第6章藥物的含量測定

第六章藥物的含量測定藥分制藥2011第一節(jié)概述藥物的含量測定評價藥物質(zhì)量的主要指標(biāo)。運用化學(xué)、物理或生物化學(xué)的方法和技術(shù)，測定藥物中主要有效成分的含量。定義藥物的含量測定化學(xué)、物理學(xué)、生物學(xué)方法方法利用某些生物學(xué)特性或特殊反應(yīng)來定性、定量化學(xué)反應(yīng)如光吸收特性、濁度藥物的含量測定基于化學(xué)或物理學(xué)原理的含量測定。分兩類基于生物學(xué)原理的效價測定?；A(chǔ)生物檢定法，微生物檢定法，酶法。目標(biāo)含量測定。含量方法要求化學(xué)原料藥（API)：根據(jù)藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)等特點綜合考慮適宜的含量測定法。選用的含量測定法應(yīng)能準(zhǔn)確測試有效成分的含量，其準(zhǔn)確度和精密度均高。制劑：可能時應(yīng)選用與原料藥相同的測定方法，共存藥物、輔料、附加劑有干擾時，可考慮增加預(yù)處理或改進(jìn)方法,但專屬性要強。含量表示方法（一）原料藥含量的表示法原料藥一般以百分含量表示，指樣品中被測成分（一般為活性物質(zhì)）的百分含量。一般按干燥品計算。藥典凡例規(guī)定：“按干燥品（或無水物，或無溶劑）計算”時，除另有規(guī)定外，應(yīng)取未經(jīng)干燥（或未去水，或未去溶劑）的供試品進(jìn)行試驗，并將計算中的取用量按檢查項下測得的干燥失重（或水分，或溶劑）扣除。因此：含量%（干燥品計）=直接測得量÷（1-干燥失重）（二）藥物制劑含量的表示法一般以相當(dāng)于標(biāo)示量的百分?jǐn)?shù)表示，指一個制劑單位中平均含有的藥物成分為制劑標(biāo)準(zhǔn)的“規(guī)格”項規(guī)定量的百分?jǐn)?shù)。如：對乙酰氨基酚片，規(guī)格0.5g，經(jīng)含量測定測得平均每片含對乙酰氨基酚0.45g，則標(biāo)示量為90%。固體制劑含量測定結(jié)果的計算

%100%′=標(biāo)示量每片實測含量含量100％′′平均片重==標(biāo)示量供試品重測得量標(biāo)示量平均片重供試品重測得量100％′原料藥制劑物質(zhì)的量

效價生物學(xué)法（基于生物學(xué)原理）

藥物含量測定方法化學(xué)法（基于化學(xué)原理）容量分析法、重量分析儀器分析法（基于物理學(xué)原理）光譜法、色譜法具體方法容量分析法：包括重量分析法、滴定法（直接、間接滴定法）光譜分析法：UV、IR、色譜分析法：HPLC、GC第二節(jié)、容量分析法

為經(jīng)典方法，原料藥分析常采用。常產(chǎn)生滴定誤差，如指示劑和儀器容量

特點：1、快速,準(zhǔn)確（RSD<0.2％）,靈敏度高；2、適合于中、高含量組分分析（1%）；3、儀器簡單，操作方便，適用范圍廣；按滴定方式分：

直接滴定法間接滴定法滴定法生成物滴定法（置換滴定）剩余量滴定法容量分析法分類滴定度（T）：每1ml規(guī)定濃度的滴定液相當(dāng)于被測物質(zhì)的質(zhì)量(mg)酸堿滴定：在水溶液中以酸堿中和反應(yīng)來測定物質(zhì)含量的方法配位（絡(luò)合）滴定法：以形成穩(wěn)定配合物的配位反應(yīng)為基礎(chǔ)的滴定分析法。用于金屬離子的測定采用金屬指示劑（如鉻黑T），如EDTA（乙二胺四醋酸二鈉）氧化還原滴定法：碘量法：如碘滴定液、硫代硫酸鈉滴定液、淀粉指示劑溴量法：Na2S2O3滴定液、Br2滴定液按反應(yīng)類型分：沉淀滴定法：以沉淀反應(yīng)為基礎(chǔ)，多以硝酸銀為滴定液，也稱銀量法。按所用指示劑的不同分為鉻酸鉀指示劑法鐵銨礬指示劑法吸附指示劑法非水滴定法：在非水溶劑（有機溶劑與不含水的無機溶劑）中進(jìn)行滴定分析的方法。

非水堿量法：是以冰醋酸為溶劑，高氯酸為滴定液，甲紫微指示劑，測定弱堿性藥物及其鹽類非水酸量法：是在堿性溶液中，以甲醇鈉為滴定液，麝香草酚藍(lán)為指示劑，二甲基甲酰胺等為溶劑，滴定弱酸性藥物滴定法的計算滴定度(T)的計算在容量分析中，被測藥物(B)與滴定液(A)之間都按一定的摩爾比進(jìn)行反應(yīng)的，滴定反應(yīng)可表示為：aA(待測物）＋bB（滴定液）→cC＋dD滴定液反應(yīng)的質(zhì)量被測藥物反應(yīng)的質(zhì)量被測藥物的摩爾質(zhì)量滴定液的摩爾質(zhì)量m→滴定液濃度(mol/L)M→被測物質(zhì)分子量a/b

→為反應(yīng)式配平后滴定液與被測物的摩爾比

T=（a/b）×m×M示例一計算Vc的滴定度T碘量法測定Vc含量[M(C6H6O6)=176.13]，C(I2)=0.05mol/LMb=0.05mol/L11MA=176.13示例二

異煙肼的滴定度溴酸鉀法測定異煙肼含量[M(C6H7N3O)=137.14]，C溴酸鉀=0.01667mol/Lab直接滴定法計算公式在實際工作中，滴定液的濃度可能與藥典規(guī)定的濃度并不一致，所以應(yīng)該進(jìn)行校正滴定時，供試品消耗滴定液的體積，ml濃度校正因子試品的質(zhì)量，g先計算T再計算含量正確求a和b剩余滴定法計算公式也叫回滴定法，本法常需空白試驗，含量測定結(jié)果的計算：

例題：非那西丁含量測定：精密稱取本品0.3630g加稀鹽酸回流1小時后，放冷，用亞硝酸鈉液（0.1010mol/L）滴定，用去20.00m1。每1ml亞硝酸鈉液（0.1mol/L）相當(dāng)于17.92mg的C10H13O2N。計算非那西丁的含量為？例：精密稱取青霉素鉀供試品0.4021g，按藥典規(guī)定用剩余堿量法測定含量。先加入氫氧化鈉液(0.1mol/L)25.00ml，回滴時消耗0.1015mol/l的鹽酸液14.20ml，空白試驗消耗0.1015mol/l的鹽酸液24.68ml。求供試品的含量，每1ml氫氧化鈉液(0.1mol/L)相當(dāng)于37.25mg的青霉素鉀。

例．非那西丁含量測定：精密稱取本品0.3630g加稀鹽酸回流1小時后，放冷，用亞硝酸鈉液（0.1010mol/L）滴定，用去20.00m1。每1ml亞硝酸鈉液（0.1mol/L）相當(dāng)于17.92mg的C10H13O2N。計算非那西丁的含量為（

）A.95.55%B.96.55%C.97.55%D.98.55%E.99.72%光譜分析法藥典收載紫外可見分光度法原子吸收分光光度法紅外分光度法熒光分析法火焰光度法第三節(jié)分光光度法分光光度法:

是通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)的吸光度或發(fā)光強度，對該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。光是電磁波,常用的波長范圍為：(1)200～400nm----紫外光區(qū)；(2)400～760nm----可見光區(qū)；(3)760～2500nm（12800cm-1～4000cm-1）----近紅外光區(qū)(4)2.5～25μm（按波數(shù)計為4000cm-1～400cm-1）----紅外光區(qū)。紫外可見分光度法方法特點與適用范圍1、簡便易行：本法使用的儀器價格比較低廉，操作簡單，易于普及2、靈敏度高：本法靈敏度可達(dá)10-7~10-4g/ml，適用于低濃度試樣分析3、準(zhǔn)確度較高：本法誤差在2%~5%之間，適用于對測定結(jié)果的準(zhǔn)確度要求較高的樣品4、專屬性較差：本法通常不受一般雜質(zhì)的干擾，但對結(jié)構(gòu)相近的有關(guān)物質(zhì)缺乏選擇性。本法比較少應(yīng)用于原料藥的含量測定，可用于制劑的含量測定，更多的應(yīng)用于生物制劑的定量檢查本法紫外區(qū)須選用石英比色皿，比色皿一般為1cm，吸光度在0.3~0.7之間為宜，選用最大吸收光波長。紫外-可見分光光度法物質(zhì)吸收紫外和可見光區(qū)的電磁波產(chǎn)生的吸收光譜進(jìn)行定性和定量分析的方法1.基本原理：朗伯─比耳定律

A為吸收度；T為透光率；L為液層厚度，單位為cm；E為吸收系數(shù)，常用的是百分吸收系數(shù)和摩爾吸收系數(shù)表示；C為100ml溶液中所含被測物質(zhì)的量g吸收系數(shù)%1110cmEM·=e摩爾吸收系數(shù)(ε)溶液濃度液層厚度百分吸收系數(shù)溶液濃度液層厚度2.儀器的基本結(jié)構(gòu)鎢燈（6～12V），產(chǎn)生320～3200nm的連續(xù)光譜，其適宜的波長是360～1000nm。氫燈發(fā)射150～400nm波長的光，適用于200～400nm波長。光源單色器吸收池檢測器數(shù)據(jù)記錄處理（2）吸收度的準(zhǔn)確度吸收度的準(zhǔn)確性用基準(zhǔn)重鉻酸鉀硫酸溶液檢定60mgk2Cr2O7,釋稀1000ml，在規(guī)定波長處測定吸收度，計算吸收系數(shù)E，相對誤差度在±1%以內(nèi)。（3）分辨率測定波長(nm)235(min)257(max)235(min)235(max)吸收系數(shù)-E124.5144.048.6106.6（1）波長的準(zhǔn)確度

3.儀器的校正和檢定《中國藥典》2010版對吸光度的測定做了以下要求：（1）溶劑：要求：能溶解樣品，揮發(fā)性小，對光波吸收少。

溶劑吸收度（以空氣為空白）在220-240nmA＜0.4在241-250nmA＜0.20在251-300nmA＜0.1300nm以上A＜0.054.吸光度的測定

（2）空白試驗校正：采用空白對照，將溶劑裝入吸收池，放入光路調(diào)節(jié)，儀器使吸收度為0（或透光率100%），然后再測樣品。

（3）測定波長的核對：為了提高測定靈敏度，減少測定誤差，吸收度一般應(yīng)在測定，測定樣品的與文獻(xiàn)記載對照，應(yīng)在規(guī)定波長±2nm以內(nèi)。

（4）供試品溶液的濃度：為了減少誤差，應(yīng)考慮使吸光度在0.3～0.7范圍內(nèi)（１）對照品比較法：（２）吸收系數(shù)法：（３）標(biāo)準(zhǔn)曲線法：5.含量測定：(1)對照法供試品溶液的吸光度對照品溶液的吸光度供試品溶液的濃度對照品溶液的濃度(2)吸收系數(shù)法計算(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線法配制系列濃度的對照品溶液，在λmax處測吸收度A，做吸光度—濃度曲線，測試樣品時，根據(jù)A在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上查C。（1）空白溶液與供試品溶液必須澄清，不得有渾濁。如有渾濁，應(yīng)預(yù)先過濾，并棄去初濾液。（2）測定時，除另有規(guī)定外，應(yīng)以配制供試品溶液的同瓶溶劑為空白對照，采用1cm的石英吸收池。（3）在測定時或改測其它檢品時，應(yīng)用待測溶液沖洗吸收池3～4次，用干凈綢布或擦鏡紙擦凈吸收池的透光面至不留斑痕（切忌把透光面磨損），放入樣品室每次方向應(yīng)一致。（4）取吸收池時，應(yīng)拿毛玻璃兩面，切忌用手拿捏透光面，以免粘上油污。使用完后及時用測定溶劑沖凈，再用純化水沖凈，用干凈綢布或擦鏡紙擦干，晾干后，放入吸收池盒中，防塵保存。若吸收池內(nèi)外壁沾污，用脫脂棉纏在細(xì)玻璃棒上蘸上乙醇，輕輕擦試，再用純化水沖凈。（5）儀器經(jīng)過搬動請及時檢查并糾正波長精度，并應(yīng)經(jīng)常校準(zhǔn)波長精度。6.注意事項特點：靈敏度高，可達(dá)10-10～10-12g/ml

要求低濃度下測定須做空白測定熒光弱的藥物可衍生化后測定二、熒光分析法第四節(jié)色譜分析法色譜法：是一種物理或物理化學(xué)分離分析方法。分離機制：分配、吸附、離子交換、分子排阻及親合色譜法優(yōu)點：高靈敏度、高選擇性、高效能、分析速度快、應(yīng)用范圍廣。應(yīng)用：各國藥典中廣泛用作純度檢查、含量測定。分類：流動相：氣體→氣相色譜法液體→液相色譜法固定相：固體或液體氣－固色譜法；氣－液色譜法；液－固色譜法；液－液色譜法操作形式：柱色譜法、平板色譜法、電泳法一、HPLC色譜法及定量方法（一）主要參數(shù)：1.基線：沒有樣品進(jìn)入檢測器時，噪音隨時間的變化。2.保留時間tR：從進(jìn)樣到組分色譜峰頂點的時間進(jìn)樣tRh0.5hWh/2Wt3.峰高h(yuǎn)/峰面積：從最高點到基線的距離（峰與基線圍成的面積）。4.峰寬W：拐點作切線在基線上的載距。W越窄柱效高。5.半峰寬Wh/2點：峰高一半處的峰寬。6.理論塔板數(shù)：

n=5.54(tR/wh/2)2

，一般n>103

，n越大柱效高進(jìn)樣tRh0.5hWh/2Wt7.分離度

R＝2（tR2－tR1）/（W1＋W2）R≥1.5認(rèn)為分離完全W1W2TR2-tR1（二）基本原理

待分離物質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配時，在固定相中溶解度較小的組分，在色譜柱中向前遷移速度較快；在固定相中溶解度較大的組分，在色譜柱中向前遷移速度較慢，從而達(dá)到分離的目的。依固定相與流動相極性的不同，分為正相色譜和反相色譜1.正相色譜法

流動相極性小于固定相一般用極性物質(zhì)作固定相，非極性溶劑(如苯、正己烷等)作流動相，主要用于分離極性化合物，極性小的組分先流出，極性大的組分后流出。2.反相色譜法

流動相極性大于固定相一般用非極性物質(zhì)作固定相，極性溶劑(如水、甲醇、己腈等)作流動相，主要用于分離非極性或弱極性化合物，極性大的組分先流出，極性小的組分后流出。（三）固定相和流動相1.固定相

常用化學(xué)鍵合相，分極性和非極性鍵合相，如十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18或ODS）和辛基硅烷鍵合硅膠（C8）為最常用的非極性鍵合相，用于反相色譜法；氨基和氰基硅烷鍵合相為常用的極性鍵合相，用于正相色譜法。2.流動相

有機溶劑+水混合一般為色譜純試劑，經(jīng)0.45um的微孔濾膜過濾，需脫氣處理

（四）儀器的基本結(jié)構(gòu)1.色譜柱柱管-不銹鋼，填充硅膠和化學(xué)鍵合固定相內(nèi)徑4.6mm長15cm、20cm和25cm的三種，如安捷倫色譜柱、Waters色譜柱、迪馬色譜柱等。2.檢測器常用紫外檢測器其次有二極管陣列檢測器(DAD)熒光檢測器示差折光檢測器蒸發(fā)光散射檢側(cè)器電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜檢測器等

（五）系統(tǒng)適用性試驗定義：指用規(guī)定的對照品對色譜系統(tǒng)進(jìn)行試驗，應(yīng)符合要求。包括柱溫、柱長、固定相、流動相；理論板數(shù)：說明分離過程，色譜柱的塔板數(shù)越多，柱效越高；分離度：應(yīng)大于1.5；重復(fù)性：相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%；等；（六）在雜質(zhì)檢查和含量測定中的應(yīng)用

1.內(nèi)標(biāo)法（加校正因子）方法：內(nèi)標(biāo)物+對照品→對照溶液，進(jìn)樣，測定，計算校正因子。RRssCACAf=校正因子CR對照品濃度As內(nèi)標(biāo)物峰面積CS內(nèi)標(biāo)物濃度AR對照品峰面積供試品+內(nèi)標(biāo)→供試品溶液，進(jìn)樣，測定供試品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，計算含量f=————A’S/C’SAx/CxCx=f·————

AxA’S/C’SCx樣品濃度Ax樣品峰面積例.HPLC法測定鹽酸阿夫唑嗪片（規(guī)格：5mg）的含量：取鹽酸特拉唑嗪約20mg，稱定，置100ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得內(nèi)標(biāo)溶液。取鹽酸阿夫唑嗪對照品約10mg，精密稱定，置10ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對照品儲備液，精密取該儲備液1ml，置100ml量瓶中，精密加內(nèi)標(biāo)溶液5ml，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對照品溶液；另取本品20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱細(xì)粉適量（約相當(dāng)于阿夫唑嗪10mg），置100ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液10ml，置100ml量瓶中，精密加內(nèi)標(biāo)溶液5ml，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得樣品溶液。分別精密取對照品溶液和樣品溶液各20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計算含量。操作：對照品取樣為10.1mg，20片重為1.6020g，取樣細(xì)粉稱重158.2mg，測得對照品溶液中鹽酸阿夫唑嗪和內(nèi)標(biāo)的峰面積分別為5470124和6126012，樣品溶液中阿夫唑嗪和內(nèi)標(biāo)的峰面積分別為5219986和61198978，計算本品的含量。解：對照品濃度：0.0101mg/ml,內(nèi)標(biāo)濃度：0.01mg/mgf=(AS/CS)/(AR/CR)=(6126012/0.01)/(5470124/0.0101)=1.13CX=f×AX/(AS/CS)=1.13×5219986/(6119898/0.0100)=0.009735mg/ml=[（0.009735×100×10/158.2)×（1.6020/20）/5]×100%=98.58%100％××平均片重==標(biāo)示量供試品重測得量含量％標(biāo)示量平均片重供試品重測得量100％×例.HPLC法測定單硝酸異山梨酯注射液（規(guī)格：5ml:20mg）的含量：取間三甲氧基苯約20mg，稱定，置100ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得內(nèi)標(biāo)溶液。取單硝酸異山梨酯對照品約8mg，精密稱定，置100ml量瓶中，精密加內(nèi)標(biāo)溶液5ml，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取本品2ml，同法測定，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計算含量。已知：對照品取樣為8.1mg，測得對照品溶液中單硝酸異山梨酯和內(nèi)標(biāo)的峰面積分別為5467824和6125843，樣品溶液中單硝酸異山梨酯和內(nèi)標(biāo)的峰面積分別為5221345和6122845，計算本品的含量。解：f=(AS/CS)/(AR/CR)=(6125843/0.01)/(5467824/0.081)=9.07

CX=f×AX/(AS/CS)=9.07×5221345/(6122845/0.01)=0.07735mg/ml

100％××裝量==標(biāo)示量取樣量測得量含量％標(biāo)示量裝量取樣量測得量100％×=[(0.7735×100/5)×2/20]×100%=96.68%2.外標(biāo)法對照液（R）：ARCR

供試液（X）：AXCXCXCRAXAR——＝——CX＝————CR·AXAR要求：進(jìn)樣量準(zhǔn)確、操作條件穩(wěn)定A總=∑Ai=A1+A2+…+Anⅰ(%)=Ai/A總×100%

例題7用氣相色譜法檢查大豆油的脂肪酸組成，相應(yīng)于棕櫚酸、硬酯酸、油酸、亞油酸和亞麻酸的峰面積分別為129758、43286、296522、654868、92570，按峰面積歸一化法，計算上述脂肪酸的百分含量。3、面積歸一化法二、氣相色譜法1.分離原理注入進(jìn)樣口的樣品經(jīng)加熱氣化后，被載氣帶入色譜柱，由于其分配系數(shù)的不同進(jìn)行分離，各組分先后進(jìn)入檢測器，信號記錄儀、積分儀和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號。分配系數(shù)小的組分先流出，分配系數(shù)大的組分后流出。2.色譜儀的基本結(jié)構(gòu)由載氣源、進(jìn)樣器、色譜柱、柱溫箱、檢測器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成３.載氣（流動相）：

如氦、氮和氫等

４.進(jìn)樣器：直接進(jìn)樣或頂空進(jìn)樣

微量注射器５.固定相和載體色譜柱為填充柱或毛細(xì)管柱

常用的固定液有甲基聚硅氧烷、不同比例組成的苯基甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。毛細(xì)管柱填充柱６.檢測器火焰離子化檢測器（FID)、熱導(dǎo)檢測器(TCD)、氮磷檢測器（NPD)、火焰光度檢測器(FPD)、電子捕獲檢測器(ECD)、質(zhì)譜檢測器(MS)７.色譜系統(tǒng)適用性和含量測定中的應(yīng)用同高效液相色譜法第五節(jié)藥品含量測定方法驗證1專屬性

2線性及其范圍

3精密度

4準(zhǔn)確度

5檢測限6定量限

7耐用性一、專屬性(Specificity)指有其他成分（雜質(zhì)、降解物、輔料等）可能存在情況下采用的方法能準(zhǔn)確測定出被測物的特性。分析復(fù)雜樣品混合物時衡量其是否受到干擾的一種方法。A-對照品B-樣品C-陰性二、線性與范圍(LinearityAndRange)①線性：在設(shè)計的范圍內(nèi)，測試結(jié)果與被測物濃度呈正比關(guān)系的程度。