第六章 水產(chǎn)品中農(nóng)藥、獸藥殘留的檢測

第六章

水產(chǎn)品中農(nóng)藥、獸藥殘留的檢驗

1.1農(nóng)藥、農(nóng)藥殘留農(nóng)藥是指用于預(yù)防、消滅或者控制危害農(nóng)業(yè)、林業(yè)的病、蟲、草和其他有害生物以及有目的地調(diào)節(jié)植物、昆蟲生長的化學(xué)合成或來源于食物、其他天然物質(zhì)的一種物質(zhì)或者幾種物質(zhì)的混合物及其制劑。

按用途可將農(nóng)藥分為殺（昆）蟲劑、殺（真）菌劑、除草劑、殺蜻劑、殺鼠劑和植物生長調(diào)節(jié)劑等類型。其中最多的是殺蟲劑、殺菌劑和除草劑三大類。按化學(xué)組成及結(jié)構(gòu)可將農(nóng)藥分為有機磷、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯、有機氯、有機砷、有機汞等類型。

1.2獸藥、獸藥殘留

獸藥是指用于預(yù)防、治療、診斷動物疾病或者有目的地調(diào)節(jié)動物生理機能的物質(zhì)（含藥物飼料添加劑），主要包括：血清制品、疫苗、診斷制品、微生態(tài)制品、中藥材、中成藥、化學(xué)藥品、抗生素、生化藥品、放射性藥品及外用殺蟲劑、消毒劑等。根據(jù)食品獸藥殘留立法委員會（CCRVDF)的定義，獸藥殘留是指動物產(chǎn)品的任何可食部分所含藥物的母體化合物及（或）其代謝物，以及與藥物有關(guān)的雜質(zhì)的殘留。所以藥物殘留既包括原藥，也包括藥物在動物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物。此外，藥物或其代謝產(chǎn)物還能與內(nèi)源大分子共價結(jié)合，形成結(jié)合殘留，它們對靶動物具有潛在毒性作用。水產(chǎn)品中主要殘留藥物有哇諾酮類、抗生素類、磺胺類和峽喃類以及某些激素等。

1.3水產(chǎn)品中農(nóng)藥和獸藥污染的來源和途徑導(dǎo)致水產(chǎn)品藥物殘留的主要原因如下：（1）使用未經(jīng)批準(zhǔn)的藥物或禁止使用的藥物（2）不正確使用或濫用藥物（3）未能遵守有關(guān)藥物休藥期（4）水產(chǎn)品及其制品加工時受到藥物污染或儲藏、運輸方法不當(dāng)造成藥殘（5）生態(tài)、生產(chǎn)環(huán)境的污染

2.1有機氯農(nóng)藥的檢測方法有機氯農(nóng)藥（OCPs）是具有殺蟲活性的氯代烴的總稱，其代表性的品種包括六六六、DDT及其類似物和環(huán)戊二烯衍生物，它們均為神經(jīng)毒性物質(zhì)。

由于它們在物理化學(xué)性質(zhì)上均具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和極低的水溶性、在正常環(huán)境中不易分解、有很強的親脂性、易通過食物鏈在生物體脂肪中富集和積累，可導(dǎo)致殘留污染嚴(yán)重、害蟲的抗性增加。

水產(chǎn)品中有機氯農(nóng)藥殘留量的測定原理試樣經(jīng)提取、凈化、濃縮、定容，用毛細(xì)管柱氣相色譜分離，電子捕獲檢測器檢測，以保留時間定性，外標(biāo)法定量。出峰順序：α-HCH、β-HCH、γ-HCH、五氯硝基苯、δ-HCH、七氯、艾氏劑、除蜻酯、環(huán)氧七氯、殺瞞酯、狄氏劑、pp’-DDE、pp’-DDD、op’-DDT、pp’-DDT、胺菊酯、氯菊酯、氯氰菊酯、α-氰戊菊酯、澳氰菊酯。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別準(zhǔn)確稱取所需的標(biāo)準(zhǔn)品，用少量苯溶解，再用正己烷稀釋成一定濃度的儲備液。根據(jù)各農(nóng)藥在儀器上的響應(yīng)情況，以正己烷配制混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。色譜條件

色譜柱：涂以O(shè)V-1010.25μm×30m×0.32mm（內(nèi)徑）石英彈性毛細(xì)管柱。

程序升溫：60℃維持1min；40℃/min升到170℃；2℃/min升到235℃；40℃/min升到280℃，維持l0min。

進(jìn)樣口溫度：270℃。

檢測器：電子捕獲檢測器（ECD），300℃。

載氣流速：氮氣（N2）：1mL/min；尾吹：50mL/min。

測定方法

（1）提取

稱取試樣20g（精確到0.0lg）于100mL具塞三角瓶中，加水6mL,丙酮40mL,振搖30min，加氯化鈉6g，充分搖勻，再加30mL石油醚，振搖30min。取35mL上清液，經(jīng)無水硫酸鈉濾于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，濃縮至約1mL，加2mL乙酸乙酯－環(huán)己烷（1＋1）溶液再濃縮，如此重復(fù)3次，濃縮至約1mL。（2）凈化

將此濃縮液經(jīng)凝膠柱以乙酸乙酯-環(huán)己烷（1+1）溶液洗脫，棄去0mL～

35mL流分，收集35mL～

70mL流分。將其旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約1mL，再經(jīng)凝膠柱凈化收集35mL～70mL流分，蒸發(fā)濃縮，用氮氣吹除溶劑，以石油醚定容至1mL，留待GC分析。

結(jié)果計算X——試樣中各農(nóng)藥的含量，單位為mg/kg;m1——被測樣液中各農(nóng)藥的含量，單位為ng;m——試樣質(zhì)量，單位為g;V1——試樣進(jìn)樣體積，單位為μL；V2——試樣最后定容體積，單位為mL。2.2水產(chǎn)品中有機磷農(nóng)藥殘留量的測定原理試樣經(jīng)提取、凈化、濃縮、定容，用毛細(xì)管柱氣相色譜分離，火焰光度檢測器檢測，以保留時間定性，外標(biāo)法定量。出峰順序：甲胺磷、敵敵畏、乙酰甲胺磷、久效磷、樂果、乙拌磷、甲基對硫磷、殺蟆螟硫磷、甲基嘧啶磷、馬拉硫磷、倍硫磷、對硫磷、乙硫磷。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取各有機磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，用乙酸乙酯溶解、定容成一定濃度的儲備液。測定前，用乙酸乙酯稀釋配制混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。色譜條件色譜柱：涂以SE-540.25μm×30m×0.32mm（內(nèi)徑）石英彈性毛細(xì)管柱。程序升溫：60℃維持1min：40℃/min升到110℃；5℃/min升到235℃；40℃/min升到265℃進(jìn)樣口溫度：270℃。檢測器：火焰光度檢測器（FPD-P）。載氣流速：氮氣（N2）：1mL/min;尾吹：50mL/min；氫氣：50mL/min；空氣：500mL/min

測定方法提取稱取試樣20g（精確到0.01g）于100mL具塞三角瓶中，加水6mL，丙酮40mL，振搖30mi云，加氯化鈉6g，充分搖勻，再加30mL石油醚，振搖30min。取35mL上清液，經(jīng)無水硫酸鈉濾于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，濃縮至約1mL，加2mL乙酸乙酯-環(huán)己烷（1＋1）溶液再濃縮，如此重復(fù)3次，濃縮至約1mL

。凈化將此濃縮液經(jīng)凝膠柱以乙酸乙酯-環(huán)己烷（1＋1）溶液洗脫，棄去0mL～35mL流分，收集35mL～70mL流分。將其旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約1mL，再經(jīng)凝膠柱凈化收集35mL～70mL流分，蒸發(fā)濃縮，用氮氣吹除溶劑，以石油醚定容至1mL，留待GC分析。

水產(chǎn)品中多氯聯(lián)苯的測定多氯聯(lián)苯（PCBs），又稱氯化聯(lián)苯，是由一些氯置換聯(lián)苯分子中的氫原子而形成的化合物，在工業(yè)上得到廣泛應(yīng)用。

多氯聯(lián)苯可以通過水體中生物食物鏈的富集作用，其在魚類體內(nèi)濃度累積到幾萬甚至幾十萬倍。多氯苯同時損害人類的免疫系統(tǒng)并被列為可能的致癌物質(zhì)，其毒性主要表現(xiàn)為：影響皮膚、神經(jīng)、肝臟，破壞鈣的代謝，導(dǎo)致骨骼、牙齒的損害，并有慢性致癌和致遺傳變異等的可能性。含PCBs分析物的現(xiàn)有前處理方法（1）液-液萃取法又叫溶劑萃取法，該方法要求的設(shè)備簡單，操作快速，尤其是分離效果較好，但工作量大，且所用溶劑常是易揮發(fā)、易燃和有毒性，在實際應(yīng)用中受到限制。（2）固相萃取法該法是較新也是當(dāng)今最為廣泛應(yīng)用的萃取方法之一。其主要是利用萃取劑的固體吸附作用從樣品中萃取分析物。在用固相萃取法處理含PCBs基質(zhì)時，聚亞安酯作萃取劑的研究最為廣泛。該法操作較簡單，靈敏度、回收率較高，缺點是易發(fā)生堵漏、溝流等現(xiàn)象，所需樣品量大。（3）超聲波萃取法該方法是分析固體基質(zhì)最簡單的技術(shù)之一，其原理是在室溫下用適當(dāng)?shù)挠袡C溶劑和樣品混合，超聲萃取待測物質(zhì)。萃取效率除與溶劑的極性有關(guān)外，還受萃取時間的影響。該法操作簡單。

（4）酸堿處理萃取法有實驗表明，在萃取混合液中加入有反應(yīng)性的酸、堿或經(jīng)酸堿處理過后的硅膠可明顯地改善萃取效果，提高萃取回收率。Liang等曾在液-液萃取中加入HCI，研究了不同酸性對PCDDs/PCDFs/PCBs回收率的影響，結(jié)果表明，前兩者在堿性條件下的回收率高，而后者則在酸性條件下的回收率高。（5）蒸汽相萃取法（Bleidner法）Schuphan等利用“Bleidner”蒸汽相萃取技術(shù)分析湖泊沉積物中的PCBs和有機氯沉淀物，與傳統(tǒng)的索氏抽提法相比較，結(jié)果表明，該法無需干燥和一般的清洗步驟，因而可大大縮短分析時間。但隨著PCBs氯化度的增高，使用該法所得的回收率明顯降低（由PCB28的98%下降到PCB180的43%）。（6)索氏抽提法在分析非極性和中等極性痕量有機物方面得到廣泛應(yīng)用，在分析PCBs方面的報道也有很多，如沉積物、土壤和動植物組織等。該法的要點是溶劑的極性應(yīng)與溶質(zhì)的溶解度相符，并且萃取前要用溶劑將基質(zhì)完全浸濕，其不足之處在于干燥過程耗時長，另外萃取時硫也易從基質(zhì)中萃取出來，影響檢測器的測定，延長分析時間。PCBs的現(xiàn)有檢測方法氣相色譜法（GC）

氣相色譜法是目前分析PCBs常用的有效方法，一方面是因為它具有高分離能力、高靈敏度和高分析速度等優(yōu)點；另一方面是由于一般樣品中所含的PCBs大都是痕量級水平。

所用的檢測器主要有以下幾類：

電子俘獲檢測器（ECD）ECD是分析痕量電負(fù)性有機化合物最有效的檢測器，具有選擇性較好、靈敏度高、檢測限低、易于操作和維修等特點。質(zhì)譜檢測器（MS）MS具有很強的結(jié)構(gòu)鑒定能力，與GC結(jié)合，充分利用各自的優(yōu)點可以實現(xiàn)高效、快速的分離鑒定。MS法是一種先將分子離解成不同帶電荷的離子，然后對離子質(zhì)量的強度進(jìn)行檢測，從而獲得分子結(jié)構(gòu)信息的方法。

薄層層析法（TLC）

高效液相色譜法（HPLC）HPLC應(yīng)用于PCBs的分析相對較少，且主要是作為GC定性分析前以除去樣品中的廢物和油污的一種凈化方法。HPLC的優(yōu)點是分析速度快、方便，可用于日常分析，不足是其常用的UV檢測器靈敏度低、選擇性差。

超臨界流體色譜法（SFC）氣相色譜法測定水產(chǎn)品中多氯聯(lián)苯殘留量利用消化法破壞水產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)和脂肪等雜質(zhì)，用石油醚提取、濃硫酸磺化凈化，用毛細(xì)管氣相色譜法測定。

本方法簡便、快速，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于大批量樣品分析。

測定多氯聯(lián)苯中有代表性的六種：

PCB28-2,4,4′-Trchlorbiphenyl；

PCB52-2,2′,5,5’-Tetrachlorbiphenyl；

PCB101-2,2′,4,5,5′-Pentachlorbiphenyl；

PCB138-2,2′,3,4,4′,5′-Hexachlorbiphenyl；

PCB153-2,2′,4,4′,5,5′-Hexachlorbiphenyl；

PCB180-2,2′,3,4,4′,5,5′-Heptachlorhiplienyl。原理

試樣經(jīng)高氯酸與冰乙酸的混合溶液消化，破壞樣品中蛋白質(zhì)和脂肪等基體物質(zhì)，進(jìn)行初步凈化，用石油醚提取多氯聯(lián)苯殘留物，再用硫酸進(jìn)一步凈化，濃縮，用具有電子捕獲檢測器的氣相色譜儀測定，外標(biāo)法定量。

試劑

所有試劑在多氯聯(lián)苯出峰處應(yīng)無干擾峰，有機溶劑最好選擇優(yōu)級純或色譜純試劑，分析純試劑應(yīng)重蒸。石油醚（沸程30～60℃，于全玻璃蒸餾器中重蒸）；高氯酸；冰乙酸；濃硫酸；無水硫酸鈉（經(jīng)550℃高溫灼燒3小時，干燥器中貯存）；硫酸鈉溶液（20g/L)，以上試劑均為分析純。多氯聯(lián)苯標(biāo)準(zhǔn)溶液：取10.0ng/μL的多氯聯(lián)苯標(biāo)準(zhǔn)溶液，用己烷稀釋成0.2nng/μL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。色譜條件(1)色譜柱：DB-1701石英毛細(xì)管柱（或與之相當(dāng)?shù)纳V柱），30m×0.32mm×0·25μm(2)載氣：氮氣，線速度24cm/s(3)進(jìn)樣口：溫度235℃，無分流方式進(jìn)樣。(4)溫度程序：初始柱溫100℃，維持1min；59℃/min升至200℃，維持l0min；5℃/min升至240℃，維持15min，確保所有的樣品已經(jīng)流出(5)檢測器：溫度300℃，補充氣流量60mL(6)進(jìn)樣量：1μL(7)檢測器：63Ni電子捕獲檢測器。測定步驟

（1）樣品預(yù)處理魚去鱗、去皮沿背脊取肌肉；蝦去頭、去殼、去附肢，取可食肌肉部分；蟹、甲魚等取可食肌肉部分；樣品切為不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的小塊后混勻，放置冰箱備用。

（2）提取將樣品解凍，勻漿機勻漿后，稱取樣品5g（精確到0.001g)，置于100mL具塞三角燒瓶中，加入50mL高氯酸與冰乙酸的混合溶液（體積比1︰1），于70℃恒溫水浴中振蕩約2h，至樣品消化完全。將溶液轉(zhuǎn)移至250mL分液漏