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文檔簡介
實(shí)驗(yàn)三大腸桿菌感受態(tài)的制備(CaCl2法)1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.實(shí)驗(yàn)原理3.實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑4.實(shí)驗(yàn)步驟
5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>
學(xué)習(xí)CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)原理
受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法(如電擊法、CaCl2等化學(xué)試劑法)的處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變,成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞(Compenentcells)。進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制,表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移,使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng),即可篩選出轉(zhuǎn)化子(Transformant,即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞)。實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑1.超凈工作臺(tái)2.低溫離心機(jī)3.恒溫?fù)u床4.恒溫培養(yǎng)箱5.-70℃冰箱6.制冰機(jī)7.移液器50ul、200ul、1000ul(二)材料大腸桿菌DH5α(Top10)。(三)試劑
1.LB液體培養(yǎng)基2.0.1mol/LCaCl2溶液實(shí)驗(yàn)步驟
1.挑取大腸桿菌DH5α(Top10)的單菌落,接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)12hr。2.取2mL菌液加入100mlLB液體培養(yǎng)基中,擴(kuò)大培養(yǎng)約2-3h;測OD600值,當(dāng)OD600約0.4-0.5時(shí),停止培養(yǎng)。3.無菌條件下取1.5ml菌液冰上放置10min,4℃,3,500rpm,離心10min。4.棄上清,在冰浴上加入250ul預(yù)冷的無菌CaCl2(0.1mol/L),輕搖使細(xì)胞懸浮。冰上放置10min。5.4℃,3,500rpm離心10min。6.棄上清,用150ul預(yù)冷的無菌CaCl2(0.1mol/L)重新懸浮細(xì)胞,保存?zhèn)溆谩#尤?5%的甘油,-70℃保存,可保存一年)。注意事項(xiàng)1.細(xì)菌的生長狀態(tài):實(shí)驗(yàn)中應(yīng)密切注視細(xì)菌的生長狀態(tài)和密度,盡量使用對數(shù)生長期的細(xì)胞(一般通過檢測OD600來控制。DH5菌株OD600為0.5時(shí)細(xì)胞密度是5×107/ml);2.所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進(jìn)行;3.經(jīng)CaCl2處理的細(xì)胞,在低溫條件下,一定的時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的推移而增加,24小時(shí)達(dá)到最高,之后轉(zhuǎn)化率再下降(這是由于總的活菌數(shù)隨時(shí)間延長而減少造成的);4.化合物及無機(jī)離子的影響:在Ca2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價(jià)金屬離子(如Mn2+或Co2+)、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌,可使轉(zhuǎn)化效率大大提高(100-1000倍);5.所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率;6.質(zhì)粒的大小及構(gòu)型的影響:用于轉(zhuǎn)化的應(yīng)主要是超螺旋的DNA;7.一定范圍內(nèi),轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度呈正比;實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)細(xì)胞生長狀態(tài)和密度:不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于4℃的培養(yǎng)菌,最好從-80℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時(shí)為宜,可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600
來控制。DH5α菌株的OD600為0.5時(shí),細(xì)胞密度在5×107
個(gè)/mL左右,這時(shí)比較合適。密度過高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。實(shí)驗(yàn)操作時(shí)要格外小心,懸浮細(xì)胞時(shí)要輕柔,以免造成菌體破裂,影響轉(zhuǎn)化。1.在制備感受態(tài)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中要注意哪些
細(xì)節(jié)?2.影響感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的因素有哪些?思考題實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
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