第十四章 超敏反應性疾病的免疫學檢驗

超敏反應性疾病的免疫學檢驗張思英病原學教研室

超敏反應：已經(jīng)致敏的機體再次接受相同抗原刺激后，所引起的以生理功能紊亂或組織損傷為主的異常的適應性免疫應答。第一節(jié)激發(fā)試驗激發(fā)試驗（provocationtest）

是模擬自然發(fā)病條件，用少量超敏原引起一次較輕的超敏反應發(fā)作，達到確定超敏原的一種體內(nèi)試驗。

非特異性激發(fā)：是用組胺等刺激物做霧化吸入，以觀察患者對Ⅰ型超敏反應的敏感性，進而分析病因或判定療效。特異性激發(fā)：是用抗原如塵螨等做試驗，對明確超敏原有一定價值。

用于Ⅰ型和Ⅳ型超敏反應性疾病的檢查。收集原料粉碎、勻漿脫脂、提取過濾、分離鑒定分裝、保存清毒試驗部位抗原的制備皮試前臂曲側、上臂、背部禁忌：皮膚患濕疹、感染、皮炎或外傷正在或近日服用免疫抑制劑或抗組胺藥物皮膚試驗的類型與方法皮內(nèi)試驗（intracutaneoustest）；挑刺試驗（pricktest）主要用于Ⅰ型超敏反應斑貼試驗（patchtest）主要是檢測Ⅳ型超敏反應0.01～0.03ml/針相同超敏原不同稀釋度速發(fā)型15～30min內(nèi)觀察遲發(fā)型48～72h內(nèi)觀察4mm/針方法結果一、皮膚試驗---皮內(nèi)試驗速發(fā)型皮膚試驗的結果判定標準分級

皮內(nèi)試驗

點刺試驗-無風團或小于陰性對照無風團反應或小于陰性對照+風團3～5mm、紅暈＜20mm無風團,陰性對照＜紅暈≤20mm++風團6～9mm伴紅暈無風團，紅暈＞20mm+++風團10～15mm伴紅暈風團伴紅暈++++風團＞15mm伴紅暈和偽足風團伴紅暈和偽足遲發(fā)型皮試結果判定標準反應程度

結果判定-無反應或小于陰性對照+僅有紅腫++紅腫伴硬結+++紅腫、硬結、小皰++++大皰或/和潰瘍

比皮內(nèi)試驗敏感性稍低，但假陽性較少；皮試液濃度要比皮內(nèi)試驗高10～100倍。將試驗抗原與對照液分別滴于試驗部位的皮膚上用針尖透過液滴輕挑一下以刺破皮膚而不出血為度1min后拭（吸）去試驗抗原液一、皮膚試驗---點刺試驗速發(fā)型皮膚試驗的結果判定標準分級

皮內(nèi)試驗

點刺試驗-無風團或小于陰性對照無風團反應或小于陰性對照+風團3～5mm、紅暈＜20mm無風團,陰性對照＜紅暈≤20mm++風團6～9mm伴紅暈無風團，紅暈＞20mm+++風團10～15mm伴紅暈風團伴紅暈++++風團＞15mm伴紅暈和偽足風團伴紅暈和偽足皮內(nèi)試驗較點刺試驗有更好的敏感性第一次讀：48小時打開斑試器,間隔30min待斑試器壓痕消失后判定結果。第二次讀：第3天或第4天。如懷疑光過敏，在斑貼試驗的基礎上給予紫外線照射，操作過程相似。一、皮膚試驗---斑貼試驗遲發(fā)型皮試結果判定標準反應程度

結果判定-無反應或小于陰性對照+僅有紅腫++紅腫伴硬結+++紅腫、硬結、小皰++++大皰或/和潰瘍假陰性出現(xiàn)的常見原因：

①皮試液的濃度過低或失效；②老年患者或過敏性休克或哮喘大發(fā)作之后；③皮試前用過抗組胺藥或免疫抑制劑；④操作不當將皮試液注入皮下或注入量過少等。結果分析及注意事項結果分析及注意事項假陽性出現(xiàn)的常見原因：

①皮試液含有非特異性刺激物；②患者患有皮膚劃痕征；③操作手法較重；④注入量較大或濃度過高；⑤注入少量空氣等。詢問病史陽性對照必備搶救藥品和設施如何避免假性結果的出現(xiàn)：適應證陰性對照皮試液濃度皮膚試驗的應用預防藥物或疫苗等過敏防治Ⅰ型超敏反應性疾病結核菌素試驗評估機體細胞免疫功能預防皮膚接觸過敏

結核菌素試驗是用結核菌素進行皮膚試驗，通過觀察局部是否出現(xiàn)遲發(fā)型超敏反應，判斷機體有無結核分枝桿菌感染和對該菌的免疫力。陽性：機體已感染過結核桿菌或BCG接種成功；強陽性：可能有活動性結核病；陰性：機體未感染過結核分枝桿菌，但應考慮：①感染初期；②老年人；③重度結核病患者，機體處于免疫反應低下狀態(tài)；④患有其他疾病。

結核菌素試驗手捏式霧化器二、支氣管激發(fā)試驗（bronchialprovocativetest,BPT）霧化抗原顆粒≤5微米測定肺功能指標：用力肺活量(FVC)1秒用力呼氣容積(FEV1)最大呼氣流速(PEF)比氣道傳導率(sGaw)射流霧化器二、支氣管激發(fā)試驗（bronchialprovocativetest,BPT）測基礎肺功能激發(fā)物稀釋液：低濃度/小劑量→雙倍濃度/劑量遞增陽性伴明顯氣促、喘息口吸入1～1分半鐘測定肺功能陽性標準/明顯不適/臨床癥狀直至激發(fā)物達到最高濃度陰性反應支氣管舒張劑吸入二、支氣管激發(fā)試驗（bronchialprovocativetest,BPT）支氣管反應有三種類型：速發(fā)、遲發(fā)和雙重反應。每次觀察不能小于24小時。FEV1：重復性好，結果穩(wěn)定；PEF：峰流速儀價格低廉、方便、不受場地限制，與FEV1有較好的相關性，適合流行病學調(diào)查；sGaw：敏感性好，但重復性稍差。測定指標二、支氣管激發(fā)試驗（bronchialprovocativetest,BPT）結果判斷：

變應原的確定常以定性試驗判斷結果。①陽性：氣道反應性增高

FEV1、PEF較基礎下降≥20％或sGaw下降≥35%，有時伴有明顯自覺癥狀或肺部聞及哮鳴音。定性判斷二、支氣管激發(fā)試驗（bronchialprovocativetest,BPT）結果判斷：

②陰性：氣道反應性正常

FEV1、PEF或sGaw＜上述標準，正常值為陰性。無論激發(fā)試驗陽性或陰性，均應排除氣道反應性的影響因素。可疑者，間隔2～3周后復檢或2個月后再測。

受試者在心肺功能不全、高血壓、甲亢、妊娠、嚴重咽喉炎、呼吸道感染或肺炎等情況下一般不適宜作激發(fā)試驗；有過敏性休克，嚴重的血管性水腫及嚴重的喉頭水腫病史者；一周之內(nèi)預防接種、職業(yè)性過敏因素的接觸等。禁忌證二、支氣管激發(fā)試驗（bronchialprovocativetest,BPT）注意事項及禁忌癥：受試者在檢查前：48小時：停！抗組胺藥、色甘酸鈉及皮質(zhì)激素類藥;12小時：停！支氣管擴張劑;15分鐘：實驗室休息,病史、體檢排除BPT的禁忌證。注意事項二、支氣管激發(fā)試驗（bronchialprovocativetest,BPT）注意事項及禁忌癥：③①②④⑤⑥有一定的危險性，但較皮膚試驗的特異性高與受試者的病史、癥狀和體征相關性較強確定支氣管哮喘的過敏原，尤其皮試結果不肯定時排除皮試時的假陽性反應和假陰性反應檢測新制劑的抗原性、平喘藥療效及觀察脫敏效果缺點是每次僅能用一種抗原，要專門設備和技術，并需對病人進行訓練并與之配合二、支氣管激發(fā)試驗（bronchialprovocativetest,BPT）應用與評價：觀察癥狀癥狀好轉或減輕導致基礎飲食吃可疑的過敏食物癥狀加重1周后疑似過敏原，重復3次確定某食物為過敏原癥狀未減輕1周后排除食物所致過敏三、食物激發(fā)試驗口腔激發(fā)試驗將超敏原直接與口腔黏膜接觸，當口腔黏膜出現(xiàn)腫脹和充血時，可判斷為陽性反應。

結膜激發(fā)試驗將超敏原滴于一眼，陽性反應為結膜充血、水腫、分泌增加、搔癢，甚至眼瞼紅腫。注意假陽性對結果的干擾。鼻黏膜激發(fā)試驗將抗原吸入/滴入受試者鼻腔，出現(xiàn)鼻黏膜水腫、蒼白、鼻癢、流涕、噴嚏為陽性。

四、其他方法結果判定及分析

Ⅰ型超敏反應

抗原刺激后20～30min內(nèi)觀察結果。

陽性反應：

點刺試驗以紅暈為主皮內(nèi)試驗以風團為主結果判定及分析Ⅳ型超敏反應接觸抗原后48～72h內(nèi)觀察結果。

陽性反應：

皮內(nèi)試驗以紅腫和硬結為主斑貼試驗以紅腫和水皰為主假性結果

假陰性：①試驗抗原濃度過低或因各種原因失效；②正服用免疫抑制劑或抗組胺藥物；③操作誤差；④皮試季節(jié)選擇不當。假陽性：①試驗抗原不純，引起交叉反應；②試驗溶液配制不當，產(chǎn)生非特異性刺激；③皮膚反應性過強；④操作不當。

第二節(jié)

IgE的檢測一、血清總IgE的檢測√ELISA雙抗體夾心法：操作簡便，敏感性很高，是測定血清IgE最常用的方法?！藽LIA：敏感度更高，特異性高，定量。

臨床意義：正常人群血清IgE水平受地域環(huán)境、種族、遺傳、年齡、性別、寄生蟲感染、測定法及取樣等影響，結果有一定差異。

參考值0.1～0.9mg/L某些過敏體質(zhì)者高于正常1000～10000倍血清IgE高特應癥、支氣管肺曲菌病、藥物性間質(zhì)性肺炎、麻風、寄生蟲病及IgE型骨髓瘤等一、血清總IgE的檢測總IgE：正常成人血清含量為20～200IU/ml

嬰兒血中IgE含量極低；寄生蟲感染時可顯著增高。sIgE:ECP(嗜酸性細胞陽離子蛋白）：放射免疫吸附劑試驗

（radioimmunosorbenttest，IRST）酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)

化學發(fā)光固相熒光免疫分析一、血清總IgE的檢測臨床意義

：1、正常人群IgE水平受環(huán)境、種族、遺傳、年齡、檢測方法及取樣標準等因素的影響2、IgE升高相關的常見疾病有：過敏性哮喘、季節(jié)性過敏性鼻炎、特應性皮炎、藥物性間質(zhì)性肺炎、支氣管肺曲菌病、麻風、類天皰瘡及某些寄生蟲感染等。

一、血清總IgE的檢測√酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）：常用間接法。√免疫印跡技術（IBT）：操作簡單，能一次性測定多種變應原的特異性IgE，故臨床已普遍采用IBT法。二、特異性IgE的檢測（+）YYYYYYYEYEYEYYYYEYEYE洗滌洗滌洗滌結果ELISA間接法檢測特異性IgE特異性變應原加入待檢血清轉印至NC膜NC膜待檢血清特異性IgE抗-IgE·HRP底物特異性抗原條帶顯色NC膜—變應原—特異性IgE—抗-IgE·HRPIBT檢測特異性IgE目前公認的檢測I型超敏反應方法之一；具有特異性強、敏感性高；影響因素少、對患者絕對安全等優(yōu)點；過敏性哮喘診斷；尋找變應原。缺點：費用昂貴、花費時間長、不同試劑盒的參比血清不同不易相互比較。二、特異性IgE的檢測第三節(jié)免疫復合物檢測抗原特異性循環(huán)免疫復合物利用免疫復合物中抗原特異性來測IC。優(yōu)點：特異性高；缺點：需制備專一的針對抗原的抗體，只能檢測特定的一種IC，不常用。（免疫復合物中的抗原性質(zhì)不太清楚或非常復雜）抗原非特異性免疫復合物檢測

不考慮免疫復合物中抗原的性質(zhì)，只檢測免疫復合物的總量。根據(jù)檢測原理不同，檢測技術分為：

1.物理法－PEG法2.補體法－C1q結合試驗3.抗球蛋白法－mRF固相抑制試驗4.細胞法－Raji細胞試驗CIC：分子量600kDa以上，沉降系數(shù)＞19S；熱聚合人IgG(heatagglutinationhumanIgG,HAHG)：作為參考標準品，繪制標準曲線進行CIC定量或測定A值代表CIC相當于HAHG的含量。一、抗原非特異性CIC檢測技術一、抗原非特異性CIC檢測技術CIC的檢測方法：按抗體分子在結合抗原后發(fā)生的物理學和生物學特性的改變而設計。①PEG比濁法;②ELISA法;③細胞法——Raji細胞法;④抗球蛋白技術—mRF凝膠擴散試驗。一、抗原非特異性CIC檢測技術PEG比濁法：1.基本原理聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG）為不帶電荷、直鏈大分子結構的多糖，有強脫水作用，利用2%～4%濃度的PEG可選擇性沉淀大分子CIC。2.技術要點生物化學檢驗。3.注意事項：

①2%PEG沉淀大分子CIC；②4%PEG沉淀較小分子CIC；③超過5%PEG選擇性沉淀CIC的特性消失；④溫度影響極大，需進行溫差校正；⑤低密度脂蛋白使?jié)岫仍黾樱崭共裳?；⑥高γ球蛋白血癥和標本反復凍融濁度增加。一、抗原非特異性CIC檢測技術PEG比濁法：一、抗原非特異性CIC檢測技術ELISA法：1.基本原理ELISA法測定的CIC，是能夠結合C1q的

IgG類抗體與其特異性抗原形成的CIC。2.技術要點將聚苯乙烯包被上C1q，加入受檢血清，

CIC中IgG的Fc段與C1q結合，再加抗人IgG·HRP，形成C1q-CIC-抗人IgG·HRP復合物，加底物顯色。一、抗原非特異性CIC檢測技術①靈敏度高于PEG比濁法，檢測到0.1mg/L，重復性好等優(yōu)點；②C1q制品不易精制,純品不穩(wěn)定，只能檢出與補體結合的CIC。ELISA法：一、抗原非特異性CIC檢測技術細胞法-Raji細胞法：1.基本原理Raji細胞是從Burkitt淋巴瘤分離建株似B細胞系，在體外繁殖傳代，細胞表面有高密度的C1q、C3b、C3d等補體受體，而且不易脫落。2.技術要點將一定量待檢血清、HAHG和Raji細胞混合，使補體、CIC或HAHG與Raji細胞形成復合物，加入抗人IgG·FIC，形成Raji細胞—補體—CIC(或HAHG)—抗人IgG·FIC復合物，檢測熒光強度。一、抗原非特異性CIC檢測技術細胞法-Raji細胞法：3.影響因素①培養(yǎng)條件能改變Raji細胞其表面受體的數(shù)量及親和性，影響檢測敏感性;②待檢血清中如有抗淋巴細胞的抗體，能和Raji細胞反應;③SLE血清中的抗DNA也能和Raji細胞反應，使測定結果偏高。一、抗原非特異性CIC檢測技術細胞法-Raji細胞法：4.方法評價①敏感性高(6mg/LHAHG)，實用性強；②缺點需培養(yǎng)Raji細胞和同位素標記抗人IgG，操作繁瑣;③Raii細胞培養(yǎng)較困難，不易長期穩(wěn)定保持其特性，培養(yǎng)條件受限。一、抗原非特異性CIC檢測技術細胞法-Raji細胞法：1.方法評價IgG或IgM類自身抗體與IC中IgG的Fc段結合而不與游離IgG結合的特性，mRF與CIC親和力較強。一、抗原非特異性CIC檢測技術抗球蛋白技術-mRF凝膠擴散試驗：1.方法評價IgG或IgM類自身抗體與IC中IgG的Fc段結合而不與游離IgG結合的特性，mRF與CIC親和力較強。一、抗原非特異性CIC檢測技術抗球蛋白技術-mRF凝膠擴散試驗：2.技術要點將mRF和待檢血清中的CIC在瓊脂凝膠中擴散，mRF—CIC結合形成沉淀現(xiàn)象，進行CIC定性或定量。一、抗原非特異性CIC檢測技術抗球蛋白技術-mRF凝膠擴散試驗：3.方法評價敏感度較低100mg/L（HAHG），mRF來源受限，操作費時，難于常規(guī)應用。一、抗原非特異性CIC檢測技術抗球蛋白技術-mRF凝膠擴散試驗：CIC檢測方法的基本原理及敏感性比較方法原理

敏感性(mg/LHAHG)PEG比濁法溶解度20超速離心分子大小-分子超濾分子大小-凝膠過濾分子大小30ELISA法結合C1q0.1C1q液相法結合C1q10C1q偏離試驗結合C1q1～5抗補體實驗固定補體0.1mRF凝膠擴散法結合RF100mRF固相抑制法結合RF1～20抗抗體法結合Ig2～3Raji細胞法補體受體6花環(huán)抑制試驗補體受體10自身免疫性疾病病程中連續(xù)動態(tài)觀察或輔助診斷：①試驗方法本身不完善；②IC形成的復雜性，如在生理狀態(tài)下IC是由各種抗原與相應抗體所構成的，維持動態(tài)平衡。在病理狀態(tài)下往往是單一種類IC增高，而此種單一成分增高發(fā)展到足以影響IC總體水平情況下，才能被試驗檢出。二、CIC檢測方法評價及應用檢測方法評價：①腎臟疾?。杭毙阅I小球腎炎、移植腎、IgA腎病；②消化系統(tǒng)疾病：慢活肝炎、原發(fā)性膽淤性肝硬化；③皮膚?。菏n麻疹、天皰瘡、皮疹性皮炎；④Ⅲ型超敏反應性疾病：SLE、RA、硬皮癥、自身免疫性溶血性貧血等。此外，CIC的檢測對于腫瘤、肝癌、白血病、霍奇金病、神經(jīng)肌肉萎縮性側索硬化癥等疾病的診斷。二、CIC檢測方法評價及應用臨床應用：

固定或沉積于病變局部組織中的IC測定常用免疫組化技術，如熒光免疫組化技術檢測到組織標本有Ig和補體。受累組織的成分、構型和特定的部位可為疾病的嚴重程度和預后提供依據(jù)。三、沉積于組織中IC的測定第四節(jié)抗球蛋白試驗（Coombs試驗）類型不完全抗體：抗體分子較短小，只能與顆?？乖环较嘟Y合，不出現(xiàn)可見的凝集現(xiàn)象，但能封閉抗原決定簇，使其不能再與完全抗體結合?？谷饲虻鞍自囼灒╝ntiglobulintest,AGT）：將人球蛋白注入異種動物，誘導動物產(chǎn)生抗人球蛋白血清（antiglobulinserum，AGS)，AGS加入表面結合有不完全抗體的紅細胞復合物中，就能出現(xiàn)可見的凝集現(xiàn)象。作用：檢測紅細胞表面結合的不完全抗體。臨床意義：新生兒溶血癥和自身