離子交換層析課程講義

離子交換層析第一節(jié)概述

離子交換層析（ionexchangechromatography）,是利用固定相偶聯(lián)的離子交換基團和流動相解離的離子化合物之間發(fā)生可逆的離子交換反應(yīng)而進行分離的方法，這種層析方式稱為離子交換層析。離子交換層析在無機化合物、有機化合物和生物大分子的分離中應(yīng)用最早、最廣泛的方法之一。它既可用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，也可用于銷量制備或研究分析。

離子交換層析介質(zhì)是在一種高分子的不溶性固體(載體)上引入具有活性的離子交換基團，即陽離子交換基團或陰離子交換基團，這些基團與溶液中相同電荷的基團進行交換反應(yīng)。在一定的pH環(huán)境中，不同物質(zhì)的解離度不同，分子或離子的帶電性的強弱不一樣，與離子交換基團的交換能力也不同。因此，物質(zhì)通過離子交換層析可以得到相應(yīng)的分離。

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第二節(jié)離子交換層析原理

一、離子交換劑的交換作用

當(dāng)溶液中存在著A、B兩種或兩種以上的離子，并通過離子交換層析柱時，原來吸附在離子交換介質(zhì)上的離子與溶液中高濃度的A、B離子發(fā)生交換作用，脫離離子交換介質(zhì)，游離在流動相中，并隨流動相流出來。由于A、B兩種離子在同一溶液中的解離度不同，它們所帶的凈電荷有差異。因此，二者在層析柱內(nèi)的遷移速度不同。從上樣的起始點(原點)至A、B兩離子的層析峰間的距離逐漸加大，最終完全分離。

在一定情況下，吸附在離子交換介質(zhì)上離子的量與溶液中游離離子的量達到平衡時，二者物質(zhì)的質(zhì)量之比，稱為分配系數(shù)或平衡常數(shù)，以Kd表示。

3Kd=Ms／Mi

式中Ms——單位質(zhì)量的離子交換介質(zhì)的摩爾數(shù)量；

Mi——單位體積溶液中溶質(zhì)的摩爾數(shù)量。

從理論上講，凡是溶液中離子間的Kd值有差異，通過離子交換層析均可分開。但實際工作要受到諸多因素的影響，離子的分配系數(shù)不僅與電荷有關(guān)，而且受到其他因素的制約。分離的條件與樣品與介質(zhì)的基本性質(zhì)及緩沖液的組成有密切的關(guān)系。

4二、離子交換介質(zhì)的排斥和阻滯作用

離子交換介質(zhì)的排斥和阻滯作用是指離子排斥電離物質(zhì)或電離程度不同的物質(zhì)，將帶有不同電荷離子或離子化合物分離。如在層析柱內(nèi)裝有陽離子交換介質(zhì)，當(dāng)一種含有陽離子A+的緩沖液通過該層析柱時，使該層析柱處于完全離子化的溶液中，然后將一種含有不同陽離子B+溶液通過層析柱時，那么介質(zhì)上有一部分A+就會被B+所取代，直至2種離子達到平衡。

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兩種離子達到平衡時，相對組成取決于介質(zhì)—O-—A+的濃度、溶液中B+離子的濃度以及離子交換介質(zhì)對A+和B+的相對親和力。隨著含B+的溶液從層析柱中上流出來，B+完全有可能結(jié)合到離子交換介質(zhì)上。如果在緩沖液的pH值、離子強度、柱溫、流速等條件很合適的情況下，結(jié)合在層析介質(zhì)上的組分就會以一個很窄的區(qū)帶流出，得到高濃度的洗脫峰6

從柱上洗脫陽離子B+，需要采用不同的緩沖液，開始用氫離子濃度較低的緩沖液，然后在該緩沖液中逐漸增加氫離子濃度以取代吸附在柱上的B+離子?；蛟谕环NpH值的緩沖液中增加離子強度。另一種情況，在相同的pH值和離子強度的緩沖液中加入一種比離子交換層析介質(zhì)親和力更強的陽離子來取代吸附在柱上的B+離子。

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如果要分離純化一種具有兼性離子特性的生物大分子，其離子化的程度取決于它所在溶液中的凈電荷。生物分子帶電荷與否，或帶什么樣的電荷，主要決定于溶液的pH值。溶液的pH值高于生物大分子的等電點時，就帶負電荷，解離成負離子；低于生物大分子的等電點時，就帶正電荷，解離成陽離子。因此，分離具有兼性離子的生物大分子，要對溶液的pH值、生物大分子的等電點和離子交換層析介質(zhì)三種條件同時進行考慮。8第三節(jié)離子交換層析介質(zhì)

離子交換介質(zhì)主要由惰性載體和交換基團兩部分組成。載體是由高分子化合物聚合而成的球形顆粒或多糖類化合物交聯(lián)而成的球形顆粒，離子交換基團一般都是由容易解離的酸根基團或堿性基團組成。（一）載體離子交換介質(zhì)的載體(或稱為母體)的基本性質(zhì)，應(yīng)當(dāng)具有良好的親水性、水不溶性、較好的化學(xué)穩(wěn)定性和較多的容易被活化劑活化基團。親水性是為了讓合成的介質(zhì)更容易與溶液中的離子接觸，發(fā)生交換作用；化學(xué)穩(wěn)定性，是為了讓介質(zhì)不易與溶液中的溶質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，有利于離子交換基團與溶液中的離子發(fā)生可逆性的交換作用。

9（二）載體的分類離子交換介質(zhì)的載體有很多種，但歸納起來主要有兩類。一類是化學(xué)原料合成載體，如聚苯乙烯樹脂等；另一類是天然材料制成的載體，如瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠，纖維素粉等。目前用得較多的載體有聚苯乙烯樹脂系列(polyphenylethylene)、纖維素粉系列(cellulose)、葡聚糖凝膠系列(sephadex)、瓊脂糖凝膠系列(sepharose)、灌注微珠(perfusion)等。10（三）離子交換基團的性質(zhì)離子交換基團主要是酸性離子基團，也稱之為陽離子交換基團；堿性離子基團，也稱之為陰離子交換基團。離子交換基團在溶液中吸附相反的離子，該離子可以與被分離的物質(zhì)發(fā)生可逆性的交換作用。（四）離子交換基團的分類根據(jù)離子交換基團的酸、堿性質(zhì)可以分為以下幾類。強酸型陽離子交換基團(如磺酸基)、中強酸型陽離子交換基團(如磷酸基)、弱酸陽離子交換基團(如羧酸基)、強堿型陰離子交換基團(如季胺基)、弱堿型陰離子交換基團(如伯胺基)。常用離子交換基團見表1。

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表1常用的離子交換基團12類型名稱縮寫結(jié)構(gòu)陽離子乙基磺酸基SE-O-CH2-CH2-S03-甲基磺酸基SM-O-CH2-S03-磷酸基P-O-PO3-羧甲基CM-O-CH2COO-陰離子三乙基氨基乙基TEAE-O-CH2-CH2-N+-(-CH2CH3)3二乙基氨基乙基DEAE-O-CH2-CH2-N+H-(-CH2CH3)2氨基乙基AE-O-CH2-CH2-N+H3（五）交換基團的交換反應(yīng)式

陽離子交換基團:

磺酸基：一R—SO3-H++Na+

一R—SO3-Na++H+

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第四節(jié)常用的離子交換層析介質(zhì)及其特性

（一）聚苯乙烯樹脂離于交換介質(zhì)

AmberliteIR-120，Dowex-50(Sigma公司產(chǎn)品)；Zerolit-225，Zerokarb-225(英國生產(chǎn))；樹脂201X8，732，734(國產(chǎn))。

以聚苯乙烯樹脂為載體合成的離子交換介質(zhì)的特點是剛性強，流速快，效率高，適于小分子強離子型化合物的分離。

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14（二）纖維素離子交換介質(zhì)

DATE-Sephacel，QAE-Sephacel(Sigma公司生產(chǎn))；DEAE-Sephacel(Phamarcia公司

生產(chǎn));DEAE-纖維素-(DE32)、DEAE-纖維素—(DE52)(國產(chǎn))。

以纖維素粉為載體合成的離子交換介質(zhì)的特點是具有較好的親水性，對生物大分子或

有機小分子均可進行分離，介質(zhì)價格便宜，適合于規(guī)?；a(chǎn).1515

（三）葡聚糖凝膠離子交換介質(zhì)

QAE-SephadexA25、DEAE-SephadexA25、CM-SephadexC25(Phamarcia公司生產(chǎn))；

DEAE-葡聚糖、CM-葡聚糖(國產(chǎn))。

以葡聚糖凝膠為載體合成的離子交換介質(zhì)的特點是具有較好的親水性和凝膠網(wǎng)狀結(jié)

構(gòu)，適用于生物大分子化合物的分離

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16（四）瓊脂糖凝膠離予交換介質(zhì)

Q—Sepharose-4BFF、Q-Sepharose-6BFF、DEAE-Sepharose-4BFF-4B、DEAE—Sepharose-6BFF、CM-Sepharose-4BFF、CM-Sepharose-6BFF、SP-Sepharose-4BFF、SP-Sepharose-6BFF(Phamarcia公司生產(chǎn))；DEAE-QT4、CM-QT4(國產(chǎn))。

以瓊脂糖凝膠為載體合成的離子交換介質(zhì)的特點是具有較好的親水性、凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的大孔性、剛性好、能耐受一定的操作壓、流速快，分辨率高、非特異性吸附少等。適用于生物大分子的分離，可用于大規(guī)模的分離純化。1717

第五節(jié)離子交換介質(zhì)的技術(shù)指標

（一）交換容量及其表示方法

交換容量是離子交換層析介質(zhì)的一個重要參數(shù)，介質(zhì)的交換容量越大，介質(zhì)的性能越好，分離的效率越高。交換容量是表示在單位質(zhì)量或單位體積的離子交換介質(zhì)中所能交換溶液中溶質(zhì)的質(zhì)量。固體離子交換介質(zhì)交換容量的表示方法：每克介質(zhì)交換溶質(zhì)的毫克數(shù)量或毫摩爾數(shù)量(mg／g或mmol／g)；浸泡在溶液中或溶脹好的離子交換介質(zhì)交換容量的表示方法：每毫升介質(zhì)交換溶質(zhì)的毫克數(shù)或毫摩爾數(shù)量(mg／ml或mmol／m1).

18(二)交換容量的測定的方法

交換容量的測定方法有很多種，不同性能的介質(zhì)有不同的測定方法，但是通常的測定方法是以酸、堿滴定法來確定強酸型或強堿性離子交換介質(zhì)的交換容量，或者通過吸附某一特定的生物大分子的質(zhì)量來確定弱酸型或弱堿性離子交換介質(zhì)的交換容量。具體測定方法如下。19

1．強酸型陽離子交換介質(zhì)交換容量的測定法

取一定量的離子交換介質(zhì)，去離子水溶脹，漂洗干凈用lmol／L的NaOH處理，去離子水洗至中性，lmol／L的HCl處理，去離子水洗至中性。然后用lmol／L的NaCl洗脫，收集洗脫液，再通過已標定的NaOH滴定洗脫液中的氫離子濃度，計算出吸附氫離子的毫摩爾數(shù)量，除以離子交換介質(zhì)的質(zhì)量，即可得到交換容量。計算公式如下。

202．強堿型陰離子交換介質(zhì)容量的測定方法

取一定量的離子交換介質(zhì)，去離子水溶脹，漂洗干凈，用1mol／L的HCl處理，去離子水洗至中性，lmol／L的NaOH處理，去離子水洗至中性。然后用lmol／L的NaCl洗脫，收集洗脫液，再通過已標定的HCl滴定洗脫液中的氫氧根離子濃度，計算出吸附氫氧根離子的毫摩爾數(shù)量，除以離子交換介質(zhì)的質(zhì)量即可得到交換容量。計算公式如下。213．凝膠類弱堿型陰離子或弱酸性陽離子交換

介質(zhì)容量的測定方法

取一定量的離子交換介質(zhì)，漂洗干凈(若是固體介質(zhì)，用去離子水溶脹)，用lmol／L的NaCl處理，去離子水洗無機鹽，緩沖液平衡，用已知蛋白的濃度樣品過柱吸附，直至柱內(nèi)的介質(zhì)吸附的量達到飽和(流人柱的蛋白濃度與流出液的蛋白濃度相等時，即為介質(zhì)的吸附量已達到飽和)。一定濃度的NaCI或其他的洗脫劑洗脫，收集洗脫液，測定洗脫液中的蛋白質(zhì)的濃度，計算出蛋白質(zhì)的質(zhì)量，除以離子交換介質(zhì)的總質(zhì)量或總體積，即可得到交換容量。計算公式如下。22

（三）溶脹系數(shù)

大多數(shù)離子交換介質(zhì)都是以干燥的小圓珠或粉末狀保存的，在使用之前需要經(jīng)過溶脹。溶脹系數(shù)是指每克干的離子交換介質(zhì)吸附水后膨脹的體積，用ml／g表示。介質(zhì)溶脹體積的大小與否取決于載體交聯(lián)度的大小，如Sepharose4BFF表示1g干膠溶脹后能獲得5ml凝膠介質(zhì)，其溶脹系數(shù)為5。

23（四）介質(zhì)粒度

介質(zhì)粒度是指離子交換介質(zhì)顆粒直徑的大小，單位是μm。常用的離子交換介質(zhì)的粒度大小可分為4類，即：

粗：顆粒直徑在100—500μm左右，可用較大規(guī)模制備。

中粗：顆粒直徑在50～150μm左右，小型制備兼分析。

中細：顆粒直徑在20—80μm左右，用于分析。

細：顆粒直徑在5—30μm左右，微量分析，HPLC。24（五）理化性質(zhì)

剛性指介質(zhì)耐受外界壓力的程度，即在較高的操作壓下介質(zhì)不變形，柱床體積保持穩(wěn)定。

物理穩(wěn)定性對熱的耐受程度，在較高的溫度下交聯(lián)度不發(fā)生改變。

化學(xué)穩(wěn)定性一般是指在0．5一lmol／L的強酸或強堿溶液中或高濃度的鹽溶液中，化學(xué)性質(zhì)保持穩(wěn)定，化學(xué)鍵不發(fā)生斷裂或降解反應(yīng)，并具有較強的抗氧化的能力。25

第六節(jié)離子交換層析技術(shù)

（一）離子交換層析介質(zhì)的選擇

在液相層析分離中，選用陽離子交換層析介質(zhì)還是陰離子交換層析介質(zhì)，主要取決于被分離物質(zhì)所在溶液中的解離度及解離后離子所帶電荷的性質(zhì)(正電荷或負電荷)。如果是正離子應(yīng)當(dāng)選用陽離子層析介質(zhì)，負離子選用陰離子層析介質(zhì)。選擇的基本原則如下。

261．已知被分離物質(zhì)等電點若已知被分離樣品的等電點，則參照它所在緩沖液的pH值，首先看緩沖液的pH值比被分離物質(zhì)的等電點高還是低，若緩沖液的pH值比被分離物質(zhì)的等電點低，被分離物質(zhì)就帶正電荷，應(yīng)當(dāng)選擇陽離子交換介質(zhì)。若緩沖液的pH值比被分離物質(zhì)的等電點高，被分離物質(zhì)就帶負電荷，應(yīng)當(dāng)選擇陰離子交換介質(zhì)。例如，一個樣品的等電點為5．0，如果在pH7．0緩沖液中，被分離物質(zhì)帶負電荷，選擇陰離子交換介質(zhì)；如果在pH4．0緩沖液中，被分離物質(zhì)帶正電荷，選擇陽離子交換介質(zhì)。27

由此可以看出，凡是緩沖液的pH值高于樣品等電點，應(yīng)選擇陰離子交換介質(zhì)；低于樣品的等電點，應(yīng)選擇陽離子交換介質(zhì)。

對于生物大分子而言，被分離物質(zhì)的等電點與緩沖液的pH值之間的差別至少要在一個pH值以上。二者之間的差異越大，分子帶的凈電荷越多，越有利于進行離子交換層析分離。

282．未知被分離物質(zhì)的等電點對于未知等電點的樣品，由于不知道被分離物質(zhì)在溶液中帶何種電荷，是正離子還是負離子，就無法選擇何種離子交換介質(zhì)為好，在這種情況下首先應(yīng)做一個預(yù)試驗。取若干支試管，加入等量的陰離子交換介質(zhì)或陽離子交換介質(zhì)，依次加入不同pH的緩沖液，再加入等量的待測樣品，混勻后檢查每一支試管上清液中待測樣品被吸附量的變化。若在某一支試管中的樣品恰好完全被吸附，該管就是在此pH環(huán)境中的離子交換介質(zhì)，如圖1所示。29

不同pH的緩沖液介質(zhì)吸附樣品的變化從圖1可以看出，在選定的離子交換介質(zhì)的情況下，在pH6．0的緩沖溶液樣品中要分離的離子化合物被介質(zhì)完全吸附。因此，就可以確定在pH6.0以上的緩沖溶液中選擇陰離子或陽離子介質(zhì)。這種簡單的試驗，可提供參考。一般情況，試驗陰離子交換介質(zhì)，用pH5.0～9.0的緩沖液；陽離子交換介質(zhì)，用pH3.0—8.0的緩沖液為宜。303．吸附的差異取兩支試管分別加入等量的同一緩沖液，一支加入等量的陰離子交換介質(zhì)，另一支加入等量的陽離子交換介質(zhì)。在相同的pH值條件下吸附被分離樣品，然后測定兩支試管吸附樣的量，根據(jù)介質(zhì)對樣品吸附的量做出判斷。測試結(jié)果一般有三種可能性。31

第一，樣品可以被陰離子交換介質(zhì)吸附，陽離子交換介質(zhì)不吸附，可選擇陰離子交換介質(zhì)；第二，樣品可以被陽離子交換介質(zhì)吸附，陰離子交換介質(zhì)不吸附，可選擇陽離子交換介質(zhì)；第三，陰離子或陽離子兩種交換介質(zhì)均不吸附或吸附量很少。這種現(xiàn)象有兩種原因：①可能是樣品的等電點處于緩沖液的pH值附近，樣品解離度很低，在溶液中不帶電荷，不能生成離子化合物，離子交換介質(zhì)與樣品無法進行離子交換反應(yīng)。32

為了避免出現(xiàn)這種情況，最好選擇偏酸或偏堿的緩沖液來進行試驗，如可以用pH4.0的酸性緩沖液或pH9.0的堿性緩沖液。②該樣品可能是一種非離子型化合物，像糖類化合物。這類樣品不適于用離子交換層析方法進行分離。33（二）緩沖溶液的選擇離子交換層析的緩沖液來源很廣，凡是由弱酸和強堿、強酸和弱堿、弱酸和弱堿組成；的溶液，并具有一定緩沖容量均可以作為緩沖液。但是不同的化學(xué)試劑配成的緩沖液其緩沖能力是有差異的。選擇緩沖溶液的出發(fā)點，主要是圍繞有利于被分離物質(zhì)的分離和穩(wěn)定，有利于與再次純化所用的緩沖液的銜接，有利于從分離的樣液中除去緩沖離子等方面進行綜合考慮。緩沖溶液主要包括緩沖液的濃度、緩沖容量、pH值、離子強度和保護劑等。

341．緩沖容量緩沖容量與緩沖液的濃度有密切關(guān)系。一般情況，在緩沖容量滿足的前提下，緩沖液的濃度盡量降低，因為高濃度的緩沖液濃度對正相離子交換層析的吸附能力具有抑制作用。

2．pH值緩沖溶液的pH值最少要高于或低于被分離物質(zhì)等電點1個pH單位，最好應(yīng)盡量遠離樣品的等電點，有利于樣品的解離，形成離子化合物。

353．離子強度離子強度在保證樣品穩(wěn)定的前提下，盡可能采用低離子強度，有利于樣品在上述過程中發(fā)生離子交換反應(yīng)，提高交換率。

4．保護劑某些特殊的樣品在溶液中不穩(wěn)定，需要在溶液中加入一定的穩(wěn)定劑，鹽類、糖類、抗氧化劑類或尿素等，以保護樣品的原有的性質(zhì)。36

（三）緩沖液選擇的原則

1．有利于樣品的穩(wěn)定離子交換層析的某些洗脫液是蛋白質(zhì)的變性劑，或者是蛋白樣品的強洗脫劑，如鹽酸胍、尿素、三氯乙酸、有機溶劑等。上述溶液一般不適用作蛋白質(zhì)和酶的洗脫劑，但可以作為離子交換介質(zhì)的處理再生之用。因此，在選擇緩沖液時，盡量避免使用強洗脫劑和不利于樣品的化學(xué)性質(zhì)和生物活性穩(wěn)定的緩沖液。

372．有利于樣品的吸附和洗脫選擇的緩沖液既要有利于介質(zhì)與溶質(zhì)發(fā)生離子交換作用，又要有利于樣品從離子交換柱上洗脫下來。如果選擇的緩沖液極容易吸附，非常難洗脫，或者容易洗脫，吸附量很低這都是不可取。

3．有利于分樣品后處理從離子交換層析柱分離得到的組分，一般純度不是很高，還需要用其他的方法進行再次分離純化，或濃度較低，需要進行去鹽，濃縮干燥等。選擇的緩沖液要有利于樣品的后處理。離子交換層析所用的緩沖液盡量與再次純化所用的緩沖液一致。

384．考慮緩沖液是否有毒性避免使用毒性較大的緩沖液，如巴比妥，乙腈等。尤其是在食品工業(yè)和制藥工業(yè)，使用了有毒性的緩沖液，產(chǎn)品的質(zhì)量將會受到影響。

5．考慮是否有熱源在制藥工業(yè)，選用的緩沖液或緩沖液的添加劑盡量避免使用易引起熱源的化學(xué)藥品，如果確實需要使用有熱源的化學(xué)藥物，可選擇容易除去的化合物。39（四）上樣及洗脫方式

1.上樣

上樣量上樣量一般是根據(jù)離子交換介質(zhì)的交換容量來確定，通常上樣量不超過交換容量的10％～20％。尤其是對比較稀少或比較珍貴的樣品一定嚴格控制上樣量，在上樣前要進行必要的計算。具體計算方法如下。

W=V×E

式中W——表示上樣量，單位是mg或mmol；

V——柱床體積，ml;

E——介質(zhì)的交換容量，mg／ml或mmol／ml。

40②樣液濃度離子交換層析需要的樣液濃度不宜過高，如果樣液濃度過高，溶液黏度大，層析時傳質(zhì)速度慢，不利于溶液中的離子與離子交換介質(zhì)進行交換，部分溶質(zhì)還未來得及交換就流出柱外，造成回收率下降。對濃度較高的樣液，最好先用緩沖液進行適當(dāng)?shù)南♂尯笤偕蠘印?1

③離子強度樣液的離子強度不能過高，離子強度會影響介質(zhì)對溶質(zhì)的吸附，但有利于抑制雜質(zhì)的吸附。對某些樣品與介質(zhì)的結(jié)合能力較強離子，可以采用較高離子強度的緩沖溶液上樣；對某些樣品與介質(zhì)的結(jié)合能力較弱離子，可以采用低離子強度的緩沖溶液上樣。

42④流速如何控制離子交換層析上樣過程中的流速，主要取決于樣品的濃度、溶液黏度、樣品的解離度及分子量的大小。對濃度較高、黏度較大、解離度低、分子量大的溶液，要低流速上樣；對濃度較低、黏度較小、解離度低分子量小的溶液，要高流速上樣。否則會造成離子交換層析的收率低或效率差。上述幾種因素中，濃度影響最大，所以對濃度低的樣液流速可快一些，縮短上樣時間；對濃度高的樣液流速可慢一些，有利于進行離子交換?！?32.洗脫方式離子交換層析的洗脫方式主要有一步洗脫法、分步洗脫法和梯度洗脫法。

①一步洗脫實驗室常用的洗脫方式，它是指用一種濃度的洗脫劑進行洗脫。這種洗脫方法是只針對離子交換柱吸附的組分比較單一或者被分離的組分非常明確，對其基本性比較了解，吸附的量占主要部分，采取的洗脫方式。如圖2所示。4445

②分步洗脫在離子交換柱中吸附著兩種以上的組分，并且離子交換介質(zhì)對這些組分的吸附能力有較大的差異，在洗脫時采用不同濃度的洗脫劑或采用不同種類的洗脫劑進行洗脫。這種洗脫方法適用于吸附數(shù)量較少、分離度差別較大的組分。如圖3所示。

③梯度洗脫在離子交換柱中吸附著多種組分，并且離子交換介質(zhì)對這些組分的吸附能力具有一定的差異，在洗脫時采用濃度連續(xù)變化的洗脫劑進行洗脫。這種洗脫方法適用于吸附數(shù)量較多、分度差別較小、用上述兩種方法難以分離的組分洗脫。梯度洗脫方式有4種，梯度溶液的制備方法和洗脫曲線如圖4(a)一(d)所示。46473.洗脫劑離子交換層析的洗脫劑有很多。實驗室常用的洗脫劑有酸、堿和鹽溶液等。改變整個系統(tǒng)的酸堿度和離子強度，可以使結(jié)合在離子交換柱上組分的交換性能發(fā)生變化，當(dāng)洗脫液中的離子強度大于結(jié)合在離子交換柱上的組分或柱內(nèi)的酸堿度發(fā)生改變直至越過其等電點(流出液從酸性變成堿性或從堿性變成酸性)時，該組分就會逐步被洗脫下來。

梯度洗脫的形式主要有離子強度梯度洗脫、pH梯度洗脫、(離子強度+pH)混合梯度洗脫。48

第七節(jié)洗脫曲線的分析

（一）洗脫峰變小

離子交換層析是一種比較成熟的分離技術(shù)，在不改變分離條件的情況下一般都具有較好的重復(fù)性，每次分離的結(jié)果的保留值差別不大。但隨著離子交換柱使用的次數(shù)增加，柱內(nèi)介質(zhì)的交換容量會不斷下降，洗脫峰變得一次比一次小，上樣時流出液中有效組分的含量逐漸增多，這就預(yù)示著離子交換介質(zhì)需要進行再生和處理了。

49（二）洗脫峰部分重疊

在離子交換層析分離過程中，相鄰的洗脫峰常出現(xiàn)部分重疊現(xiàn)象，原因是多方面的。但主要有以下幾種可能性：

①相鄰兩組分的性質(zhì)相近，在現(xiàn)有的條件下不可能將它們完全分開。這種情況需要重新建立離子交換分離系統(tǒng)，包括重新選擇離子交換介質(zhì)、緩沖系統(tǒng)和洗脫劑。50②離子強度或酸堿度太大，在洗脫過程中由于離子強度過高或溶液的酸堿度變化太大，導(dǎo)致洗脫速度過快，第一個組分從柱上還未完全洗脫下來，第二個組分就開始洗脫了，因此出現(xiàn)重疊峰。這種情況，可以適當(dāng)?shù)亟档拖疵撘褐械碾x子強度或減緩溶液酸堿度的變化，降低梯度洗脫曲線的斜率或更換洗脫劑即可。如圖5所示。51（三）洗脫峰拖尾

在離子交換層析分離過程中，洗脫峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象或者兩峰之間相距較遠，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的主要原因是洗脫液中的離子強度偏低或梯度洗脫曲線的斜率偏低。這種情況，可以適當(dāng)增加洗脫液的離子強度、提高洗脫曲線的斜率或采用混合梯度洗脫即可。如圖6所示。52

第八節(jié)影響離子交換層析的因素

（一）離子交換介質(zhì)的影響

離子交換層析介質(zhì)孔徑與被分離物質(zhì)的相對分子質(zhì)量大小直接影響到層析柱的分離度和柱容量，尤其在凝膠類離子交換層析介質(zhì)和生物大分子的分離中影響更為明顯。

(1)凝膠孔徑對分離度的影響在離子交換層析過程中，被分離組分在柱中的保留值主要受離子交換介質(zhì)表面的靜電效應(yīng)和大孔徑的凝膠載體的分子篩效應(yīng)的影響。53

在排阻層析中大孔徑的凝膠介質(zhì)能夠使溶質(zhì)產(chǎn)生不同的內(nèi)在滲透作用，在生物大分子的相對分子質(zhì)量接近于凝膠孔徑的大小時就會受到嚴格的限制。這種作用直接阻礙了生物大分子在離子交換介質(zhì)和流動相中的傳質(zhì)速度，產(chǎn)生分子篩效應(yīng)，使分離效果下降。實驗證明30～50nm的孔徑以上的介質(zhì)可以分離相對分子質(zhì)量大于100000的蛋白質(zhì)，因此，大孔徑的凝膠介質(zhì)或?qū)嵭那蝾惤橘|(zhì)對生物大分子的分離結(jié)果影響較小。54

(2)凝膠孔徑對柱容量的影響離子交換層分離的過程是離子交換介質(zhì)表面與溶液中離子直接作用的結(jié)果。柱容量與介質(zhì)的表面積成正比，確切地說，對于生物大分子而言不是全部的表面積，而是能與生物大分子發(fā)生作用的有效表面積。一般選擇的介質(zhì)應(yīng)當(dāng)對分離的生物大分子是有較大的表面積。有效表面積A可以用以下公式表示。

A=Ao+KAi

式中Ao——離子交換介質(zhì)柱床顆粒外表層面積；

K——表面系數(shù)，表示在層析過程中對離子發(fā)生作用的有效面積的分數(shù)

Ai——柱床顆粒內(nèi)孔表面積。

55

分子的大小和種類不同K值也不同，當(dāng)相對分子質(zhì)量的大小接近于凝膠孔徑的大小時，K值趨于0。如牛血清清蛋白，在25—30nm孔徑的介質(zhì)上KAi值較大，柱容量較高，一般可達100mg／g；而相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)如碳酸酐酶在10nm孔徑的介質(zhì)上就可獲得較高的柱容量；相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)如免疫球蛋白則需要50—100nm孔徑的介質(zhì)上才能獲得較高的柱容量。56（二）離子交換柱長度的影響

離子交換柱的長短對蛋白質(zhì)的分離影響不是很明顯，如一支柱床高度為25cm和5cm的離子交換柱對蛋白質(zhì)的分離沒有多大差異。因此，離子交換柱一般都選用短粗的層析柱，柱長容易造成分子篩效應(yīng)，使保留值延長，引起洗脫峰的擴散，出現(xiàn)重疊現(xiàn)象。使用短柱優(yōu)點是洗脫體積相對比較集中，相應(yīng)的濃度比較高，容易提高檢測靈敏度，柱的負載少，操作壓小，有利于提高流速。

（三）緩沖溶液的影響

緩沖溶液的影響包括溶液的pH值、緩沖容量、離子強度等因素。571．pH值影響對弱電解質(zhì)和兩性解離的生物大分子，在離子交換層析分離技術(shù)是通過調(diào)節(jié)緩沖液的pH值來控制樣品的解離度或所帶電荷的性質(zhì)及凈電荷量。例如在分離蛋白質(zhì)時，緩沖液的pH值高于蛋白質(zhì)的pI帶負電荷；低于蛋白質(zhì)的pI帶正電荷。所以緩沖液的pH值可以決定蛋白質(zhì)帶什么樣的電荷，決定選擇什么樣的離子交換介質(zhì)。如果緩沖液的pH值選擇不當(dāng)，將會給整個分離系統(tǒng)帶來負面效應(yīng)，如吸附率差、回收率低、雜質(zhì)多等。

582．緩沖容量