第五章 體內(nèi)藥物分析

第一節(jié)體內(nèi)樣品的采集與貯藏第二節(jié)體內(nèi)樣品分析的前處理第三節(jié)體內(nèi)樣品分析方法與方法驗證第五章體內(nèi)藥物分析體內(nèi)藥物分析：是指體內(nèi)樣品（如體液、組織、器官和排泄物等）中藥物及其代謝物或內(nèi)源性生物活性物質(zhì)的定量分析。藥物進(jìn)入體內(nèi)后，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與存在狀態(tài)均可能發(fā)生變化。存在狀態(tài)游離型的藥物或代謝物結(jié)合型的藥物或代謝物、結(jié)合物（綴合物）體內(nèi)樣品的特點1．樣品量少、不能重復(fù)取樣：體內(nèi)樣品采樣量一般為幾十微升至數(shù)毫升；多數(shù)在特定條件下采集，無法再次取樣。2．被測成分濃度低：通常在10-9～10-6g/ml，甚至10-12g/ml。3．干擾物質(zhì)多：血樣中含有蛋白質(zhì)、脂肪等和大量內(nèi)源性物質(zhì)；以及代謝物、結(jié)合物等均可能干擾測定。1．體內(nèi)樣品一般均需經(jīng)過分離、凈化后才能進(jìn)行分析。2．對分析方法的靈敏度及專屬性要求較高。在測定前需濃縮、富集以適應(yīng)分析方法要求。3．分析工作量大，數(shù)據(jù)的處理和闡明較為復(fù)雜。體內(nèi)藥物分析的特點色譜分析法：HPLC、UPLC、GC、HPCE靈敏度高、專屬性強免疫分析法：RIA、FIA、EIA靈敏度很高、專屬性較強生物學(xué)方法：體內(nèi)樣品中抗生素類藥物的測定體內(nèi)藥物測定方法第一節(jié)體內(nèi)樣品的采集與貯藏一

體內(nèi)樣品的種類二

體內(nèi)樣品的采集與制備三體內(nèi)樣品的貯存與處理血液、尿液、唾液、頭發(fā)、臟器組織、乳汁、精液、腦脊液、淚液、膽汁、胃液、淋巴液、糞便等尿液——主要用于藥物劑量回收研究、藥物腎清除率和生物利用度等研究，以及測定代謝物類型等腦脊液——懷疑藥物損傷血腦屏障一體內(nèi)樣品的種類二

體內(nèi)樣品的采集與制備（一）血樣：

離心全血離心上層：血清(serum)下層：血細(xì)胞（凝塊）上層：血漿(plasma)下層：血細(xì)胞血液自然凝結(jié)加抗凝劑采取：一般是靜脈取血、針刺手指、耳垂取血

動物實驗可直接從動脈或心臟采取（二）尿液優(yōu)點：采取簡便，取樣量大，受試者無痛苦。缺點：藥物濃度變化也大，需采集一定時間內(nèi)的尿樣。采?。簞游飸?yīng)在代謝籠中進(jìn)行，通過籠下漏斗接收。藥物可以原型（母體藥物）或代謝物及其綴合物形式從尿中排出。尿中藥物大多呈綴合狀態(tài)，測定前要將綴合的藥物游離。（三）唾液：

優(yōu)點：樣品易得，取樣無痛苦，尤易為兒童接收。缺點：藥物濃度變化大采?。菏?5分鐘，收集自然流出或經(jīng)舌在口內(nèi)攪動流出的唾液。也可采取物理、化學(xué)方法刺激使唾液流出。

制備：采取后，立即測量除去泡沫部分的體積。分層→離心→取上清液（四）組織：

藥物動物實驗、服用藥物過量中毒死亡時使用組織常用的臟器組織有：胃、肝、腎、心、、肺、腦等

制備：組織樣品在測定之前，需先加入一定量水或緩沖液勻漿均勻化。

處理：沉淀蛋白、酸水解或堿水解

、酶水解（枯草菌溶素）三、體內(nèi)樣品的貯存取樣后最好立即進(jìn)行分析，不能立即分析的，則短期內(nèi)冷藏(4℃)，長期冰凍(-20℃或-80～70℃)

。全血未經(jīng)分離，不宜直接冷凍保持。尿液是很好的細(xì)菌生長液，若需收集24小時或更長時間的樣品或不能立即測定的，應(yīng)置冰箱冷藏或加防腐劑（1%甲苯、過飽和氯仿等）保存。

注意：避免將樣品反復(fù)解凍-冷凍-解凍——冷凍前分裝成若干小份貯存（一）冷藏與冷凍1、終止酶的活性①液氮中快速冷凍②微波照射③勻漿及沉淀④加入酶活性阻斷劑（氟化鈉、四氫尿苷、三氯醋酸等）2、阻止藥物氧化及光解：易被氧化藥物，加抗氧劑（如維生素C）（二）去活性第二節(jié)

體內(nèi)樣品分析的前處理藥物在體內(nèi)的存在形式游離型：原形藥物或代謝物綴合物：藥物或其代謝物與葡萄糖醛酸或硫酸等結(jié)合結(jié)合物：藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合一、體內(nèi)樣品前處理的目的2、滿足測定方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和專屬性3、改善分析環(huán)境：保護測定儀器不受體內(nèi)樣品中類脂和蛋白質(zhì)等的污染。1、使待測藥物游離二、生物樣品前處理方法分離與濃集化學(xué)衍生化去除蛋白質(zhì)綴合物的水解（一）去除蛋白質(zhì)加入與水混融的有機溶劑(乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃)加入中性鹽(飽和硫酸銨、硫酸鈉、枸櫞酸鹽)加入強酸(三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸)加入金屬沉淀劑(CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH)熱凝固法水溶性有機溶劑除蛋白效果血清與水溶性有機溶劑比例為1:(1~3)可除90%蛋白乙腈—塊狀絮凝物、易于分離；成分損失可能性大，上清液pH為8.5-9.5甲醇—細(xì)小顆粒沉淀、不易分離；成分損失可能性小，上清液pH為8.5-9.5超速離心分離（12000r/min)—離心1-2min強酸及中性鹽除蛋白效果血清與飽和硫酸銨比例為1：2可除90%蛋白血清與強酸比例為1：0.6可除90%蛋白（二）綴合物的水解尿液中藥物多數(shù)呈綴合物狀態(tài)。（1）酸水解：適量鹽酸（2）酶水解：常用β-葡糖糖醛酸苷酶或硫酸酯酶或兩者混合。（3）溶劑解某些藥物的硫酸酯，往往加入萃取溶劑時發(fā)生分解，同時提取入有機溶劑中。目的：從大量共存物中分離出所需要的微量組分方法：1、液相萃?。╨iquid-liquidextraction,

LLE）（三）分離與濃集2、固相萃?。?/p>

solid

phaseextraction，SPE）

液-液萃取中需注意的問題：①適當(dāng)?shù)挠袡C溶劑：常用乙醚、氯仿、乙酸乙酯等。③離子型藥物：離子對萃?。╥onpairextraction）④提取技術(shù)：②適當(dāng)?shù)乃鄍H值1、液相萃?。↙LE）多數(shù)藥物是親脂性的，可用有機溶劑萃取出來，而大多數(shù)內(nèi)源性雜質(zhì)是強極性的，不被萃取出。對于離子性特強，水溶性極大的藥物，可采用離子對萃?、谶m當(dāng)?shù)乃鄍H值：由藥物的pKa值確定，一般堿性藥物在堿性條件、酸性藥物在酸性條件下萃取。堿性藥物最佳pH高于pKa值1-2個pH單位酸性藥物最佳pH低于pKa值1-2個pH單位中性藥物：pH=7附近為避免體液中雜質(zhì)進(jìn)入有機相，溶液pH值偏高一些較好空白血清的乙醚提取物的HPLC圖（UV-220nm檢測）pH為13時空白血清雜質(zhì)峰最少提取溶劑用量：有機相與水相比1:1或2:1

提取方式：密塞情況下，將萃取試管置于振蕩器或渦旋混合器混合，也可采用首尾顛倒的方式混合。提取次數(shù)：盡可能少，不要求提取完全，而要求適量而穩(wěn)定的提取率。離心與分離通常離心機4000rpm，離心10min分離出有機相。④提取技術(shù)：

2、固相萃?。⊿PE）擔(dān)體親水性：硅藻土疏水性：活性炭、聚苯乙烯或C18化學(xué)鍵合硅膠常用微型柱：BoundElut、Sep-pak利用固體材料為固定相，當(dāng)含多組分的體內(nèi)樣品溶液通過時，固定相對各組分具有不同的親和性，一些組分受到“分配”或“吸附”作用而滯留在固定相上，當(dāng)使用流動相沖洗時，由于流動相對組分的親和性更強，遂按組分洗脫的難易，將其攜帶出柱，使之達(dá)到分離。

用有機溶劑(甲醇)沖洗——洗凈用水沖洗——活化上樣用水或緩沖液沖洗，洗去內(nèi)源性物質(zhì)有機溶劑洗脫藥物收集洗脫液······微型柱固相萃取步驟真空固相萃取裝置固相微萃取法（Solid-phasemicroextraction,SPME）

SPME

裝置圖1、壓桿2.筒體3.壓桿卡持螺釘4.Z形槽5.筒體視窗6.調(diào)節(jié)針頭長度的定位器7.拉伸彈簧

8.密封隔膜9.注射外管10.熔融石英纖維11.熔融石英纖維

（表面涂有高分子固相液膜）

3、被測組分的濃集濃集方法：1、末次提取時，加入溶劑盡可能少2、揮去溶劑：（1）通入氣流（氮氣）吹干（2）減壓法：適于易隨氣流揮發(fā)或遇熱不穩(wěn)定藥物（四）化學(xué)衍生化GC中，極性較大、揮發(fā)性低的藥物或代謝物→極性小、穩(wěn)定性好的衍生物HPLC中，分子結(jié)構(gòu)無紫外、熒光吸收→具紫外吸收或熒光的衍生物GC中化學(xué)衍生化RCOOH、ROH、RSH、RNH2CH3I、CH3N2等RCOOCH3、ROCH3、RSCH3、RNHCH3例：烷基化極性降低，揮發(fā)性增加烷基化（碘庚烷、疊氮甲烷）?；ㄒ宜狒⒈狒┕柰榛ㄈ谆裙柰門MCS等）。HPLC中化學(xué)衍生化化學(xué)衍生化分類柱后衍生化柱前衍生化衍生化方法紫外衍生化熒光衍生化：鄰苯二醛、丹酰氯、熒胺等。非對映衍生化：手性衍生化試劑將藥物對映異構(gòu)體轉(zhuǎn)變?yōu)榉菍τ钞悩?gòu)體，用常規(guī)HPLC測定。第三節(jié)體內(nèi)樣品分析方法與方法驗證一、分析方法的建立（一）方法的選擇1、色譜分析法：GC、HPLC、GC-MS、HPLC-MS適合大多數(shù)小分子藥物及代謝物的測定2、免疫分析法：RIA、FIA、EIA

多用于蛋白質(zhì)、多肽等生物大分子類的檢測3、生物學(xué)方法：抗生素類藥物的體內(nèi)分析，需與特異性高的色譜法平行檢測（二）分析方法建立的一般程序1、對照品測定：選擇測定條件、濃度線性范圍等2、經(jīng)過純化處理的空白樣品測定：測定空白值，考慮分離度。3、空白樣品加對照品（質(zhì)控樣品）測定：求得樣品回收率，檢驗樣品中是否有干擾。4、體內(nèi)實際樣品測定二分析方法的驗證(一)特異性(二)標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍(三)精密度與準(zhǔn)確度(四)定量下限(五)樣品穩(wěn)定性(六)提取回收率

所測的物質(zhì)是原型藥物或特定的活性代謝物，內(nèi)源性物質(zhì)和相應(yīng)的其他代謝物及其他藥物不影響樣品的測定?？瞻籽獫{空白血漿＋標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)受試血漿(一)特異性1、內(nèi)源性物質(zhì)的干擾：比較待測物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、至少6個不同個體的空白生物介質(zhì)和質(zhì)控樣品的檢測信號2、未知代謝物的干擾：比較至少6個不同個體用藥后的實際體內(nèi)樣品和質(zhì)控樣品的檢測信號3、伍用藥物的干擾：比較待測藥物、伍用藥物、質(zhì)控樣品和添加伍用藥物的干擾樣品的檢測信號4、與參比方法的相關(guān)性：(二)標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍Y=9.56610-2X+6.15310-3

r=0.9995空白生物介質(zhì)加入系列標(biāo)準(zhǔn)溶液至少6個濃度點建立標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍必須覆蓋全部待測濃度，不得外推6.412.819.225.63232.41.81.20.60茶堿(μg/ml)·····isHH最高濃度應(yīng)高于達(dá)峰濃度(Cmax)；最低濃度應(yīng)低于Cmax的10%～5%——回歸方程的截距應(yīng)接近于零——相關(guān)系數(shù)要求≥0.99(色譜法)或≥0.98(生物學(xué)方法)附錄《藥物制劑人體生物利用度和生物等效性試驗指導(dǎo)原則》規(guī)定相對回收率一般應(yīng)在85～115%范圍內(nèi)，在LOQ附近應(yīng)在80～120%范圍內(nèi)。(三)精密度與準(zhǔn)確度1、準(zhǔn)確度方法：取空白生物基質(zhì)（如血漿）數(shù)份，加入高、中、低三種濃度的藥物對照品，制備質(zhì)控(qualitycontrol，QC)樣品，照標(biāo)準(zhǔn)曲線項下方法操作，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算——高(接近上限)、中、低(LLOQ的3倍)3個濃度——每一濃度至少5個樣本——與隨行的標(biāo)準(zhǔn)曲線同法測定、計算，每個樣品分析測定1次方法：日內(nèi)精密度（intra-dayPrecision）：將高、中、低三種藥濃樣品，每種分別取樣3-5次，同一天內(nèi)同一儀器測定。日間精密度（inter-dayPrecision）：將高、中、低三種藥濃樣品，一周（或10天）內(nèi)分別取樣3-5次測定。2、精密度批內(nèi)精密度：

——將高、中、低三種藥濃樣品，每一濃度5～6個樣品，每個樣品測定1次，用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算3個濃度及每1濃度的RSD批間精密度：

——每1分析批內(nèi)每一濃度制備1個樣品，每個樣品測定1次；用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計算3個濃度(每一濃度5～6個分析