第一次課現(xiàn)代生物技術(shù)綜合大實(shí)驗(yàn)

現(xiàn)代藥學(xué)生物技術(shù)綜合大實(shí)驗(yàn)基因克隆基因表達(dá)重組蛋白純化鑒定基因克隆與重組子構(gòu)建基因表達(dá)與重組蛋白純化多克隆抗體制備與鑒定第一部分

基因克隆與重組子構(gòu)建參照《藥學(xué)分子生物學(xué)》第八章基因克隆與重組子構(gòu)建路線圖pET-28aEGFPpEGFPpEGFP菌株培養(yǎng)提取質(zhì)粒經(jīng)酶切獲得EGFPpET-28a菌株培養(yǎng)提取質(zhì)粒雙酶切pET-28aEGFP提取質(zhì)粒、鑒定擴(kuò)大培養(yǎng)PCR鑒定連接、轉(zhuǎn)化DH5a2023/2/14中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝高壓滅菌法滅菌

概念滅菌系指培養(yǎng)基、發(fā)酵設(shè)備或其他目標(biāo)物中所有微生物的營養(yǎng)細(xì)胞及其芽胞（或孢子）殺滅或去除，從而達(dá)到無菌的過程；消毒是指殺滅病原微生物和其他有害微生物，并不要求清除或殺滅所有微生物（如芽胞等）；滅菌法是指預(yù)先用物理方法，徹底消滅掉接觸物品上所附帶的微生物；消毒法常指應(yīng)用化學(xué)方法來消滅微生物。2023/2/16中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝滅菌法滅菌法所用的物理方法：器械和應(yīng)用物品可用高溫來滅菌。電離輻射主要用于藥物如抗生素、激素、類固醇、維生素等，以及塑料注射器和縫線等的滅菌。紫外線可以殺滅懸浮在空氣中、水中和附于物體表面的細(xì)菌、真菌、支原體和病毒等。但它不能射入食物和衣料、被服等紡織物，故一般常用于室內(nèi)空氣的滅菌。2023/2/17中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝高壓蒸汽滅菌法的注意事項(xiàng)無菌包不宜過大，不宜過緊；液體要保證有透氣孔存在；布類物品應(yīng)放在金屬類物品上；高壓蒸汽滅菌效果的監(jiān)測：

第一種是工藝監(jiān)測：根據(jù)安裝在滅菌器上的量器（壓力表、溫度表、計(jì)時(shí)表）指示滅菌設(shè)備工作正常與否。

第二種是化學(xué)指示監(jiān)測，3M壓力滅菌指示膠帶：此膠帶上印有斜形白色指示線條圖案。在121℃經(jīng)20分鐘，130℃經(jīng)4分鐘后，膠帶變色（條紋圖案即顯現(xiàn)黑色斜條）。2023/2/18中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝基因工程菌用基因工程的方法，使外源基因得到高效表達(dá)的菌類細(xì)胞株系一般稱為“工程菌”。工程菌是采用現(xiàn)代生物工程技術(shù)加工出來的新型微生物，具有多功能、高效和適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)如：大多數(shù)大腸桿菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，用于保護(hù)宿主DNA不被相應(yīng)的限制酶所切割。Dam甲基化酶可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基Dcm甲基化酶在CCA/TGC序列的第一個(gè)胞嘧啶C-5位置上引入甲基2023/2/110中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝DH5α是世界上最常用的生物工程菌株之一，特別是在克隆的應(yīng)用，其主要特征為：endA1突變：使endA(限制性內(nèi)切酶)無

酶活性，有利于質(zhì)粒的穩(wěn)定。(lacZ)M15突變：其表達(dá)產(chǎn)物與pUC載體編碼的β-半乳糖苷酶氨基端實(shí)現(xiàn)α互補(bǔ)，可用于藍(lán)白斑篩選。recA突變：

限制DNA重組，使導(dǎo)入的DNA穩(wěn)定。2023/2/111中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝α互補(bǔ)lacZ基因的突變體M15質(zhì)粒（缺失氨基酸殘基11到41）是沒有野生型lacZ基因產(chǎn)物那種分解X-gal能力的。但如果在M15突變體的抽取物中加入β-半乳糖苷酶的第3至第92氨基酸殘基的肽段（α肽）則能恢復(fù)M15分解X-gal，而顯示藍(lán)色的能力。這樣一種基因內(nèi)互補(bǔ)現(xiàn)象稱做α互補(bǔ)（α-complementation）。白色克隆為陽性重組克隆，藍(lán)色的為載體自連的克隆2023/2/1中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝12BL21(DE3)菌株適合于重組蛋白表達(dá)的常用菌株基因組中整合有l(wèi)噬菌體T7噬菌體RNA聚合酶基因位于λ噬菌體DE3區(qū)，表達(dá)受控于lacUV5啟動(dòng)子的用于以T7RNA聚合酶為表達(dá)系統(tǒng)的高效外源基因的蛋白表達(dá)宿主。2023/2/113中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝基因工程用載體載體(vector,vehicle)的本意就是媒介體，基因工程上的載體是能將分離或合成的基因?qū)爰?xì)胞的DNA分子?；蚬こ讨杏腥N主要類型的載體∶質(zhì)粒DNA、病毒DNA、科斯質(zhì)粒。2023/2/115中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝載體必須具備的幾個(gè)性能分子較小，可攜帶比較大的DNA片段。能獨(dú)立于染色體而進(jìn)行自主復(fù)制并且是高效的復(fù)制。要有盡可能多種限制酶的切割位點(diǎn)，但每一種限制酶又要最少的切割位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)multiplecloningsites，MCS）。有適合的標(biāo)記，易于選擇。有時(shí)還要求載體要能啟動(dòng)外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，并且盡可能是高效的表達(dá)。從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移，僅限于在某些實(shí)驗(yàn)室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復(fù)制等等。2023/2/116中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝載體的分類根據(jù)功能克隆載體:

克隆一個(gè)基因或DNA片斷表達(dá)載體:

用于一個(gè)基因的蛋白表達(dá)整合載體:

把一個(gè)基因插入到染色體組中2023/2/117中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝根據(jù)來源：

質(zhì)粒載體噬菌體載體柯斯質(zhì)粒載體真核細(xì)胞表達(dá)載體其中質(zhì)粒DNA是最常用的載體，但運(yùn)載能力低，柯斯質(zhì)粒是質(zhì)粒和λ噬菌體DNA的結(jié)合體，運(yùn)載能力最高。在這三種類型的基礎(chǔ)上，根據(jù)不同的目的，出現(xiàn)了各種類型的改造載體。2023/2/118中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝質(zhì)粒（plasmid）是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。大小約為數(shù)千堿基對(duì)。常有1~3個(gè)抗藥性基因。2023/2/119中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝質(zhì)粒載體克隆的質(zhì)粒載體允許外源的DNA插入，儲(chǔ)存。主要用于DNA水平上的操作基因表達(dá)的質(zhì)粒載體允許外源DNA的插入、儲(chǔ)存和表達(dá)。含有啟動(dòng)子2023/2/120中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝作為載體的質(zhì)粒都含有三種共同的組分：復(fù)制基因（replicator，Ori）選擇性記號(hào)（Amp,Kana)克隆位點(diǎn)(MCS)2023/2/121中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET-28a是原核基因表達(dá)質(zhì)粒具有卡那霉素抗性基因LacI基因序列LacZ序列T7聚合酶啟動(dòng)子His6標(biāo)簽2023/2/123中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝2023/2/124中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP/N32023/2/126中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝實(shí)驗(yàn)內(nèi)容上午高壓滅菌1000、200ul槍頭各1盒，1.5、0.5mlEP管各一盒，玻璃試管10個(gè)（分兩包）用報(bào)紙或布包好高壓滅菌；配制緩沖液配制50×TAE1000ml（1組），各組配制LB液體培養(yǎng)基200ml0.1MTris-HCl（pH8.5）100ml（2組）。各組取其1ml+9ml水（10mMTris-HCl）SOC培養(yǎng)液100