分子診斷技術(shù)的臨床應(yīng)用

分子診斷技術(shù)的臨床應(yīng)用分子診斷利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測生物大分子主要指核酸(DNA和RNA)和蛋白質(zhì)，從而對疾病作出診斷的方法稱為分子診斷.

PCR技術(shù)核酸雜交技術(shù)DNA測序技術(shù)生物芯片技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)雙向凝膠電泳生物質(zhì)譜蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)其它分子診斷技術(shù)毛細(xì)管電泳變性高效液相色譜生物大分子相互作用分析技術(shù)核酸和蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)分子克隆分子診斷技術(shù)介紹在臨床應(yīng)用中日臻成熟和廣泛熒光定量PCR核酸測序基因芯片PCR技術(shù)核酸分子雜交hybridization同源鏈異源鏈探針（probe）及應(yīng)用是一段帶有檢測標(biāo)記，且順序已知的，與目的基因互補(bǔ)的核酸序列(DNA或RNA)?；蛱结樛ㄟ^分子雜交與目的基因結(jié)合，產(chǎn)生雜交信號，能從浩翰的基因組中把目的基因顯示出來。基于核酸雜交的分子診斷技術(shù)SouthernNorthern基因芯片F(xiàn)ISH熒光定量PCR(FQ-PCR)實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)熒光定量PCR反應(yīng)體系的組成:模板引物酶

dNTPMg2+

探針/熒光染料

熒光化學(xué)

熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針熒光染料熒光定量PCR技術(shù)之一5’3’RQ探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收，所以檢測不到熒光，此種現(xiàn)象稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移。λTaqManTM熒光定量PCR技術(shù)分子信標(biāo)（molecularbeacon）熒光定量PCR實(shí)時熒光定量PCR儀熒光定量PCR反應(yīng)體系的組成:模板引物酶

dNTPMg2+

探針/熒光染料SYBRGreenI熒光染料

在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料。SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號。熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。

生物芯片生物芯片（biochip）是指采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至組織切片、細(xì)胞等等生物樣品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝膠、尼龍膜等載體）的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器比如激光共聚焦掃描或電荷偶聯(lián)攝影像機(jī)（CCD）對雜交信號的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量核酸測序技術(shù)Sanger法測序Sanger法測序的原理就是利用一種DNA聚合酶來延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨(dú)的反應(yīng)構(gòu)成，每個反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團(tuán)，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點(diǎn)由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。它們具有共同的起始點(diǎn)，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測。焦磷酸測序技術(shù)(pyrosequencing)基于核酸合成的實(shí)時測序技術(shù)第一步：加入測序引物和試劑第二步:每次加入一種dNTP，如果結(jié)合，則產(chǎn)生一個焦磷酸（PPi）第三步：硫酸化酶轉(zhuǎn)化PPi為ATP，ATP使熒光素酶發(fā)出熒光(產(chǎn)生的光強(qiáng)度與結(jié)合的核苷數(shù)量成正比)第四步：多余的dNTP被降解，開始新一個循環(huán)主要特點(diǎn)：基于實(shí)時測序技術(shù)的檢測和定量lighttime臨床應(yīng)用乙型肝炎的分子診斷乙肝病毒定量乙肝病毒分型乙肝病毒耐藥分析HBV-DNA(病毒載量分析)HBV分型HBV耐藥分析乙型肝炎的分子診斷

HBV-DNA(病毒載量分析)

實(shí)時熒光定量PCR

可以對任何時期乙肝病毒DNA拷貝數(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確定量療效監(jiān)測和病程HBV基因分型和耐藥檢測HBV基因分型根據(jù)HBV全基因序列差異≥8%或S區(qū)基因序列差異≥4%，目前HBV分為A~H8個基因型在我國，A、B、C及D基因型HBV都存在，其中B和C型共占95%，A型很少見，至今未發(fā)現(xiàn)E、F、G和H基因型。北方城市以C基因型流行為主，由北方至南方，B基因型感染率逐漸升高

4.基因型與臨床實(shí)驗(yàn)室表現(xiàn)不同（表2）病情與轉(zhuǎn)歸：C較B差抗病毒治療：A優(yōu)于DB優(yōu)于Cadw/ayw20:1基因型檢測意義：不同基因型HBV感染預(yù)后差異明顯，C型感染者病情較重，與B基因型相比更易導(dǎo)致包括肝硬化、肝細(xì)胞癌（HCC）在內(nèi)的嚴(yán)重病情；治療前進(jìn)行分型檢測，根據(jù)分型結(jié)果選擇合適的治療方案；對干擾素應(yīng)答不同，干擾素對C型患者的治療效果較差，對B型患者的治療效果較好。HBV分子診斷特征基因型BC流行性低高HBeAg陽性率低高HBeAg自然清除時間短長HBVDNA載量低高致病性輕重HCC發(fā)生率低（低年齡組高）高（高年齡組高）干擾素治療完全應(yīng)答率高低抗病毒治療效果高低肝癌手術(shù)治療預(yù)后好差癌栓栓塞治療效果好差與HBV血清型比較，HBV基因型具有更加重要的意義。

乙型肝炎病毒的耐藥性檢測HBV分子診斷P區(qū)耐藥突變位點(diǎn)的檢測核苷（酸）類似物：拉米夫定（lamivudine)

阿德福韋（adefovir)

恩替卡韋（entecavir)

替比夫定（telbivudine)1、只有一個抗病毒靶點(diǎn)：HBVDNA聚合酶區(qū)（P）2、交叉耐藥3、核苷類抗乙肝病毒藥物不斷問世HBV分子診斷拉米夫定耐藥特點(diǎn)LAM耐藥位點(diǎn)主要是rtM204V/I,可單獨(dú)出現(xiàn)或聯(lián)合

rtL180M、rtV173L/M和其他位點(diǎn)變異隨著用藥時間的延長，耐藥變異發(fā)生率升高耐藥變異往往是病毒學(xué)突破和臨床突破的前奏不同基因型HBV發(fā)生YMDD變異率不同HBV分子診斷何謂YMDD變異在拉米夫定治療期間，病毒DNA編碼的DNA聚合酶基因序列發(fā)生了變異，這種變異在YMDD序列及其附近，因而稱為YMDD變異。HBVDNA多聚酶逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域上酪氨酸－蛋氨酸－天門東氨酸－天門東氨酸（YMDD）上的突變，YMDD位于P區(qū)第549－522aa（即Y549M550D551D552），YMDD中蛋氨酸（M）被纈氨酸（V）或異亮氨酸（I）替代，變成YVDD/YIDD。即：Met—ATG

YMDD

Val—GTG

YVDD

Ile—ATT/ATC/ATA

YIDDHBV分子診斷YMDD變異是如何產(chǎn)生的？1、乙肝病毒發(fā)生YMDD變異自然形成的，未服用拉米夫定的患者體內(nèi)也可能存在YMDD變異株。2、拉米夫定作為重要的選擇性因素，使YMDD變異株成為優(yōu)勢病毒株。3、YMDD變異通常在拉米夫定治療6個月后可能成為優(yōu)勢株。4、YMDD變異株累計發(fā)生率隨用藥時間延長顯著增高。5、YMDD變異株成為優(yōu)勢病毒株的患者在停止服用拉米夫定后，YMDD野生株又可逐漸恢復(fù)成優(yōu)勢株。SiAhmedetal.Hepatology2000;32:1078–88600500200150100500876543061218243036拉米夫定治療出現(xiàn)耐藥的動力學(xué)變化月42病毒學(xué)突破MMMM/VLML/MMMM/VL亮MMV密碼子180密碼子204M蛋VALT(U/L)HBVDNAlog

copies/mL臨床突破HBV分子診斷基因型耐藥基因型耐藥HBV分子診斷阿德福韋酯耐藥現(xiàn)狀A(yù)DV于2005年3月被SFDA批準(zhǔn)在我國上市通過查閱CNKI2005-2009年國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)，關(guān)于阿德福韋酯療效的文章共32篇，其中研究對象大于20例的涉及耐藥率和相關(guān)變異的論文僅5篇HBV分子診斷阿德福韋酯耐藥特點(diǎn)我國對ADV耐藥情況的隨訪時間較短我國CHB患者的ADV耐藥株主要變異位點(diǎn)是rtN236T和rtA181V/T拉米夫定耐藥患者，ADV耐藥發(fā)生率明顯高于初治患者國外報道HBeAg陰性患者對ADV的耐藥發(fā)生率高于HBeAg陽性患者HBV分子診斷HBV分子診斷恩替卡韋耐藥現(xiàn)狀ETV與2005年11月被SFDA批準(zhǔn)在我國上市查閱CNKI2005-2009年我國與ETV相關(guān)文獻(xiàn)，多數(shù)研究（18篇）是應(yīng)用ETV對LAM耐藥患者進(jìn)行治療，關(guān)于隨訪耐藥情況的報道較少見，僅2篇報道檢測ETV耐藥變異HBV分子診斷恩替卡韋耐藥特點(diǎn)以ETV進(jìn)行初治的CHB患者，罕見病毒學(xué)突破，耐藥發(fā)生率低國外報道的ETV耐藥多發(fā)生在LAM治療失效或有YMDD變異的患者，同時需要多個位點(diǎn)置換才能發(fā)生臨床耐藥國內(nèi)ETV耐藥報道較少多數(shù)研究是應(yīng)用ETV對LAM耐藥患者進(jìn)行治療HBV分子診斷我國ETV耐藥多發(fā)生在LAM耐藥患者徐東平等對340例CHB患者HBV多位點(diǎn)耐藥相關(guān)突變進(jìn)行檢測分析，結(jié)果顯示，340例患者中，8例（2.4%）檢出ETV病毒學(xué)耐藥相關(guān)突變，且ETV病毒學(xué)耐藥發(fā)生在LAM耐藥基礎(chǔ)上，以T184位點(diǎn)堿基替換最為常見徐東平，等中華肝臟雜志，2008，16：735-738HBV分子診斷替比夫定耐藥現(xiàn)狀替比夫定于2007年2月被SFDA批準(zhǔn)在我國上市查閱CNKI2007年-2009年國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)，因上市時間較短，多為關(guān)于LdT療效的文章，少見有關(guān)CHB患者對LdT耐藥情況的報道。僅1篇文章報道340例CHB患者檢測出1例（0.3%)LdT耐藥相關(guān)突變，變異位點(diǎn)為M204IHBV分子診斷HBV分子診斷

在治療前，應(yīng)制定合理的個體化治療方案治療過程中加強(qiáng)耐藥檢測和隨訪，及時預(yù)防和救治耐藥，進(jìn)一步提高CHB抗病毒的療效HBV耐藥變異的檢測方法1.限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP）方法：

靈敏度低，不可檢測出新位點(diǎn)的變異，操作繁瑣

2.基因芯片方法：

有一定的假陽性和假陰性率，不可檢測出新位點(diǎn)的變異3.熒光定量PCR方法：具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的特點(diǎn)，但目前只有能檢測YMDD的試劑盒定量檢測及YMDD變異檢測試劑盒4.核苷酸序列測定法：

準(zhǔn)確性、敏感性高，是基因突變經(jīng)典的檢測方法，該方法可靠直觀，并可檢測出多位點(diǎn)的變異，可發(fā)現(xiàn)新的變異位點(diǎn)，HBV分子診斷

什么時候進(jìn)行突變檢測？

治療過程中每三個月繼發(fā)性治療失?。ú《就黄疲?/p>

抗病毒治療之初（有無原發(fā)性耐藥？）同時檢測HBV病毒載量惡性腫瘤分子診斷年齡老年、兒童、新生兒

性別身高、體重環(huán)境因素食物/吸煙/合并用藥

合并癥病程

引起藥物反應(yīng)個體差異的機(jī)制器官功能基因型占70%決定因素惡性腫瘤分子診斷鉑類、5-FU、吉西他濱……在血漿中或/和細(xì)胞中的代謝有明確的遺傳學(xué)相關(guān)因素鉑類GSTP1XRCCXPD5-FUTYMSMTHFR伊立替康UGT1A1吉西他濱RRM1紫杉醇CYP1B1ABCB1涉及細(xì)胞毒性作用機(jī)制的化療藥物惡性腫瘤分子診斷基因突變位點(diǎn)突變功能用藥建議GSTP1（鉑類）Val105val(9%)代謝率低療效最好Ile105val(42%)代謝率中等療效居中Ile105Ile(49%)代謝率最高療效最差XRCC1399密碼子（鉑類）Arg399Arg（G/G）反應(yīng)性強(qiáng)常規(guī)劑量Arg精399Gln谷氨酰胺（G/A）反應(yīng)性一般建議加大劑量Gln399Gln（A/A）鉑類抵抗建議換藥XRCC1194密碼子（鉑類）Arg194ArgC/C反應(yīng)性一般建議加大劑量Arg194Trp色C/T反應(yīng)性強(qiáng)常規(guī)劑量Trp194TrpT/T反應(yīng)性強(qiáng)常規(guī)劑量惡性腫瘤分子診斷基因突變位點(diǎn)突變功能用藥建議XPD（鉑類）Asp312Asp天冬（GG）修復(fù)低常規(guī)劑量Asp312Asn天冬酰胺（GA）修復(fù)中等加大劑量Asn312Asn（GA）修復(fù)快換藥UGT1A1*28（依利替康）6TA/6TA潛在正常常規(guī)劑量6TA/7TA有毒副作用減量/換藥7TA/7TA毒副作用增高建議換藥惡性腫瘤分子診斷基因突變位點(diǎn)突變功能MTHFRC677T（5-FU）C/C低有效C/T低有效T/T高有效MTHFRA1298C（5-FU）A/A高有效A/C低有效C/C低有效惡性腫瘤分子診斷基因突變位點(diǎn)突變功能TYMSD（5-FU）+6/+6低有效+6/-6高有效-6/-6高有效TYMSE（5-FU）2R/2R高有效2R/3RC高有效3RC/3RC高有效2R/3RG低有效3RG/3RC低有效3RG/3RG低有效?

藥物靶點(diǎn)基因:細(xì)胞靶向藥物

藥物(小分子/抗體/siRNA)?Kinase?Phosphatase?GPCR?NuclearHormoneReceptor?IonChannel?Protease?mRNA/microRNA：用siRNA可以作用于任意mRNA/microRNA惡性腫瘤分子診斷惡性腫瘤分子診斷

各種靶向藥物主要是單克隆抗體和小分子化合物，在腫瘤治療領(lǐng)域目前主要是：

1、生長因子受體通路抑制劑（EGFR、PDGFR、VEGFR、KRAS、her-2等）

2、血管生長抑制劑

各種靶向藥物個體化治療涉及的基因通路類別商品名英文通用名開發(fā)公司靶點(diǎn)單抗坎帕斯Campath阿侖珠單抗Schering、MillenniumCD52單抗阿瓦斯汀Avastin貝伐珠單抗GenentechVEGF單抗愛必妥Erbitux西妥昔單抗Imclone、Bristol-MyerssguibbEGFR-KRAS單抗麥羅塔Mylotarg吉姆珠單抗WyethCD33單抗?jié)赏揿`Zevalin伊莫單抗CIDEC、PharmaceuticalsCD20單抗美羅華Mabthera利妥昔單抗GenentechCD20單抗百克沙Bexxar托西莫單抗GSKCD20單抗赫賽汀Herceptin曲司珠單抗GenentechHER2小分子化合物格列衛(wèi)Glivec伊馬替尼NovatisSTI571、Bcr-Abl、酪氨酸激酶抑制劑，CD117小分子化合物易瑞沙Iressa吉非替尼AstraZenecaEGFR小分子化合物特羅凱Tarceva厄洛替尼GenentechEGFR腫瘤靶向藥物及作用位點(diǎn)單抗

Panorex依決洛單抗Centocor17-1A單抗

依帕珠單抗ImmunomedicsCD22單抗巰諾莫Verluma諾非單抗

SCLC抗體片段-NR-LU-10-Fab單抗

奧戈伏單抗

CA125小分子化合物多吉美Nexavar索拉菲尼Bayer酪氨酸激酶小分子化合物索坦Sutent舒尼替尼Pfizer酪氨酸激酶小分子化合物

Sprycel達(dá)沙替尼Bristol-Myerssguibb酪氨酸激酶小分子化合物萬珂Velcade硼替佐米

26S蛋白酶體小分子化合物力比泰Alimta培美曲塞EliLilly葉酸小分子化合物

Ixempra伊沙匹隆Bristol-Myerssguibb內(nèi)酰胺類似物小分子化合物

馱瑞塞爾Wyeth

小分子化合物

Tykerb拉帕替尼GSKEGFR/HER-2

恩度

endostar

煙臺麥得津人血管內(nèi)皮抑制素

Vectibix帕尼單抗AmgenEGFR腫瘤靶向藥物及作用位點(diǎn)惡性腫瘤分子診斷抗EGFR-Kras單抗作用機(jī)制EGFR-Kras信號傳導(dǎo)通路

惡性腫瘤分子診斷KRAS基因突變致抗EGFR單抗失效

KRAS位于12號染色體短臂上,編碼35KD蛋白,其參與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展，類似分子開關(guān)野生型:能控制調(diào)控細(xì)胞生長；突變體:多發(fā)生在12、13密碼子突變，導(dǎo)致惡性腫瘤細(xì)胞的生長和擴(kuò)散，并且不受上游表皮生長因子受體（EGFR）的信號影響

惡性腫瘤分子診斷惡性腫瘤分子診斷Coden12-13CodenAminoAcidPhenotypeGGT-GGCGly-Gly甘WTGCT-GGCAla丙-GlyMTGAT-GGCAsp天冬-GlyMTGTT-GGCVal纈

-GlyMTAGT-GGCSer絲-GlyMTCGT-GGCArg精-GlyMTTGT-GGCCys半胱-GlyMTGGT-GACGly-Asp天冬MT公認(rèn)的突變發(fā)生在密碼子12和13，涉及3個核苷酸位點(diǎn)，共有8種形式惡性腫瘤分子診斷2008年6月，在美國臨床腫瘤學(xué)會(ASCO)年會上發(fā)布了最新臨床研究結(jié)果：K-ras突變型患者并不能從抗EGFR治療中獲益,反而徒增不良反應(yīng)危險和治療費(fèi)用而K-ras野生型患者就很有可能從這類藥物治療中獲益2008年10月，K-ras基因突變檢測被寫入最新版(2008年第3版)《美國國立癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)(NCCN)結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐指南》所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者都應(yīng)檢測K-ras基因只有K-ras野生型患者才建議接受EGFR抑制劑（如西妥昔單抗和帕尼單抗）治療

國內(nèi)近40家檢測中心已完成1000例K-ras基因檢測，發(fā)現(xiàn)其中65.9%為野生型比國外偏低西妥昔單抗（愛必妥）+化療治療惡性腫瘤分子診斷KRAS突變檢測方法PCR-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-SSCP)突變等位基因特異性擴(kuò)增(MASA)快速擴(kuò)增(SMAP-2)DNA測序惡性腫瘤分子診斷惡性腫瘤分子診斷DNA測序

檢測KRAS基因突變對判斷腫瘤的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后以及治療效果具有重要意義正常人中檢出KRAS基因異常，提示存在腫瘤易感性良性腫瘤患者若檢出KRAS基因突變，提示有惡變的可能KRAS基因突變陽性，即使病理組織學(xué)診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性，癌癥復(fù)發(fā)的可能性也很高個體性治療的極佳選擇指標(biāo)惡性腫瘤分子診斷惡性腫瘤分子診斷EGFR基因檢測EGFR是一種細(xì)胞膜表面的糖蛋白受體，具有酪氨酸激酶活性，是原癌基因C—erb一1(HER一1)的表達(dá)產(chǎn)物，是表皮生長因子受體（HER）家族成員之一。它由1186個氨基酸殘基組成，分子量為70000M，EGFR可分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)3部分研究表明在許多實(shí)體腫瘤中存在EGFR的高表達(dá)或異常表達(dá)。EGFR與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)

EGFR作為腫瘤治療中的靶點(diǎn)惡性腫瘤分子診斷EGFR激活及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模式圖MAPK途徑

IKK途徑

惡性腫瘤分子診斷全新概念：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)干預(yù)治療即通過單克隆抗體、免疫毒素、酪氨酸激酶抑制劑、反義核苷酸等物質(zhì)，針對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)生異常的環(huán)節(jié)來干預(yù)這種不正常的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而達(dá)到抑制腫瘤生長的目的。目前針對于EGFR最常見的治療方式:單克隆抗體－與EGFR結(jié)合，競爭和阻斷EGF、TGFα等配體的結(jié)合，從而達(dá)到特異性抑制腫瘤生長之目的酪氨酸激酶抑制劑－EGFR酪氨酸激酶抑制劑可分為兩大類：一類為非特異性酪氨酸激酶抑制劑，能抑制所有的酪氨酸激酶；另一類為目前使用較多的選擇性EGFR酪氨酸激酶抑制劑，如吉非替尼和厄洛替尼等。

惡性腫瘤分子診斷酪氨酸激酶抑制劑的作用機(jī)制模式圖

惡性腫瘤分子診斷易瑞沙（吉非替尼/阿斯利康）和特羅凱（厄羅替尼/羅氏制藥）作為表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，是美國FDA批準(zhǔn)用于NSCLC靶向治療的主要藥物。大量臨床試驗(yàn)表明，易瑞沙和特羅凱僅對30%~40%的非小細(xì)胞肺癌病人有顯著療效。但是，對具備EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌病人而言，這兩種藥物治療有效率可高達(dá)90%，而對表皮生長因子受體基因不存在突變的非小細(xì)胞肺癌病人，這兩種藥物的治療有效率低，甚至無。

因此，檢測EGFR基因突變對于指導(dǎo)NSCLC病人臨床用藥具有重要的參考價值

惡性腫瘤分子診斷EGFR常見突變位點(diǎn)

EGFR第18外顯子片段長度為437bp，核苷酸2155G＞A突變（G719S）EGFR第19外顯子片斷長度為411bp，主要突變有：核苷酸2235-2249Del（E746－A750del）核苷酸2236-2250Del（E746－A750del）核苷酸2254-2277Del（S752－I759del）EGFR第21外顯子，片段長度為399bp，主要突變有：核苷酸2576T－G（L858R）核苷酸2497T－G（L833V）核苷酸2504A－T（H835L）核苷酸2556位插入堿基G（q852）惡性腫瘤分子診斷EFGR基因突變檢測方法特異性位點(diǎn)PCR特點(diǎn)：特異性和靈敏性高，但只能針對已知的突變位點(diǎn)設(shè)計特異引物進(jìn)行檢測，易污染熒光實(shí)時定量PCR特點(diǎn)：準(zhǔn)確性、敏感性高，無污染，只能針對已知的突變位點(diǎn)PCR-SSCP特點(diǎn)：能夠檢測出比DNA測序法更多的突變數(shù)，成本較低，受實(shí)驗(yàn)條件影響較大，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差高效液相色譜法特點(diǎn)：較高的靈敏度和特異度、標(biāo)本組織的要求降低，但不能判斷具體的突變位點(diǎn)DNA測序法特點(diǎn)：檢測EGFR基因突變“金標(biāo)準(zhǔn)”惡性腫瘤分子診斷EFGR基因突變檢測意義采用表皮生長因子受體（EGFR）基因突變狀態(tài)作為預(yù)測分子標(biāo)志物，指導(dǎo)EGFR-酪氨酸激酶抑制劑（TKI）針對EGFR的靶向個體化治療對于EGFR突變陰性者：EGFR-TKI治療無效對于EGFR突變陽性者：EGFR-TKI是無可替代的治療選擇（吉非替尼和厄羅替尼）

惡性腫瘤分子診斷HER2基因檢測HER2：是表皮生長因子受體（EGFR）家族成員；

是一種原癌基因，位于17q21，編碼相對分子質(zhì)量185KD的跨膜糖蛋白（跨膜酪氨酸激酶受體）；

研究表明：30％以上的人類腫瘤中存在HER2基因的擴(kuò)增/過度表達(dá)（如乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、輸卵管癌、胃癌和前列腺癌等）；其中20％－30％的原發(fā)性浸潤性乳腺癌有HER2基因的擴(kuò)增/過度表達(dá)。惡性腫瘤分子診斷HER2的擴(kuò)增和過度表達(dá)惡性腫瘤分子診斷HER-2檢測方法

免疫組織化學(xué)(IHC)--HER2蛋白的表達(dá)熒光原位雜交(FISH)--HER2基因的擴(kuò)增顯色原位雜交(CISH)--HER2基因的擴(kuò)增

惡性腫瘤分子診斷

美國FDA批準(zhǔn)的檢測Her2方法：

IHC法測定Her2過表達(dá)

FISH法定量檢測Her2基因擴(kuò)增惡性腫瘤分子診斷●HER2IHC評分3+的病例CISH擴(kuò)增率在90％以上;而IHC2+的病例CISH擴(kuò)增率為56.5％，IHC與CISH檢測結(jié)果符合率為81.2％●對于國內(nèi)赫賽汀治療患者的篩選最好以IHC作為初篩，IHC2+再做FISH或CISH進(jìn)一步證實(shí)惡性腫瘤分子診斷HER2的臨床診斷意義：HER2作為乳腺癌預(yù)后的判斷指標(biāo)HER2作為治療的靶點(diǎn)，根據(jù)其表達(dá)情況指導(dǎo)治療其它腫瘤HER-2的情況

丙型肝炎的分子診斷丙肝病毒定量丙肝病毒分型丙肝病毒載量分析確定丙肝病毒感染的直接證據(jù)評價療效的重要指標(biāo)丙型肝炎病毒基因型分析HCV的基因型/亞型6個型，68個亞型1a,b,c,d,e,f,g,h,i,j,k,l,m2a,b,c,d,e,f,g,h,i,k,l,m3a,b,c,d,e,f,g,h,i,k4a,c,d,e,f,g,h,k,l,m,n,o,p,q,r,s,t5a6a,b,d,f,g,h,i,j,k,l,m,n基因型與干擾素的反應(yīng)性

2a、2b、3a型對α-干擾素有明顯的長期有效性，而1b型的反應(yīng)性較差。歐美國家流行毒株多為1a型（Ⅰ或PT型），我國丙型肝炎流行毒株以1b型(Ⅱ或K1)、2a型(Ⅲ或K2a型)、6a型為主。HCV基因型與臨床病情

1b型病毒易使患者導(dǎo)致肝硬化和肝癌；

1b型較非1b型易導(dǎo)致嚴(yán)重疾病。結(jié)核病的分子診斷分支桿菌菌種鑒定結(jié)核桿菌耐藥檢測分枝桿菌菌種鑒定

我國分枝桿菌感染11.1%是NTM(非結(jié)核分枝桿菌)。結(jié)核和NTM有相似的臨床表現(xiàn)，但對于不同藥物敏感性不同。目前關(guān)于NTM準(zhǔn)確診斷的呼聲越來越高。全球1/3的人已感染結(jié)核桿菌，活動性肺結(jié)核病人約2000萬，每年新發(fā)結(jié)核病人約800-1000萬，每年約有300萬人死于結(jié)核病。結(jié)核病已成為全世界成人因傳染病而死亡的主要疾病之一。中國是全球22個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，活動性肺結(jié)核病人數(shù)居世界第2位。結(jié)核桿菌感染率為44.5%，約5.5億人已感染結(jié)核桿菌。結(jié)核病死亡人數(shù)為各種其他傳染病和寄生蟲病死亡總和的2倍。長期以來結(jié)核病之所以難以控制，其中一個主要的原因就是缺乏快速、準(zhǔn)確的診斷方法，傳統(tǒng)方法耗時長，準(zhǔn)確度低，導(dǎo)致不能及時治療或過度用藥，另外結(jié)核分枝桿菌以外的分枝桿菌引發(fā)的肺部疾病越來越成為人們關(guān)注的課題。隨著艾滋病發(fā)病率的升高，艾滋病毒與分支桿菌復(fù)合感染的病例也越來越多，根據(jù)臨床發(fā)現(xiàn)其中很大一部分都是NTM。僅僅依據(jù)涂片抗酸菌陽性來診斷結(jié)核病，有可能將部分非結(jié)核分枝桿菌診斷為結(jié)核病。對臨床難治的病例應(yīng)進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定，為治療提供參考。非結(jié)核分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌的臨床表現(xiàn)相似，但是其抗結(jié)核一線藥物的不敏感率非常高，同時對異煙肼和利福平的不敏感率達(dá)83.7%。為什么進(jìn)行分支桿菌分型？結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測快速檢測MDR-TB可以指導(dǎo)合理用藥；預(yù)防發(fā)生進(jìn)一步耐藥；預(yù)防MDR-TB的流行。我國第四次全國結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查顯示，近1/3結(jié)核病人為耐藥病人，1/10以上病人為耐多藥結(jié)核。RFP（利福平）INH（異煙肼）SM（鏈霉素）EMB（乙胺丁醇）PZA（吡嗪酰胺）喹諾酮類已確定的耐藥的抗結(jié)核藥物結(jié)核分枝桿菌(TB)

的耐藥監(jiān)測

耐利福平：突變一般發(fā)生在RNA聚合酶B亞單位編碼基因（rpoB基因）突變位點(diǎn)：531位絲氨酸亮氨酸

526位組氨酸酪氨酸突變導(dǎo)致RFP不能與RNA聚合酶B亞單位結(jié)合耐異煙肼：與三種基因突變有關(guān)katG基因（突變位點(diǎn)：463位精氨酸亮氨酸）inhA基因（突變位點(diǎn)：94位絲氨酸丙氨酸）ahpC基因結(jié)核分枝桿菌(TB)

的分子診斷

耐藥監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物耐藥基因分析SSCP（單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析）RFLP（限制性片段長度多態(tài)性分析）DNA序列分析基因芯片耐藥基因的檢測方法結(jié)核分枝桿菌(TB)

的分子診斷

耐藥監(jiān)測性傳播疾病的熒光定量檢測1.沙眼衣原體（CT）2.淋球菌（NG）3.人乳頭瘤病毒（HPV6/11型）4.解脲支原體（UU）白血病融合基因利用RT-PCR或realtimePCR技術(shù)的

白血病融合基因檢查

1、Bcr-abl融合基因檢查

2、AML1－EVI1融合基因檢查

3、PML-RARA融合基因檢查

4、DEK－CAN融合基因檢查

5、AML1-MTG8融合基因檢查

6、E2A－PBX1融合基因檢查

家族性乳腺癌基因的基因突變檢查包括：

1、