯微鏡Differentialinterferencecontrastmicroscope（DIC）1952年Nomarski發(fā)明，利用兩組平面偏振光的干涉，加強(qiáng)影像的明暗效果，能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影。標(biāo)本可略厚一點(diǎn)，折射率差別更大，故影像的立體感更強(qiáng)。更適合研究活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器。組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺(tái)之下，后者在載物臺(tái)之上，用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，具有相差物鏡。6.倒置顯微鏡顯微鏡用途分辨率普通顯微鏡適于一般性生物的觀察，操作方便不小于0.2μm熒光顯微鏡觀察可發(fā)熒光的物質(zhì)，可定性定量高于普通顯微鏡倒置顯微鏡多用于觀察活細(xì)胞，具有相差物鏡與普通顯微鏡相同激光共焦點(diǎn)掃描顯微鏡顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)，也可以用于細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計(jì)以及細(xì)胞形態(tài)的測(cè)量比普通顯微鏡提高1.4-1.7倍微分干涉差顯微鏡能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像，目前像基因注入、核移植、轉(zhuǎn)基因等的顯微操作常在這種顯微鏡下進(jìn)行，可觀察活細(xì)胞中的顆粒及細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)普通顯微鏡10倍以上相差顯微鏡可以觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞-各種光學(xué)顯微鏡的比較當(dāng)代顯微鏡的發(fā)展趨勢(shì)采用組合方式集普通光鏡加相差、熒光、暗視野、DIC、攝影裝置于一體。自動(dòng)化與電子化。二、電子顯微鏡技術(shù)透射電子顯微鏡掃描電子顯微鏡1.原理：以電子束作光源，電磁場(chǎng)作透鏡。電子束波長(zhǎng)與加速電壓(通常50~120KV)的平方根成反比。由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成。分辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達(dá)百萬倍。用于觀察超微結(jié)構(gòu)（小于0.2μm）。用于電鏡的標(biāo)本須制成厚度約50nm左右的超薄切片。（一）、透射電子顯微鏡電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別

分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理

利用樣品對(duì)波長(zhǎng)的吸光學(xué)0.2μm左右可見光收形成明暗反差和顏顯微鏡放大倍數(shù)1000×400-700nm玻璃不要求色變化100nm紫外光電子利用樣品對(duì)電子的顯微鏡0.1-0.2nm電子束

0.01-0.9nm

電磁要求

散射和透射形成明暗反差電鏡需要真空的原因:1.如果含有其他分子,會(huì)與電子發(fā)生碰撞,使電子散射,影響成像質(zhì)量,2.碰撞也會(huì)使電子束不穩(wěn)定,產(chǎn)生閃爍現(xiàn)象,3.灼熱的燈絲遇氣體易腐蝕和斷裂.2、制樣技術(shù)超薄切片負(fù)染技術(shù)冰凍蝕刻電子束穿透力很弱，用于電鏡觀察的標(biāo)本須制成厚度僅50nm的超薄切片，用超薄切片機(jī)ultramicrotome）制作。通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式切片，重金屬（鈾、鉛）鹽染色。超薄切片Page59超薄切片技術(shù)主要包括取材、固定、包埋、切片、染色等步驟。Electronmicrographofaroot-tipcellstainedwithosmiumandotherheavymetalions.Thecellwall,nucleus,vacuoles,mitochondria,endoplasmicreticulum,Golgiapparatus,andribosomesareeasilyseen.負(fù)染技術(shù)用重金屬鹽(如磷鎢酸)染色；吸去染料干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸出地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果，分辨力可達(dá)1.5nm左右。NegativeStainedArchaebacteriaNegativeStainedActin冷凍蝕刻freeze-etching標(biāo)本置于干冰（-78.5攝氏度）或液氮（-196攝氏度）中冰凍。用冷刀驟然將標(biāo)本斷開，然后升溫，冰升華，暴露斷面結(jié)構(gòu)。向斷面噴涂一層蒸汽鉑和碳。然后用次氯酸鈉將組織溶掉，把鉑和碳的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜（replica）。Page61酵母細(xì)胞4.電鏡三維重構(gòu)技術(shù)該技術(shù)是電子顯微術(shù)、電子衍射與計(jì)算機(jī)圖像處理相結(jié)合而形態(tài)的具有重要應(yīng)用前景的一門新技術(shù)，尤其適于分析難以形成三維晶體的膜蛋白以及病毒和蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物等大的復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)。掃描電子顯微鏡（scanningelectronmicroscope，SEM）于20世紀(jì)60年代問世，用來觀察標(biāo)本的表面結(jié)構(gòu)。（二）、掃描電子顯微鏡工作原理

用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級(jí)電子，次級(jí)電子的多少與電子束入射角有關(guān)，也就是說與樣品的表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級(jí)電子由探測(cè)體收集，并在那里被閃爍器轉(zhuǎn)變?yōu)楣庑盘?hào)，再經(jīng)光電倍增管和放大器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)來控制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體形象，反映了標(biāo)本的表面結(jié)構(gòu)。為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級(jí)電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級(jí)電子信號(hào)。antigen-presentingcells，APCs掃描電鏡電鏡光鏡總體形態(tài)顏色內(nèi)部結(jié)構(gòu)

表面形態(tài)

三、掃描隧道顯微鏡

掃描隧道顯微鏡（scanningtunnelingmicroscope，STM）

由Binnig等1981年發(fā)明，根據(jù)量子力學(xué)原理中的隧道效應(yīng)而設(shè)計(jì)。

利用掃描隧道顯微鏡直接觀察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白質(zhì)等分子的原子布陣和某些生物結(jié)構(gòu)，如生物膜、細(xì)胞壁等的原子排列分辨率：橫向?yàn)?.1~0.2nm，縱向可達(dá)0.001nm。用途：三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質(zhì)均可進(jìn)行觀察。

STMimageofaDNAmolecule細(xì)胞組分分析物理方法化學(xué)方法免疫學(xué)方法分子生物學(xué)方法離心組織染色流式細(xì)胞細(xì)胞電泳免疫標(biāo)記放射性自顯影吸收光譜第二節(jié)、細(xì)胞組分的分析方法一、離心技術(shù)是分離細(xì)胞器及各種大分子基本手段。轉(zhuǎn)速為10~25kr/min的離心機(jī)稱為高速離心機(jī)。轉(zhuǎn)速>25kr/min，離心力>89Kｇ者稱為超速離心機(jī)。超速離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá)100000r/min，離心力超過500Kg。1.差速離心Differentialcentrifugation特點(diǎn)：介質(zhì)密度均一；速度由低向高，逐級(jí)離心。用途：分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。沉降順序：核——線粒體——溶酶體與過氧化物酶體——內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體——核蛋白體?？蓪⒓?xì)胞器初步分離，常需進(jìn)一步通過密度梯離心再進(jìn)行分離純化。利用肝臟制備各種亞細(xì)胞組分的制備離心過程示意圖勻漿物肝臟上清夜完整細(xì)胞完整細(xì)胞1000g20min核線粒體溶酶體過氧化物酶體微粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)100000g120min105000g20minDNase靜置20min10000g20min核糖體2.密度梯度離心用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞和細(xì)胞成分分層、分離。類型：速度沉降、等密度沉降。常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。

速度沉降velocitysedimentation

用途：分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。特點(diǎn)：介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。原理：介質(zhì)密度梯度平緩，分離物按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達(dá)到分離。等密度沉降isopycnicsedimentation用途：分離密度不等的顆粒。特點(diǎn)：介質(zhì)密度高，陡度大，介質(zhì)最高密度大于被分離組分的最大密度。力場(chǎng)比速率沉降法大10~100倍，需要高速或超速離心。原理：樣品各成分在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過一定時(shí)間的離心則沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡，從而將不同密度的成分分離。差速離心密度梯度離心CsCl密度梯度離心蔗糖密度梯度離心低速離心中速離心高速離心超高速離心細(xì)胞勻漿細(xì)胞核仁細(xì)胞骨架大細(xì)胞器小細(xì)胞器核糖體大分子離心樣品蔗糖的穩(wěn)定梯度慢速沉降成分快速沉降成分分畫樣品蔗糖的不連續(xù)梯度低浮力密度成分高浮力密度成分二者結(jié)合二、細(xì)胞組分顯示方法組織化學(xué)或細(xì)胞化學(xué)染色（histochemicalorcytochemicalstaining）是利用染色劑可同細(xì)胞的某種成分發(fā)生反應(yīng)而著色的原理，對(duì)某種成分進(jìn)行定性或定位研究的技術(shù)。利用這種方法對(duì)細(xì)胞的各種成分幾乎都能顯示，包括有機(jī)物、醛、蛋白質(zhì)、糖類、脂類、核酸、酶等。1.固定物理固定：血膜空氣快速干燥、冷凍干燥?；瘜W(xué)固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和鋨酸等試劑。顯示多糖常用乙醇固定，顯示酶類多用甲醛丙酮緩沖液固定。

步驟：2.顯示方法金屬沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應(yīng)產(chǎn)物最終生成CuS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。Schiff反應(yīng)：細(xì)胞中的醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變?yōu)榧t色。用于顯示糖和脫氧核糖核酸（Feulgen反應(yīng)）。聯(lián)苯胺反應(yīng)：過氧化酶分解H202。產(chǎn)生新生氧，后者再將無色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍(lán)，進(jìn)而變成棕色化合物。脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。茚三酮反應(yīng)：顯示蛋白質(zhì)。金屬沉淀法Schiff反應(yīng)聯(lián)苯胺反應(yīng)脂溶染色法E.茚三酮反應(yīng)：顯示蛋白質(zhì)。F.米倫（Millon）染色：顯示蛋白質(zhì)（紅色）酪氨酸殘基與氮汞試劑反應(yīng)免疫細(xì)胞化學(xué)是根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗體同特定抗原結(jié)合，對(duì)抗原進(jìn)行專一定位測(cè)定的技術(shù)。如果將抗體結(jié)合上標(biāo)記物，再與組織中的抗原發(fā)生反應(yīng)，即可在光鏡或電鏡下顯示出該抗原存在于組織中的部位。免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry)三、特異蛋白抗原的定位與定性抗體與抗原的結(jié)合方法可分為以下兩種：直接法間接法將帶有標(biāo)記的抗體與抗原反應(yīng)，顯示出抗原存在的部位在抗體抗原初級(jí)反應(yīng)的基礎(chǔ)上，再用帶標(biāo)記的次級(jí)抗體與初級(jí)抗體反應(yīng)，從而使初級(jí)反應(yīng)得到放大，增強(qiáng)顯示效果間接免疫細(xì)胞化學(xué)法的原理示意圖次級(jí)抗體初級(jí)抗體標(biāo)記物第一抗體（一抗）第二抗體（二抗）三、特異蛋白抗原的定位和定性1.免疫熒光技術(shù)Immunofluorescencetechnique：抗原-抗體特異結(jié)合與熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合用于研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。用Alexa488標(biāo)記的抗人α-tubulin抗體染色顯示微管(綠色);細(xì)胞核:紅色,DAPI染色(常規(guī)熒光顯微鏡照片，ShiQinghua等)用抗α-tubulin抗體染色顯示微管(綠色);細(xì)胞核:紅色,DAPI染色(激光共聚焦顯微鏡照片)2.免疫電鏡技術(shù)Immuneelectronmicroscopy：通過對(duì)分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動(dòng)態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等

用免疫電鏡方法,觀察到寇氏隱甲藻的多條凝集染色體和細(xì)胞中的金顆粒,并且細(xì)胞核內(nèi)、核膜上的金顆粒簇集相對(duì)于胞質(zhì)中相對(duì)集中,指示了ACA抗CJFD2003

四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸序列的定位與定性通常用*原位雜交：指用標(biāo)記的核酸探針通過分子雜交確定特異核苷酸序列在染色體上或者在細(xì)胞中的位置的方法。五、放射自顯影術(shù)用于研究標(biāo)記化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等等。原理：將放射性同位素標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時(shí)間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)放射性曝光，使乳膠感光。一般用14C和3H標(biāo)記。常用3H-TDR來顯示DNA，用3H-UDR顯示RNA；用3H氨基酸研究蛋白質(zhì)，用3H甘露糖、3H巖藻糖研究多糖。14C半衰期為5730年，3H為12.5年。1.流式細(xì)胞技術(shù)用途：對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析與分選的一門技術(shù)。原理：包在鞘液中的細(xì)胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個(gè)細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測(cè)器檢測(cè)，轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，送入計(jì)算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分離純度可達(dá)99%。包被細(xì)胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細(xì)胞計(jì)（flowcytometer）。六、定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)2.顯微光譜分析技術(shù)細(xì)胞中有一些成分具有特定的吸收光譜，核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞色素、維生素等都有自己特征性的吸收曲線?？衫蔑@微分光光度計(jì)對(duì)某些成分進(jìn)行定位、定性和定量測(cè)定。第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程一、細(xì)胞培養(yǎng)二、細(xì)胞工程細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng)原代細(xì)胞培養(yǎng)傳代細(xì)胞培養(yǎng)群體細(xì)胞培養(yǎng)克隆細(xì)胞培養(yǎng)組織培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)單倍體細(xì)胞培養(yǎng)病毒一、細(xì)胞培養(yǎng)(一)、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)選用最佳生存條件對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和研究的技術(shù)。動(dòng)物細(xì)胞的生存環(huán)境與植物細(xì)胞差別很大，因而二者的培養(yǎng)方法很不相同。(一)、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)1.基本概念原代細(xì)胞(primaryculturecell)

從動(dòng)物機(jī)體取出的進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞群。有人也把培養(yǎng)的第2代細(xì)胞與傳10代以內(nèi)的細(xì)胞統(tǒng)稱為原代培養(yǎng)細(xì)胞。