第三章-抗體的制備與純化技術(shù)

大家下午好！

第二篇分子免疫學(xué)技術(shù)授課內(nèi)容一、特異性抗體的制備與純化技術(shù)二、蛋白質(zhì)研究水平的分子免疫學(xué)技術(shù)四、基因組和蛋白質(zhì)組研究水平的分子免疫學(xué)技術(shù)授課方式：講授、自學(xué)、演示相結(jié)合三、DNA研究水平的分子免疫學(xué)技術(shù)第三章特異性抗體的制備與純化技術(shù)緒論特異性抗體：多克隆抗體（抗血清）單克隆抗體（雜交瘤技術(shù)）基因工程抗體第一節(jié)多克隆抗體的制備與純化多克隆抗體：由某一抗原刺激機(jī)體后產(chǎn)生的抗體，實(shí)際上為針對(duì)該抗原分子表面不同抗原決定簇的抗體的混合物，即多克隆抗體。多克隆抗體（抗血清）的制備流程

抗原半抗原+載體

佐劑免疫動(dòng)物（3-5次）

測(cè)效價(jià)

動(dòng)物采血，分離血清

抗血清純化、鑒定、保存一、抗原制備1、抗原的制備

1）細(xì)胞性抗原或顆粒性抗原：細(xì)胞性抗原主要包括人、動(dòng)物的細(xì)胞，還有細(xì)菌、螺旋體及寄生蟲等。如菌體（O）抗原的制備：選擇標(biāo)準(zhǔn)菌株，接種于斜面或平板培養(yǎng)基表面；置溫箱37℃

培養(yǎng)24h，用適量的無菌生理鹽水刮下菌苔，移入無菌含有玻璃珠的三角瓶中，充分搖勻菌體；100℃

水裕2～2.5h殺菌并破會(huì)鞭毛抗原。取處理過的菌液，檢測(cè)有無活菌的存在，合格后用無菌生理鹽水稀釋成每毫升8億～10億個(gè)細(xì)菌，加入苯酚至最終濃度為5％，即為O抗原。

2）可溶性抗原

可溶性抗原主要包括蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、脂多糖、酶、補(bǔ)體、細(xì)菌外毒素、核酸等。它們大多數(shù)來源組織細(xì)胞，成分復(fù)雜。制備這類抗原時(shí)，首先需將組織和細(xì)胞破碎，然后再?gòu)慕M織和細(xì)胞勻漿中提取目的成分，提純后的抗原需鑒定后才能用做免疫原。

（1）組織勻漿的制備：所有的組織必須是新鮮的或低溫保存的。器官或組織獲得后立即去除表面的包膜或結(jié)締組織以及大血管，在4℃水浴或冰浴中將洗凈的組織剪成小塊，加入適量生理鹽水，裝入搗碎機(jī)破碎制成組織勻漿。

（2）細(xì)胞破碎：提取細(xì)胞可溶性抗原，需將細(xì)胞破碎，常用方法有冷熱交替法、超聲破碎法，反復(fù)凍融法、自溶法和酶處理法等。超聲破碎：一次超聲1～2min，總時(shí)間為10～15min。（3）蛋白提純

①

超速離心法：常用密度梯度介質(zhì)有蔗糖、甘油、CsCl；②選擇性沉淀法（鹽析沉淀法）：其原理是根據(jù)蛋白質(zhì)理化特性的差異，采用各種沉淀劑或改變某些條件促使蛋白質(zhì)抗原成分沉淀，從而達(dá)到純化的目的。如選用33～50％飽和度的硫酸胺收集沉淀物；③凝膠層析法（分子篩層析）：蛋白質(zhì)分子按大小被分離；④離子交換層析；帶電的生物大分子和離子交換色譜填料上的離子基團(tuán)進(jìn)行交換而被分離純化。以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離

⑤親和層析：利用生物大分子的生物特異性如抗原抗體、激素受體、IgG和葡糖球菌蛋白蛋白A（SPA）；⑥制備電泳技術(shù)。

⑦其它聚丙烯酰胺凝膠膠內(nèi)蛋白

可將抗原所在的電泳條帶（或蛋白點(diǎn)）切下,研磨后直接用以動(dòng)物免疫。NC膜結(jié)合蛋白

將含目的分子的蛋白進(jìn)行SDS電泳，轉(zhuǎn)移至NC膜上，麗春紅顯色至清晰顯示目的條帶，取目的條帶置于加有PBS的1.5ml離心管中，用PBS洗至無色，繼而剪碎、研磨，用于動(dòng)物免疫。（4）純化抗原的鑒定含量測(cè)定：采用常規(guī)蛋白或糖類濃度測(cè)定法，一般采用分光光度計(jì)測(cè)量法；相對(duì)分子量的鑒定：一般采用SDS電泳法；純度鑒定：常用區(qū)帶電泳法鑒定。3）半抗原半抗原物質(zhì)多數(shù)為低分子質(zhì)量的物質(zhì)，如：多糖、多肽、甾體激素、脂肪胺、類脂質(zhì)、核酸、某些藥物及其它化學(xué)藥品；常用載體：蛋白質(zhì)類如：牛血清白蛋白、人血清清蛋白、兔血清清蛋白等。多肽聚合物：如多聚Lys

大分子聚合物：如羥甲基纖維素；半抗原－載體連接方法：常用物理法和化學(xué)法，物理吸附的載體有羥甲基纖維素等，其借助電荷和微孔吸附半抗原，化學(xué)法則是利用某些功能基團(tuán)把半抗原連接到載體上。

2.佐劑

1）定義：與抗原同時(shí)或預(yù)先注射于機(jī)體能增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答或改變免疫類型的物質(zhì).2）良好的佐劑應(yīng)當(dāng)具備以下條件：（1）增加抗原的表面積，并改變抗原的活性基團(tuán)構(gòu)型，從而增強(qiáng)抗原的免疫原性；（2）佐劑與抗原混合能延長(zhǎng)抗原在局部組織的存留時(shí)間，降低抗原的分解速度，使抗原緩慢釋放至淋巴系統(tǒng)中，持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗體；（3）佐劑可以直接或間接激活免疫活性細(xì)胞并使之增生，從而增強(qiáng)了體液免疫；（4）具有無毒性或副作用低的特點(diǎn)。3）常用佐劑的種類和制備應(yīng)用最多的是福氏佐劑和細(xì)胞因子佐劑

福氏佐劑：不完全佐劑:液體石蠟+羊毛脂完全佐劑:液體石蠟+羊毛脂+卡介苗福氏佐劑：抗原=1：1乳化成“油包水”乳液（乳化方法主要有研磨法和注射器混合法）。完全佐劑一般不連續(xù)2次使用

細(xì)胞因子佐劑

IL-2IL-1IFNrCSF等二、免疫血清的制備1、免疫動(dòng)物的選擇和飼養(yǎng)選擇動(dòng)物:哺乳類和禽類

1)適齡、健壯、無感染

2）抗原與免疫動(dòng)物種屬關(guān)系：差異越遠(yuǎn)越好

3）抗血清量的需要：量大，選用馬、羊等大動(dòng)物，量小，選用兔、豚鼠

4）實(shí)驗(yàn)考慮：如要利用所制備的抗體進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，則不同種屬的抗體與蛋白A（SPA）的結(jié)合能力不一樣，如人IgG、兔IgG、豬IgG

、狗IgG

、貓IgG

、驢IgG等與蛋白A強(qiáng)烈結(jié)合，而羊IgG、牛IgG等與蛋白A較弱結(jié)合，雞IgG不能與蛋白A結(jié)合。

5）抗血清分為R（rabbit）型和H（horse）型，R型免疫血清具有較寬的等價(jià)帶，適于做診斷試劑；H型免疫血清等價(jià)帶較窄，一般用于做免疫治療。2、免疫方法

劑量：合適，太大，易引起免疫耐受途徑：多用皮內(nèi)或皮下多點(diǎn)注射（足掌、背部?jī)蓚?cè)）腋窩淋巴結(jié)直接注射靜脈、腹腔注射間隔時(shí)間：第一次免疫（完全佐劑）

10-20天第二次免疫（不完全佐劑）

7-10天第三次，總次數(shù)5-8次。3、免疫血清采集、分離及保存1）采血前測(cè)抗體效價(jià)在第2次加強(qiáng)免疫后2周，從兔耳緣靜脈取2～3ml血，制備血清，檢測(cè)抗體效價(jià)。如未達(dá)到預(yù)期效價(jià)，需再進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直到滿意時(shí)為止。當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到預(yù)期水平時(shí)，即可放血制備抗血清。

抗血清的效價(jià)：就是指血清中所含抗體的濃度或含量。效價(jià)測(cè)定的方法常用的是放射免疫法，此法對(duì)所有的抗體均適用。某些由大分子（如蛋白類）抗原所產(chǎn)生的抗體，可用雙向擴(kuò)散等方法測(cè)定。前者測(cè)定的效價(jià)極為精確。而后者則粗糙得多。放射免疫法：

以不同稀釋度的抗血清與優(yōu)質(zhì)標(biāo)記抗原（放射性核素標(biāo)記）混合，孵育24h后，測(cè)定其結(jié)合率（用液體閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)定Ag*－Ab或游離Ag*）。通常以結(jié)合率為50%的血清稀度為效價(jià)。如某抗血清的結(jié)合率為50%時(shí)的稀釋度為1：15000，則該血清的效價(jià)就是1：15000。抗血清的效價(jià)，除由抗血清本身的性質(zhì)決定外，還受標(biāo)記抗原的質(zhì)量、孵育時(shí)間，所用稀釋液的成分及其pH等因素的影響，在工作中必須引起注意。

雙向擴(kuò)散法：利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴(kuò)散，兩者在相交處產(chǎn)生沉淀線，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。

瓊脂板的制備：100mlpH7.1的磷酸鹽緩沖液加到15g的瓊脂內(nèi)，于水浴中加溫，攪拌，使瓊脂完全溶解，趁熱用紗布過濾，待溶液冷卻到65℃左右時(shí)，加入疊氮鈉（NaN3），使其在溶液中的濃度為0.1%。用移液管把瓊脂放在干凈平皿或玻片上，約3mm厚，待其冷卻，完全凝固后，用打孔器打孔。中央孔內(nèi)加適量抗原（容量為50μl），周圍各孔內(nèi)分別加入50μl1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀釋的抗血清，37℃下孵育24h，觀察有無沉淀線產(chǎn)生，以判斷血清的稀釋度。2）抗血清的采集、分離和保存采集：頸動(dòng)脈放血、心臟采血、靜脈采血分離：室溫自然凝固1～2h，然后放4℃冰箱過夜，待血塊收縮后分離血清，有些血清須經(jīng)56℃30min使補(bǔ)體滅活。保存：4℃保存—存放3個(gè)月至半年低溫保存—2至3年，忌反復(fù)凍融冰凍干燥—4-5年3）免疫失敗的可能原因及應(yīng)采取的措施有時(shí)不能獲得滿意的抗血清，可從下列幾方面找原因，并改進(jìn)之。

（1）免疫動(dòng)物的種屬及品系是否合適，可考慮改變動(dòng)物的種屬或品系，或擴(kuò)大免疫動(dòng)物的數(shù)量。

（2）抗原質(zhì)量是否良好，可改用其它廠家的產(chǎn)品或改用同一廠家的其它批號(hào)，也可考慮改變抗原分子的部分結(jié)構(gòu)，或改進(jìn)提取方法。

（3）制備的免疫原是否符合要求，可從偶聯(lián)劑，載體、抗原或載體的比例、反應(yīng)時(shí)間等多方面去考慮，并加以改進(jìn)。

（4）所用的佐劑是否合適，乳化是否完全，可改用其它佐劑，或加強(qiáng)乳化。

（5）免疫的方法、劑量，加強(qiáng)免疫的間隔時(shí)間和次數(shù)，免疫的途徑是否合適。

（6）動(dòng)物的飼養(yǎng)是否得當(dāng)，如營(yíng)養(yǎng)（飼料、飲水）、環(huán)境衛(wèi)生（通風(fēng)、采光、溫度）是否符合要求，動(dòng)物的健康情況是否良好等。

三、抗體的純化和鑒定1、目的：盡量除去抗血清中與目的抗體不相關(guān)的成分2、純化方法1）單價(jià)特異性抗血清的純化單價(jià)特異性是指抗血清只與其特異性抗原發(fā)生反應(yīng)。去除雜抗體主要方法：親和層析法（將引起交叉反應(yīng)的共同抗原交聯(lián)到Sepharose4B柱上，把要處理的抗血清通過親和層析柱，共同抗體吸附在柱上，洗脫液則含有特異性抗體）；

吸附法（指將非特異性抗原液與戊二醛制備成固相吸附劑按1：10直接加到免疫血清中去除雜抗體）硫酸銨鹽析：先用50%飽和度去除白蛋白，再用2次33%飽和度沉淀丙種球蛋白。離子交換層析：常用的離子交換劑有DEAE纖維素和QAE纖維素。以QAE-Sephadex最理想。能吸附血清中多種蛋白質(zhì)，但不能吸附IgG.親和層析法：將純抗原（或SPA)交聯(lián)到Sepharose4B，裝柱后，將抗血清通過親和層析柱，特異性吸附IgG。凝膠過濾法：分子篩層析2）特異性IgG類抗體的純化3、抗體鑒定抗體效價(jià)的鑒定；如雙向擴(kuò)散等抗體特異性鑒定：用交叉反應(yīng)率來表示；抗體純度鑒定：可用PAGE電泳或SDS電泳鑒定；抗體親和力鑒定：抗體親和力是指抗原、抗體結(jié)合牢固的程度。親和力越大表示抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合越牢固?？贵w親和力大小常以親和常數(shù)K表示，K的單位是升/摩爾。在RIA（放射免疫技術(shù)）測(cè)定時(shí)，K是該抗血清能達(dá)到的最小檢出量的倒數(shù)。K的范圍在108～1012L/mol之間。

四.多克隆抗體的應(yīng)用與問題一）應(yīng)用免疫學(xué)檢測(cè)被動(dòng)免疫治療和緊急預(yù)防二）存在問題

特異性差,用于免疫學(xué)檢測(cè)容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)

第二節(jié)單克隆抗體

(Monoclonalantibody,McAb)一.概念:

通過B細(xì)胞雜交瘤技術(shù),獲得特異性針對(duì)某一種抗原決定簇的細(xì)胞克隆，產(chǎn)生均一性的抗體.二.B細(xì)胞雜交瘤的類型

小鼠-小鼠大鼠-大鼠小鼠-人人-人

三雜交瘤技術(shù)的原理

1.親本細(xì)胞的選擇

小鼠骨髓瘤細(xì)胞次黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶

(HGPRT)缺陷型

免疫脾細(xì)胞經(jīng)抗原免疫的BALB/c小鼠的脾臟（抗原制備方法同多克隆抗體制備方法）BALB/c小鼠簡(jiǎn)介

1913年，貝格(Bagg)從美國(guó)商人歐希爾(Ohio)處購(gòu)得的白化小鼠原種，以群內(nèi)方法繁殖。麥克·多威爾(MacDowell)在1923年開始作近交系培育，至1932年達(dá)26代，命名為BALB/c品系。安德爾文特(Andervont)等人使BALB/c廣為傳播和應(yīng)用。1985年我國(guó)從美國(guó)NIH引進(jìn)到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，為BALB/c第180代。

毛色：白化。

主要特性：①乳腺腫瘤自然發(fā)生率低，但用乳腺腫瘤病毒誘發(fā)時(shí)發(fā)病率高;卵巢、腎上腺和肺的腫瘤在該小鼠有一定的發(fā)生率。②易患慢性肺炎。③對(duì)放射線甚為敏感。④與其他近交系相比，肝、脾與體重的比值較大。20月齡的雄鼠脾臟有淀粉樣變。⑤有自發(fā)高血壓癥，老年鼠心臟有病變，雌雄鼠均有動(dòng)脈硬化。⑥對(duì)鼠傷寒沙門氏菌補(bǔ)體敏感，對(duì)麻疹病毒中度敏感。對(duì)利什曼原蟲屬、立克次氏體和百日咳組織胺易感因子敏感。

主要用途：廣泛地應(yīng)用于腫瘤學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)、核醫(yī)學(xué)研究，以及單克隆抗體的制備等。

2.細(xì)胞融合骨髓瘤細(xì)胞

PEG

脾細(xì)胞融合后細(xì)胞的類型:

未融合的脾細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞未融合的瘤細(xì)胞

雜交瘤細(xì)胞3雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)

DNA合成的途徑：糖+氨基酸氨基喋呤

(Aminopterin,A)

TK核苷酸DNA

胸腺嘧啶核苷TMP(Thymidine,T)

核苷酸前體

次黃嘌呤

HGPRTIMP(Hypoxanthine,H)融合后細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基[次黃嘌呤（hypoxanthine）、氨甲蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶核苷（thymidine），故名HAT培養(yǎng)基]中存活情況（脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)PEG處理后，形成多種細(xì)胞的混合體，只有脾細(xì)胞與骨髓細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞才有意義。在HAT選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)時(shí)，由于骨髓瘤細(xì)胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶，故不能生長(zhǎng)繁殖，而雜交瘤細(xì)胞具有上述兩種酶，在HAT選擇培養(yǎng)液可以生長(zhǎng)繁殖。）脾細(xì)胞（HGPRT+,TK+,不能長(zhǎng)期生長(zhǎng)）骨髓瘤細(xì)胞（HGPRT-,TK-，不能生長(zhǎng)）雜交瘤細(xì)胞（HGPRT+,TK+

，能夠生長(zhǎng)）4.雜交瘤細(xì)胞的篩選和克隆化

1）篩選：

在用HAT選擇培養(yǎng)1～2天內(nèi)，將有大量瘤細(xì)胞死亡，3～4天后瘤細(xì)胞消失，雜交細(xì)胞形成小集落，HAT選擇培養(yǎng)液維持7～10天后應(yīng)換用HT培養(yǎng)液，再維持2周，改用一般培養(yǎng)液。在上述選擇培養(yǎng)期間，雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1/10面積時(shí)，即可開始檢測(cè)特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。在選擇培養(yǎng)期間，一般每2～3天換一半培養(yǎng)液。

檢測(cè)抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡(jiǎn)便、特異、敏感的方法為原則。

常用的方法有：（1）放射免疫測(cè)定（RIA）可用于可溶性抗原、細(xì)胞McAb的檢測(cè)。（2）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）可用于可溶性抗原、細(xì)胞和病毒等McAb的檢測(cè)。（3）免疫熒光試驗(yàn)適合于細(xì)胞表面抗原的McAb的檢測(cè)。2）克隆化雜交瘤克隆化一般是指將抗體陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化。因?yàn)榻?jīng)過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個(gè)孔內(nèi)只有一個(gè)克隆。在實(shí)際工作中，可能會(huì)有數(shù)個(gè)甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞、所需要的抗體（特異性抗體）分泌細(xì)胞和其它無關(guān)抗體的分泌細(xì)胞。要想將這些細(xì)胞彼此分開就需要克隆化?？寺』脑瓌t是，對(duì)于檢測(cè)抗體陽(yáng)性的雜交克隆盡早進(jìn)行克隆化，否則抗體分泌的細(xì)胞會(huì)被抗體非分泌的細(xì)胞所抑制，因?yàn)榭贵w非分泌細(xì)胞的生長(zhǎng)速度比抗體分泌的細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，二者競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果會(huì)使抗體分泌的細(xì)胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細(xì)胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。

克隆化的方法主要有：有限稀釋法、單個(gè)細(xì)胞顯微操作法、軟瓊脂培養(yǎng)法有限稀釋法克隆

（1）克隆前1天制備飼養(yǎng)細(xì)胞層（同細(xì)胞融合）。

（2）將要克隆的雜交瘤細(xì)胞從培養(yǎng)孔內(nèi)輕輕吹干，計(jì)數(shù)。

（3）調(diào)整細(xì)胞為3～10個(gè)細(xì)胞/ml。

（4）取頭天準(zhǔn)備的飼養(yǎng)細(xì)胞層的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入稀釋細(xì)胞100μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中

。

（5）在第7天換液，以后每2～3天換液1次。

（6）8～9天可見

細(xì)胞克隆形成，及時(shí)檢測(cè)抗體活性。

（7）將陽(yáng)性孔的細(xì)胞移至24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)。

（8）每個(gè)克隆應(yīng)盡快凍存。

軟瓊脂培養(yǎng)法克隆

（1）軟瓊脂的配制：含有20%NCS（小牛血清）的2倍濃縮的RPMI1640。

①1%瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預(yù)熱。

②0.5%瓊脂：由1份1%瓊脂加1份含20%小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42℃保溫。

（2）用上述0.5%瓊脂液（含有飼養(yǎng)細(xì)胞）15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。

（3）按100/ml，500/ml或5000/ml等濃度配制需克隆的細(xì)胞懸液。

（4）1ml0.5%瓊脂液（42℃預(yù)熱）在室溫中分別與1ml不同濃度的細(xì)胞懸液相混合。

（5）混勻后立傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10min，使其凝固，孵育于37℃、5%CO2孵箱中。

（6）4～5天

后即可見針尖大小白色克隆，7～10天后，直接移種至含飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔中進(jìn)行培養(yǎng)。

（7）檢測(cè)抗體，擴(kuò)大培養(yǎng)，必要是地再克隆化。

5.單克隆抗體的生產(chǎn)

大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：

（1）體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從上清液中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液內(nèi)抗體含量為10～60μg/ml,如果大量生產(chǎn)，費(fèi)用較高。

（2）體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水或血清。

①實(shí)體瘤法：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞按1～3×107/ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2ml,共2～4點(diǎn)。待腫瘤達(dá)到一定大小后（一般10～20天）則可采血，從血清中獲得單克隆

抗體的含量可達(dá)到1～10mg/ml。但采血量有限。

②腹水的制備：常規(guī)是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液體石蠟于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動(dòng)物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲5～10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)到5～10mg/ml，這是目前最常用的方法，還可將腹水中細(xì)胞凍存起來，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水塊、量多。

6.單克隆抗體的純化硫酸銨沉淀法離子交換層析

A蛋白-Sepharose親和層析7、單克隆抗體的鑒定對(duì)制備的McAb進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的，應(yīng)做下述幾個(gè)方面的鑒定：

1）抗體特異性的鑒定：除用免疫原（抗原）進(jìn)行抗體的檢測(cè)外，還應(yīng)該用與其抗原成分相關(guān)的其它抗原進(jìn)行交叉試驗(yàn)，方法可用ELISA、IFA法。例如：①制備抗黑色素瘤細(xì)胞的McAb，除用黑色素瘤細(xì)胞反應(yīng)外，還應(yīng)該用其它臟器的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞進(jìn)行交叉反應(yīng)，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體。②制備抗重組的細(xì)胞因子的單克隆抗體，應(yīng)首先考慮是否與表達(dá)菌株的蛋白有交叉反應(yīng)，其次是與其它細(xì)胞因子間有無交叉。

2）McAb的Ig類與亞類的鑒定：一般在用酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行篩選時(shí)已經(jīng)基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測(cè)出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類血清系統(tǒng)作雙擴(kuò)或夾心ELISA來確定。在作雙擴(kuò)試驗(yàn)時(shí)，如加入適量的PEG（3%），更有利于沉淀線的形成。

3）McAb中和活性的鑒定：用動(dòng)物或細(xì)胞的保護(hù)實(shí)驗(yàn)來確定McAb的生物學(xué)活性。例如，如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時(shí)接種于易感的動(dòng)物或敏感的細(xì)胞，來觀察動(dòng)物或細(xì)胞是否得到抗體的保護(hù)。

4）McAb識(shí)別抗原表位的鑒定：用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)，測(cè)相加指數(shù)的方法，測(cè)定McAb所識(shí)別抗原位點(diǎn)，來確定McAb的識(shí)別的表位是否相同。

5）McAb親合力的鑒定：用ELISA或RIA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)來確定McAb與相應(yīng)抗原結(jié)合的親合力。

8、影響因素、失敗原因分析

由于制備McAb的實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，環(huán)節(jié)多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會(huì)造成失敗。其主要失敗原因和影響因素有:

1.污染：包括細(xì)菌、霉菌和支原體的污染。這是雜交瘤工作中最辣手的問題。一旦發(fā)現(xiàn)有霉菌污染就應(yīng)及早將污染板棄之，以免污染整個(gè)培養(yǎng)環(huán)境。支原體的污染主要來源于牛血清，此外，其它添加劑、實(shí)驗(yàn)室工作人員及環(huán)境也可能造成支原體污染。在有條件的實(shí)驗(yàn)室，要對(duì)每一批小牛血清和長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)的細(xì)胞系進(jìn)行支原體的檢查，查出污染源應(yīng)及時(shí)采取措施處理。對(duì)于污染的雜交瘤細(xì)胞可以采取生物學(xué)的過濾方法，將污染的雜交瘤細(xì)胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待長(zhǎng)出腹水或?qū)嶓w瘤時(shí)，取出分離雜交瘤細(xì)胞，一般可除去支原體污染。

2.融合后雜交瘤不生長(zhǎng)：在保證融合技術(shù)沒有問題的前提下主要考慮下列因素①PEG有毒性或作用時(shí)間過長(zhǎng)。②牛血清的質(zhì)量太差，用前沒有進(jìn)行嚴(yán)格的篩選。③骨髓瘤細(xì)胞污染了支原體。④HAT有問題，主要是A含量過高或HT含量不足。

3.雜交