第6章-常用分子生物學(xué)技術(shù)

第六章常用分子生物學(xué)技術(shù)蔡衛(wèi)斌生物化學(xué)教研室caiwb@第一節(jié)分子雜交技術(shù)具有互補(bǔ)序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則退火形成雙鏈的過(guò)程。雜交的雙方是待測(cè)核酸和已知核酸序列，已知核酸序列稱探針。在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開(kāi)成兩條單鏈的過(guò)程。雙鏈間氫鍵的斷裂！2、DNA變性的本質(zhì)1、DNA變性的概念核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)在DNA復(fù)性過(guò)程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)

。變性復(fù)性

DNA-DNA雜交雙鏈分子核酸分子雜交探針技術(shù)探針(probe)

一小段用同位素、生物素或熒光染料標(biāo)標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。一、Southern印跡此技術(shù)由Southern1975年首先設(shè)計(jì)。被檢測(cè)對(duì)象為DNA。帶有DNA片段的凝膠DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳至膜（尼龍膜或硝酸纖維素濾膜）上轉(zhuǎn)膜雜交、顯影凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印跡雜交的技術(shù)流程從凝膠上轉(zhuǎn)移DNA二、Northern印跡應(yīng)用DNA探針檢測(cè)特異mRNA的一種雜交技術(shù)，主要用于分析mRNA的轉(zhuǎn)錄或mRNA分子大小。其方法類似于Southern印跡雜交。三、Western印跡將待檢測(cè)蛋白質(zhì)（或酶）經(jīng)SDS電泳并染色后，轉(zhuǎn)移到濾膜上固定，再用“抗體-抗原”免疫反應(yīng)或“DNA-protein”結(jié)合反應(yīng)鑒別濾膜上的蛋白質(zhì)。三種

印跡比較1.DNA印跡技術(shù)(Southernblotting)檢測(cè)DNA2.RNA印跡技術(shù)(Northernblotting)檢測(cè)RNA3.蛋白質(zhì)的印跡分析(Westernblotting)檢測(cè)蛋白質(zhì)三種印跡技術(shù)的比較四、原位雜交(insituhybridization)1、定義：

將標(biāo)記探針與細(xì)胞或組織中核酸按堿基配對(duì)原則進(jìn)行特異性雜交，并應(yīng)用組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)方法在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位或基因表達(dá)的檢測(cè)技術(shù)稱原位雜交（hybridizationinsitu)。

2、操作步驟：

載片的清潔與處理；組織與細(xì)胞的固定；探針；濕盒熒光原位雜交五、生物芯片chip生物芯片（biochip）是近年來(lái)在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)高新技術(shù)。是將核酸、多肽或蛋白質(zhì)分子、組織切片和細(xì)胞等制成探針，以預(yù)先設(shè)計(jì)的方式有序地、高密度地排列在玻片或硅片等載體上，構(gòu)成二維分子陣列，然后與待測(cè)生物樣品靶分子雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)實(shí)現(xiàn)快速、高效和高通量樣品檢測(cè)。因該技術(shù)常用玻片或硅片等材料作為固相支持物，且在制備過(guò)程中模擬計(jì)算機(jī)芯片的制備技術(shù)，所以稱之為生物芯片。其原理也是分子雜交技術(shù)。微型化高通量—提高信息量平行化—提高信息的可比性微量化—降低待檢樣品用量自動(dòng)化—提高工作效率低成本—可迅速普及推廣生物芯片技術(shù)的特點(diǎn)生物芯片使用步驟芯片制作把探針固定于載體表面樣品處理目標(biāo)分子富集分子間的雜交結(jié)果檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析生物芯片分類（1）基因芯片（2）蛋白質(zhì)芯片（3）細(xì)胞芯片（4）組織芯片基因芯片概念：基因芯片，也叫DNA芯片，是將大量特定序列的DNA片段（分子探針）有序地固定在經(jīng)過(guò)處理后的尼龍膜、玻璃片、硅片等支持物上，從而能快速、準(zhǔn)確地對(duì)大量DNA分子序列進(jìn)行測(cè)定和分析的一種類似電腦的芯片。原理：利用堿基的互補(bǔ)配對(duì)原則（DNA分子雜交）材料：分子探針，尼龍膜，玻璃片，硅片1、基因芯片制作基因芯片的大致步驟可在基因組水平進(jìn)行基因表達(dá)和發(fā)現(xiàn)研究、突變、序列測(cè)定等，已方泛應(yīng)用于基因組研究和人類疾病的診斷等多領(lǐng)域?；蛐酒瑧?yīng)用應(yīng)用基因微矩陣芯片研究宮頸癌相關(guān)基因表達(dá)DNA微點(diǎn)陣已廣泛和流行的用于疾病診斷、基因組比較、以及新型癌癥的分類。2、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片（proteinchip）,又稱蛋白質(zhì)微陣列，是指以蛋白質(zhì)或多肽作為配基，將其有序地固定在固相載體的表面形成微陣列；用標(biāo)記了熒光的蛋白質(zhì)或其它分子與之作用，洗去未結(jié)合的成分，經(jīng)熒光掃描等檢測(cè)方式測(cè)定芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，來(lái)分析蛋白質(zhì)之間或蛋白質(zhì)與其它分子之間的相互作用關(guān)系。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用特異性抗原抗體的檢測(cè)生化反應(yīng)的檢測(cè)疾病診斷對(duì)疾病分子機(jī)制的研究藥物篩選及新藥的研制開(kāi)發(fā)3、細(xì)胞芯片又稱細(xì)胞微陣列，是以活細(xì)胞為研究對(duì)象的一種生物芯片，在芯片上完成對(duì)細(xì)胞的捕獲、固定、平衡、運(yùn)輸、刺激及培養(yǎng)的精確控制，并通過(guò)微型化的化學(xué)分析方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞樣品的高通量、多參數(shù)、連續(xù)原位信號(hào)檢測(cè)和細(xì)胞組分的理化分析等。

4、組織芯片組織芯片,又稱組織微陣列，是將不同生物體的組織按預(yù)先設(shè)計(jì)或研究需要排列在固相載體上所形成的組織微陣列。組織芯片最大的優(yōu)勢(shì)在于可以對(duì)大量組織標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，只需一次實(shí)驗(yàn)過(guò)程即可完成，縮短時(shí)間，減少誤差，提高了可比性。

第二節(jié)目的基因制備技術(shù)一、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

概念

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）是一種體外擴(kuò)增特異DNA片斷的技術(shù),能在短時(shí)間內(nèi)獲得數(shù)百萬(wàn)個(gè)特異DNA序列的拷貝。（一）PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1971年，Khorana提出：經(jīng)過(guò)DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過(guò)程便可克隆tRNA基因。但由于測(cè)序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了……PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制最初采用E-coliDNA聚合酶進(jìn)行PCR耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)KaryMullis“我不大喜歡動(dòng)手,我寧肯不動(dòng)手,我不喜歡做費(fèi)力的事。作為一個(gè)發(fā)明家,重要的一點(diǎn)是為解決某些問(wèn)題而盡力設(shè)計(jì)一個(gè)簡(jiǎn)捷的動(dòng)手方案?！?、PCR擴(kuò)增DNA片段的原理

PCR是在模板DNA、引物和四中脫氧核苷酸等存在的情況下，DNA聚合酶依賴的酶促合成反應(yīng)，整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程分三步：（二）PCR技術(shù)的基本原理和操作①

變性：加熱，模板DNA形成兩條單鏈②退火：降溫，模板單鏈DNA與引物配對(duì)結(jié)合③延伸：在DNA聚合酶及鎂離子等存在的條件下，引物3'-端向前延伸，合成與模板配對(duì)的新鏈

上述三步為一個(gè)循環(huán)，經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)DNA量增加一倍。新合成的鏈又可以成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過(guò)25-30個(gè)循環(huán)后目的DNA就可以擴(kuò)增106~109倍。通過(guò)循環(huán)可以提高PCR的特異性。1）模板DNA2）特異性引物3）耐熱DNA聚合酶4）dNTPs5）Mg2+6）緩沖液2、PCR的基本成份模板DNA95℃3、PCR的基本操作PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72℃第1輪結(jié)束95℃第2輪開(kāi)始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束是不是循環(huán)次數(shù)越多越好？PCR擴(kuò)增的平臺(tái)效應(yīng)引物設(shè)計(jì)（1)序列應(yīng)位于高度保守區(qū)，與非擴(kuò)增區(qū)無(wú)同源序列。（2）引物長(zhǎng)度以15-40bp為宜。（3）堿基盡可能隨機(jī)分布。（4）引物內(nèi)部避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。（5）兩引物間避免有互補(bǔ)序列。（6）引物3’端為關(guān)鍵堿基；5’端無(wú)嚴(yán)格限制PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)特異性強(qiáng)靈敏度高操作簡(jiǎn)單、省時(shí)對(duì)待檢原始材料質(zhì)量要求低高效率的基因擴(kuò)增技術(shù)引物引物3’5’5’5’基因組PCR技術(shù)的特點(diǎn)：擴(kuò)增特異的DNA片段1、目的基因的克隆2、基因的體外突變3、DNA和RNA的微量分析4、DNA序列測(cè)定5、基因突變分析（三）PCR的主要應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）以細(xì)胞內(nèi)總RNA或mRNA為材料進(jìn)行體外擴(kuò)增的技術(shù)。主要用于克隆cDNA、合成cDNA探針，檢測(cè)RNA病毒、分析基因表達(dá)等逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA方式：以隨機(jī)進(jìn)行的PCR擴(kuò)增所需的下游引物作為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的引物以oligo(dT)作為引物，mRNA3`末端polyA尾與之互補(bǔ)以人工合成的隨機(jī)序列六核苷酸混合物作為引物，進(jìn)行擴(kuò)增。reversetranscription逆轉(zhuǎn)錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴(kuò)增二、cDNA文庫(kù)cDNAlibrary一個(gè)生物體的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶部分酶切后，將酶切片段插入到載體DNA分子中，所有這些插入了基因組DNA片段的載體分子的集合體，將包含這個(gè)生物體的整個(gè)基因組，也就是構(gòu)成了這個(gè)生物體的基因文庫(kù)(genelibrary)。

cDNA文庫(kù)是以特定的組織或細(xì)胞mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成的互補(bǔ)DNA（cDNA）與適當(dāng)?shù)妮d體（常用噬菌體或質(zhì)粒載體）連接后轉(zhuǎn)化受體菌形成重組DNA克隆群，這樣包含著細(xì)胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織或細(xì)胞的cDNA文庫(kù)。

cDNA文庫(kù)具有組織或細(xì)胞特異性。

cDNA文庫(kù)顯然比基因組DNA文庫(kù)小得多，能夠比較容易從中篩選克隆得到細(xì)胞特異表達(dá)的基因。（一）從cDNA文庫(kù)建立基因組DNA文庫(kù)1）制備靶基因的核酸探針2）若靶基因表達(dá)蛋白已知，可反推部分基因序列，制備寡核苷酸探針3）差異顯示雜交（二）cDNA文庫(kù)目的基因的篩選

利用核酸分子雜交分離目的基因：差異顯示雜交不需要核苷酸序列信息，而耍擁有兩種不同的細(xì)胞群體：目的基因正常表達(dá)細(xì)胞群和在基因不表達(dá)細(xì)胞群。制備兩種不同mRNA提取物，一是含有目的基因mRNA的總mRNA群體，一是不含有目的基因mRNA種的總mRNA群體。因此，可以通過(guò)這兩種總mRNA(或是它們的cDNA拷貝)為探針的平行雜交，對(duì)由表達(dá)目的基因的細(xì)胞總mRNA構(gòu)建的克隆庫(kù)進(jìn)行篩選。當(dāng)使用存在目的基因的mRNA探針時(shí)，所有包含著重組體的菌落都呈陽(yáng)性反應(yīng)，在x光底片上呈現(xiàn)黑色斑點(diǎn)，而使用不存在目的基因的mRNA探針時(shí)，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈陽(yáng)性反應(yīng)，在x光底片上呈現(xiàn)黑色斑點(diǎn)。比較這兩種底片井對(duì)照原平板，便可以挑選出含目的基因的菌落。1）在基因組水平上研究某基因?qū)ζ鞴?、組織和細(xì)胞在個(gè)體發(fā)育中的影響2）cDNA文庫(kù)的篩選比較簡(jiǎn)單易行，尤其適用于某些特殊組織基因的制備3）由于每一個(gè)cDNA克隆都包含一種mRNA序列，這樣在篩選中出現(xiàn)假陽(yáng)性的概率就會(huì)很低4）為了測(cè)定mRNA序列，利用它的cDNA拷貝序列就可以有效分析外顯子的基因結(jié)構(gòu)（三）cDNA文庫(kù)的優(yōu)越性由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序列。三、化學(xué)合成化學(xué)合成法主要應(yīng)用作為核酸分子雜交探針作為引物，用于測(cè)序和PCR用于制備小的基因、不易獲得基因或用于改造天然基因作為DNA末端改造中的接頭用于制備cDNA，篩選克隆基因，或基因定位或基因的定點(diǎn)突變第三節(jié)基因敲除技術(shù)基因敲除（gene

knock

out）又稱基因剔除，或基因打靶

（gene

targeting）是指通過(guò)DNA定點(diǎn)同源重組，定向改變基因組中的某一特定基因，使機(jī)體特定基因失活或缺失，從而研究此基因的功能的一種分子生物學(xué)技術(shù)。由于胚胎干細(xì)胞的這種特殊性，ES細(xì)胞基因打靶技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用于建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物之中。從80年代到90年代初，小鼠ES細(xì)胞基因打靶技術(shù)已發(fā)展到成熟階段。1984年，Bradly等成功地用顯微注射法將ES細(xì)胞移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠，獲得生殖系嵌合體，再適當(dāng)交配，獲得源于ES細(xì)胞系純系小鼠?；蚯贸陌l(fā)展歷程此實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)體外培養(yǎng)的ES細(xì)胞能在體內(nèi)分化發(fā)育成生殖系嵌合體并可獲得小鼠純合體子代。1987年，人們利用ES細(xì)胞技術(shù)建立了次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hprt)基因敲除(Geneknockout)的動(dòng)物模型。轉(zhuǎn)抗凝血酶素VⅢ基因、轉(zhuǎn)β-干擾素基因羊。如何敲除其胰島素基因，成為糖病模型？猴的基因編碼與人類只有1%的差別，通過(guò)轉(zhuǎn)基因猴，可以研究各種疾病對(duì)人的影響，并開(kāi)發(fā)出相應(yīng)的治療方法。如引進(jìn)老年性癡呆病的基因，加快針對(duì)這種疾病疫苗的開(kāi)發(fā)研究。還可引進(jìn)糖尿病、乳腺癌、帕金森氏癥等基因，為人類最終戰(zhàn)勝社些疾病提供幫助。一、基因敲除的一般原理利用胚胎干細(xì)胞進(jìn)行基因敲除。1）構(gòu)建常規(guī)基因敲除載體，載體中的外源基因與靶基因高度同源，且被修飾和改造；2）敲除載體質(zhì)粒導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞；3）篩選發(fā)生同源重組的陽(yáng)性胚胎干細(xì)胞；4）通過(guò)顯微注射將陽(yáng)性胚胎干細(xì)胞導(dǎo)入胚囊；5）轉(zhuǎn)入假孕雌鼠子宮；6）獲得嵌合體小鼠。發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組（generalrecombination）。通過(guò)鏈的斷裂和再連接，在兩個(gè)DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。同源重組是最基本的DNA重組方式Holliday模型的4個(gè)關(guān)鍵步驟：兩個(gè)同源染色體DNA排列整齊；一個(gè)DNA的一條鏈斷裂、并與另一個(gè)DNA對(duì)應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體；通過(guò)分支移動(dòng)產(chǎn)生異源雙鏈DNA；Holliday中間體切開(kāi)并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈重組體DNA，分別為：

內(nèi)切酶

(recBCD)DNA侵?jǐn)_(recA)分支遷移

(recA)

內(nèi)切酶(recBCD)

DNA

連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′3′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)

DNA連接酶

DNA連接酶片段重組體拼接重組體

knock-out

：thegeneofinterestisdisrupted

同源重組抗性選擇RBDT-ADT-Ahpt△EnLBWaxy重組整合Waxyhpt△EnWaxy×重組intron1表達(dá)載體受體基因組打靶結(jié)果基因打靶（genetargeting）二、基因敲除載體構(gòu)建獲得目的基因的同源片段，即5`-臂和3`-臂。打靶載體的選擇性標(biāo)記基因質(zhì)粒篩選抗性基因：AmpR，KanR陽(yáng)性篩選基因表達(dá)：轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞存活，最多見(jiàn)Neo陰性篩選基因表達(dá)：轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞死亡，DTA，HSV-TK1、插入性載體(gene-insertion

vector)：插入型載體中與靶基因同源的區(qū)段中含有特異的酶切位點(diǎn)，線性化后，同源重組導(dǎo)致基因組序列的重復(fù)，從而干擾了目標(biāo)基因的功能?；蚯贸d體類型獲得目的基因的同源片段，即5`-臂和3`-臂。2、置換型載體(gene-replacement

vector)：斷裂位點(diǎn)位于同源序列區(qū)域的外側(cè)或兩側(cè)，選擇基因位于同源目的序列內(nèi)部或外側(cè)?；蛑亟M時(shí)以載體的同源序列取代染色體靶位序列，載體DNA

同源目的序列與染色體靶位點(diǎn)進(jìn)行兩次同源重組。目前，大多數(shù)基因敲除都采用置換型載體。取代型（a）或插入型（b）載體三、基因敲除載體導(dǎo)入ES細(xì)胞1、ES細(xì)胞的獲得現(xiàn)在基因敲除一般采用是胚胎干細(xì)胞，最常用的是鼠，而兔，豬，雞等的胚胎干細(xì)胞也有使用。常用的鼠的種系是129及其雜合體，因?yàn)檫@類小鼠具有自發(fā)突變形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的傾向，是基因敲除的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。而其他遺傳背景的胚胎干細(xì)胞系也逐漸被發(fā)展應(yīng)用。ES能在體外培養(yǎng)，保留發(fā)育的全能性！常用于基因敲除的靶細(xì)胞是小鼠ES細(xì)胞。導(dǎo)入方式有顯微注射法、電穿孔法、精子載體法和逆轉(zhuǎn)錄病毒法等，目前應(yīng)用較多的是電穿孔法。

2、重組DNA導(dǎo)入ES（1）顯微注射法(Microinjectiontechnique)顯微鏡下，用一根極細(xì)的玻璃針（直徑1-2微米）直接將DNA注射到胚胎的細(xì)胞核內(nèi)，再把注射過(guò)DNA的胚胎移植到動(dòng)物體內(nèi)，使之發(fā)育成正常的幼仔。用這種方法生產(chǎn)的動(dòng)物約有10%是整合外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。缺點(diǎn)：一次只能轉(zhuǎn)一個(gè)細(xì)胞（2）電穿孔法在高壓電場(chǎng)的短暫作用下，細(xì)胞膜上可出現(xiàn)可逆的孔洞，外源DNA可通過(guò)此孔洞進(jìn)入胞內(nèi)。雖然轉(zhuǎn)染效率低于顯微注射法，但可以大量細(xì)胞轉(zhuǎn)染，便于篩選，方法穩(wěn)定，目前應(yīng)用最多。（3）DNA-磷酸鈣共沉淀法將DNA與CaCl溶液混合，再緩慢滴加入含有磷酸的HEPES溶液中，形成DNA-磷酸鈣共沉淀顆粒。小心地將顆粒加入到培養(yǎng)的靶細(xì)胞表面，保溫?cái)?shù)小時(shí)后，使DNA被靶細(xì)胞攝取。（4）DEAE-右旋糖苷法該法先用來(lái)促進(jìn)病毒DNA導(dǎo)入，后來(lái)發(fā)展為一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移方法。方法：用外源DNA和DEAE-右旋糖酶的混合物處理細(xì)胞。常用于克隆化基因的瞬間表達(dá)，不用于細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。（5）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種RNA病毒，基因大小為3-10kb。不同于其它病毒，它具有二倍體基因，即含有兩個(gè)相同的RNA分子，有典型的真核mRNA結(jié)構(gòu)（包括帽子和尾巴）。缺點(diǎn)：片段不能太長(zhǎng)四、篩選與鑒定由于基因轉(zhuǎn)移的同源重組自然發(fā)生率極低，動(dòng)物的重組概率為10-2～10-5。因此如何從眾多細(xì)胞中篩出真正發(fā)生了同源重組的胚胎干細(xì)胞非常重要。目前常用的方法是正負(fù)篩選法（PNS法，Positive-NegativeScreening），標(biāo)記基因的特異位點(diǎn)表達(dá)法以及PCR法。應(yīng)用最多的是PNS法。正負(fù)雙向篩選系統(tǒng)：（

positive

and

negative

selection，PNS），PNS采用置換型載

體，該載體含有正負(fù)選擇基因各一個(gè)，正向選擇基因多為neo基因，插入載體的同源序列中；負(fù)向選擇基因常用DTA基因，置于同源序列的外側(cè)。同源重

組時(shí)，載體的同源區(qū)發(fā)生重組，同源區(qū)以外部分將被切除，所以在同源重組時(shí)，DTA基因?qū)⒈磺谐鴣G失。而在隨機(jī)整合時(shí)，所有序列均保留。

1、正負(fù)篩選法（PNS）1）在隨機(jī)插入的情況下，如果有DTA表達(dá)，DTA可以直接殺死細(xì)胞。2）在同源重組時(shí)，細(xì)胞對(duì)

G418有抗性，隨機(jī)整合時(shí)只對(duì)G418有抗性。3）未進(jìn)行任何方式整合的細(xì)胞則被G418殺死。neoDTAPNS載體目標(biāo)基因neo××同源重組結(jié)果一、同源重組neoDTAneoDTAPNS載體

基因組隨機(jī)整合結(jié)果二、隨機(jī)整合正負(fù)篩選法（PNS法）篩選已發(fā)生同源重組的細(xì)胞2、正向篩選法正向篩選標(biāo)記基因Neo具有雙重作用，一方面導(dǎo)致了靶基因的插入突變；同時(shí)作為重組細(xì)胞的正向篩選標(biāo)志，該基因產(chǎn)物可使細(xì)胞在含有新霉素的培養(yǎng)

基中生長(zhǎng)。正向篩選法可分為無(wú)啟動(dòng)子篩選法、無(wú)增強(qiáng)子篩選法和無(wú)polyA篩選法。

（1）啟動(dòng)子缺失篩選法原理是在重組基因載體的目的片段中插入一個(gè)啟動(dòng)子缺失的正向選擇基因

neo

neomycin，同時(shí)，目的基因片段也不包含該基因的啟動(dòng)序列。如果基因載體和細(xì)胞基因組發(fā)生同源重組，則正向選擇基因可以在靶位點(diǎn)基因啟動(dòng)子的作用下

得以表達(dá)，使陽(yáng)性細(xì)胞具有

G418

抗性，從而在選擇培養(yǎng)基中得到同源重組陽(yáng)性克隆。（2）Poly-

A缺失篩選法Poly-A缺失篩選的載體設(shè)計(jì)與啟動(dòng)子缺失的設(shè)計(jì)基本相同，當(dāng)打靶基因不能被誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，則考慮選用poly-

A缺失敲除策略。Poly

-

A

缺失的正向選擇基因

neo位于載體目的片段中,

由于neo

基因轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的缺失,其表達(dá)受到抑制。在重組陽(yáng)