細胞培養(yǎng)工程 01 緒論

細胞培養(yǎng)工程沈炳謙12課程安排以蛋白質藥物基因表達的細胞培養(yǎng)過程為主線：課堂教學考慮安排實驗操作訓練教材：中文教材更新慢，以課件為主，參考書自選一本?？荚嚦煽儯嚎记冢?0%考試方式（二選一，同學表決）：90%開卷考試（以課件內容為主）自選相關題目演講3教學計劃1緒論細胞結構與生理42細胞培養(yǎng)基43細胞培養(yǎng)理論44生物反應器-傳動現(xiàn)象45生物反應器-傳質現(xiàn)象46細胞培養(yǎng)模式與調控47生物反應器控制理論48發(fā)酵工程（或蛋白質純化）

考試4細胞培養(yǎng)工程南開大學藥學院4動物細胞培養(yǎng)過程張元興等2007參考書動物細胞培養(yǎng)基本技術指南(第5版)

BioprocessEngineeringPrinciplesPaulineM.Doran1995BasicBioreactorDesignvan'tRiet&Tramper1991CellCultureBioprocessEngineeringWei-ShouHu2012細胞培養(yǎng)工程元英進20125/china-mainland/zh/life-science/cell-culture/learning-center/cell-culture-manual.html緒論6根據(jù)中華人民共和國藥典，藥品分三類中藥化學藥生物制藥（目前主要是蛋白質藥物、疫苗等）美國FDA將藥品也分三類為小分子藥物（化學藥）大分子藥物（蛋白質藥物、疫苗等）細胞藥物（干細胞、組織工程、免疫治療等）2.&3.皆為生物藥78后現(xiàn)代藥學發(fā)展理念生命科學的快速發(fā)展，推動了以化學為主體的傳統(tǒng)藥學研究模式向以生命科學與化學相結合的新模式轉變；以分子生物學和細胞生物學為代表的現(xiàn)代生物學基礎研究與生物技術實踐雖然只有短短幾十年，對新藥（包括大分子藥物和細胞）的發(fā)現(xiàn)、研究、生產、質量管理和藥品臨床應用等方面均產生了重要影響；以現(xiàn)代生物技術手段生產的蛋白質多肽類藥物在臨床上的成功應用，使醫(yī)藥生物技術成為生物技術領域發(fā)展最快、效益最高、最有發(fā)展前景的應用領域；動物細胞培養(yǎng)工程是銜接現(xiàn)代生物學理論、新發(fā)現(xiàn)與化學工程原理，并應用于復雜蛋白質藥物研發(fā)、生產和新型細胞治療技術的關鍵環(huán)節(jié)和重要技術手段。8動物細胞培養(yǎng)9在體外培養(yǎng)動物細胞的專門技術，即在無菌條件下，（1）從機體中取出組織或細胞（原代細胞），或（2）利用已經建立的動物細胞系（細胞株），在模擬機體內生理狀態(tài)的基本環(huán)境條件下，讓細胞在培養(yǎng)容器（培養(yǎng)皿或生物反應器）中生存、生長和繁殖的方法；基礎研究：細胞培養(yǎng)在現(xiàn)代生物學研究中廣泛使用、不可或

缺的實驗技術；生物產業(yè)：大規(guī)模商業(yè)化生產。1010細胞培養(yǎng)：基礎研究應用細胞培養(yǎng)：基礎研究應用簡化環(huán)境條件，排除體內實驗復雜影響因素，便于應用生物、物理、化學等外界因素，探索和揭示細胞生命活動的基本規(guī)律；便于應用各種技術和方法，研究和觀察細胞結構與功能的變化；通常采用小型培養(yǎng)容器（如培養(yǎng)皿，96孔板等），培養(yǎng)基一般含有動物血清（如小牛血清，5-20%），細胞貼壁，靜止培養(yǎng)。11細胞培養(yǎng)：醫(yī)藥研發(fā)應用現(xiàn)代新型藥物開發(fā)必須依循生物學原理（生理作用機制），并盡可能利用（1）相關藥物作用靶點（生物大分子，目前主要是蛋白質如鴉片受體）或（2）載有靶點的工具細胞為評估對象，減少藥物發(fā)現(xiàn)的盲目性，提高藥物設計與篩選效率；藥物作用的細胞模型（具有商業(yè)價值）減少實驗動物的使用使藥物篩選微型化、高通量化、自動化，使信息采集效率大幅提高12細胞培養(yǎng)工程13細胞培養(yǎng)工程是以動物細胞為對象，研究在體外培養(yǎng)環(huán)境中細胞生長與產物合成的關系（動力學），并利用化學工程原理指導優(yōu)化生物反應器的攪拌、通氧、反應器操作模式以及培養(yǎng)環(huán)境控制，關乎產物質量（大分子藥物質量標準遠比小分子復雜）、生產效率、生產成本；細胞培養(yǎng)工程是應用大規(guī)模細胞培養(yǎng)技術從事生產過程工藝開發(fā)和過程放大的重要工程理論。大規(guī)模生產過程（上千升或更大）將細胞至于完全不同的生長環(huán)境，細胞在可控的生長環(huán)境中（生物反應器）經歷機械攪拌、通氧并對環(huán)境做出生理調整。如何控制細胞生長環(huán)境以滿足細胞生理需求、達到最高生產效率，需要化學工程原理與細胞生理的緊密結合。1414大規(guī)模細胞培養(yǎng)技術目前生物制品商業(yè)化生產的最重要工業(yè)技術，使眾多疾病得到前所未有的治療蛋白藥物：抗體，血液蛋白，細胞因子，疫苗病毒：疫苗，基因治療載體細胞治療與再生醫(yī)學等新興治療直接受益干細胞與組織工程原代細胞體外擴增與分化組織工程部件體外構建細胞治療：免疫治療等大規(guī)模細胞培養(yǎng)技術的發(fā)展脈絡組織與細胞培養(yǎng)病毒疫苗細胞天然分泌物有血清貼壁培養(yǎng)生化制藥臟器藥物提取胰島素，白蛋白等深層發(fā)酵技術（攪拌，通氧）WWII，開啟抗生素、氨基酸、維生素、酶等新工業(yè)重組人蛋白質表達（E.coli）胰島素，生長激素，G-CSF，-干擾素，淋巴介素-2高分子量基因可能有問題缺乏翻譯后修飾，尤其是二硫鍵連接與糖基化微生物發(fā)酵厭氧發(fā)酵技術WWI，有機溶劑（炸藥干燥）多種反應器設計無血清培養(yǎng)基研發(fā)無血清懸浮培養(yǎng)重病毒疫苗組人蛋白質表達翻譯后修飾大規(guī)模無血清懸浮重組人蛋白質表達病毒疫苗改進攪拌式反應器設計解決細胞損傷無細胞（Cellfree）蛋白質表達E.coli胞漿加入伴侶蛋白可以二硫鍵連接生物制藥歷史回顧生物技術發(fā)展簡史疫苗生化制藥（臟器藥物）16生物技術發(fā)展簡史：傳統(tǒng)生物技術

人類傳統(tǒng)釀造技術有數(shù)千年歷史，但直到顯微鏡的發(fā)明，人類才獲知微生物的存在，并進一步獲知“酵素”（酶）的存在；工業(yè)微生物：19世紀末到20世紀30年代，微生物發(fā)酵生產初級代謝產品，如乳酸、乙醇、丙醇、丁醇、檸檬酸（WWI用于炸藥干燥）及淀粉酶（蛋白質）等。17生物技術發(fā)展簡史：近代生物技術青霉素1928年Fleming發(fā)現(xiàn)青霉素，放線菌次級代謝產物；1939年Florey&Chain：提取純化、臨床試驗；1941年，英美聯(lián)合開發(fā)青霉素生產工藝，用于WWII傷員感染治療1943年，生產1公斤20%含量青霉素表面培養(yǎng)法80,000個1L搖瓶勞動力消耗巨大（清洗、裝料、滅菌、接種、培養(yǎng)、出料等操作）18生物技術發(fā)展簡史：近代生物技術

青霉素生產工藝的技術革命：深層發(fā)酵技術：5,000L，攪拌式發(fā)酵罐；放線菌菌種誘變、選育；發(fā)酵（培養(yǎng)）過程優(yōu)化；提煉技術及其設備等方面；產品產量和質量都大幅度提高，生產效率明顯提高，成本顯著下降；促進發(fā)酵工程技術成為近代生物制藥工業(yè)的基礎技術。19生物技術發(fā)展簡史：近代生物技術深層發(fā)酵技術的廣泛應用抗生素工業(yè)：鏈霉素、金霉素、紅霉素等氨基酸發(fā)酵工業(yè)：上世紀五十年代酶制劑工業(yè)環(huán)境保護技術主要產品醫(yī)藥藥品：抗生素、維生素、甾體激素、氨基酸等；食品工業(yè)：酶制劑、氨基酸、酵母、啤酒等；化學工業(yè)：醇類、有機酸、農藥等。20生物技術發(fā)展簡史：近代生物技術生物分離（下游過程）技術與設備離子交換技術凝膠色譜技術膜分離技術親和色譜技術1952年獲諾貝爾化學獎（分溶層析法）21ArcherJohnPorterMartinRichardLaurenceMillingtonSynge生物技術發(fā)展簡史：近代生物技術疫苗工業(yè)1796年：牛痘疫苗1930年代：小鼠腦組織或雞胚培養(yǎng)繁殖病毒方法黃熱病、流腦、乙腦、森林腦炎和斑疹傷寒疫苗1950年代：離體細胞培養(yǎng)物中繁殖病毒的技術；小兒麻痹癥、麻疹、腮腺炎等新疫苗。2223骨髓灰質炎疫苗

骨髓灰質炎病毒陽性mRNA病毒7,500核甘酸，編碼唯一（殼）蛋白質直徑30納米結構最簡單病毒骨髓灰質炎（小兒麻痹癥）病毒從口腔進入，感染腸道黏膜上皮細胞并繁殖，經血液進入大腦或脊髓感染源為病患糞便和口鼻分泌物兒童較成年人更易感，導致終生殘廢2424骨髓灰質炎病毒體外繁殖1948年3月，Weller在設法用人胚胎肺細胞培養(yǎng)制備水痘病毒的實驗中，將多余的幾個試管接種了骨髓灰質炎病毒；前者失敗，后者為體外制備病毒成功先例；54年諾貝爾生理醫(yī)學獎EndersWellerRobbinsJonasSalk（1914

–1995）骨髓灰質炎滅活疫苗（Salkvaccine）1952年Verocellline（猴腎）培養(yǎng)接種骨髓灰質炎病毒福爾馬林滅活1955年正式投入預防使用骨髓灰質炎疫苗

主要人類病毒疫苗25DiseaseSourceofvaccineViralconditionPoliomyelitisTC(humandiploidcellline,monkeykidneyLiveattenuated,inactivatedMeaslesTC(chickenembryo)LiveattenuatedMumpsTC(chickenembryo)LiveattenuatedRubellaTC(duckembryo,rabbitorhumandiploid)LiveattenuatedSmallpox(vaccinia)Lymphfromcalforsheep(glycerolated,lyophilized)LivevacciniaSmallpox(vaccinia)Chorioallantois,TC(lyophilized)VacciniaYellowfeverTCandeggs(17Dstrain)LiveattenuatedInfluenzaHighlypurifiedsubunitformsofchickenembryoallantoicfluid(formalinizedUVirradiated)InactivatedInfluenzaCC(MDCK,Vero)AttenuatedRabiesDuckembryo,rabbitorhumandiploidInactivatedAdenovirusCC(Humandiploidcells)LiveattenuatedJapaneseBencephalitisMousebrain(formalinized),CCInactivatedVenezuelanequinecephalomyelitisGuineapigheartcellcultureLiveattenuatedEasternequineChickenembryocellcultureInactivatedWesternequineChickenembryocellcultureInactivatedRussianspring-summerencephalitisMousebrain(formalinize)InactivatedTC-tissuecultureCC-cellcultureSource:CellCultureBioprocessingEngineering,2012生物技術發(fā)展簡史：近代生物技術26生化制藥：早期蛋白質藥物生產，采用生化分離技術，從生物體構成中分離、純化、制備用于疾病預防、治療和診斷的生物活性物質原上海長城生化制藥廠（1980）：抑肽酶：牛肺臟，胰蛋白酶抑制劑，胰腺炎細胞色素C：豬心臟，營養(yǎng)不良現(xiàn)代生物技術基因重組蛋白質表達技術1953年：DNA雙螺旋結構；1966年：破譯了DNA三聯(lián)體密碼，隨之證明遺傳的中心法則；1973年：建立了體外重組DNA方法；1982年：重組人胰島素投放市場，由此開啟重組蛋白質藥物時代重組DNA技術日臻成熟；微生物發(fā)酵技術；大規(guī)模細胞培養(yǎng)技術；人類基因組計劃。27從生化制藥到生物技術制藥

胰島素（Insulin）

人血清白蛋白（HSA）2829胰島素1921年由Banting

&

Macleod發(fā)現(xiàn)1955年Sanger測定牛胰島素氨基酸序列A鏈（21AA），B鏈（30AA）二硫鍵連接：A鏈與B鏈之間兩對，A鏈內部一對胰島素的生理過程：胰島素基因區(qū)位于第11對染色體短臂胰島β細胞核DNA向mRNA轉錄，mRNA從細胞核移向細胞漿內質網，轉譯成前胰島素原（105AA）經過蛋白水解酶剪切生成胰島素原（86AA）；胰島素原隨細胞漿微泡進入高爾基體，由蛋白水解酶剪切生成胰島素和C肽；在血糖刺激之下，β細胞分泌胰島素，進入血液循環(huán)

30非人源胰島素的臨床應用第一代胰島素（動物胰島素）1922年動物胰島素開始用于糖尿病臨床治療直至80年代初，醫(yī)用胰島素都是來自豬、牛胰臟提取不同種屬哺乳動物胰島素分子的氨基酸序列和結構稍有差異，其中豬胰島素與人的最為接近（1-4個AA差異）主要問題容易發(fā)生免疫反應，包括過敏反應和抗異源胰島素抗體形成（胰島素作用失效，與胰島素抵抗不是一碼事）注射部位皮下脂肪萎縮或增生容易反復發(fā)生高血糖和低血糖31人胰島素第二代胰島素20世紀80年代，通過基因工程（重組DNA技術）將人胰島素基因轉染至細胞表達高純度的合成人胰島素；酵母：微生物發(fā)酵過程中國倉鼠卵巢（CHO）細胞：動物細胞培養(yǎng)免疫反應低，較少誘發(fā)免疫反應（包括過敏反應），注射劑量比動物胰島素平均減少30%，皮下脂肪萎縮的現(xiàn)象也隨之減少；人胰島素的穩(wěn)定性高于動物胰島素；主要問題：在起效時間、峰值時間、作用持續(xù)時間上仍不能模擬生理性胰島素分泌模式，使用也不方便32人胰島素類似物第三代胰島素20世紀90年代末，基于對人胰島素結構與功能的深入了解，研制更適合人體生理需要、更方便使用的胰島素類似物利用基因工程技術改變胰島素肽鏈上某些位點的氨基酸組合（蛋白質工程），改變等電點，增加六聚體強度；以鈷離子替代鋅離子；在分子中增加脂肪酸鏈，加大與白蛋白的結合；口服劑型（腸道生物利用率過低）33人血清白蛋白（HSA）理化性質：單鏈多肽（585AA）分子量66kD血漿唯一非糖基化蛋白質濃度范圍35-50g/L含量約占血漿總蛋白的60%生理特性：在肝臟合成，半衰期約為20天；維持血液正常的滲透壓；運輸脂肪酸、膽色素、氨基酸、類固醇激素、金屬離子和非水溶性藥物分子等34人血清白蛋白（HSA）在臨床上，人血清白蛋白可用于治療休克與燒傷，用于補充因手術、意外事故或大出血所致的血液丟失，也可以作為血漿增容劑；適應癥：用于失血性休克、腦水腫、流產引起的白蛋白缺乏、腎病等；用量用法：靜注或靜滴：用量視病情而定；規(guī)格：注射液，每支（瓶）25%20ml。35天然人血清白蛋白的提取純化工藝BritishJournalofAnaesthesia85(6):887-95(2000)現(xiàn)代純化技術36人血清白蛋白（HSA）從人血清提取白蛋白的主要問題生物污染風險：傳染病原體如HIC、HBV、HCV等高原料成本：人血漿原料昂貴，來源有限雜質：雜質種類多，含量高生產成本：純化成本一般占生產成本的50%以上37人血清白蛋白（HSA）基因工程酵母大規(guī)模發(fā)酵：酵母屬于微生物，易培養(yǎng)，繁殖快，遺傳背景比較清楚，便于基因工程操作

構建HSA基因表達載體；轉染酵母細胞；酵母細胞將HSA基因轉錄、翻譯成多肽鏈；酵母細胞具有真核細胞的蛋白質翻譯后加工能力，包括多肽鏈正確折疊（蛋白質活性）的胞內環(huán)境和糖基化修飾系統(tǒng)（對某些蛋白質活性至關重要），但HSA無需糖基化；酵母細胞具有蛋白質產物分泌機制，無需破碎細胞，產物濃度高，雜質含量低，利于降低純化難度和成本；酵母大規(guī)模發(fā)酵屬于成熟工業(yè)技術；生物污染風險極低。38生化制藥的局限性原料來源有限，尤其是種屬特異性高的藥用蛋白（如hGH）即使是異種屬蛋白質藥物（如豬胰島素），目標蛋白質在原料中的含量相對極低，而且雜質種類多、總含量高，不利于目標蛋白質的純化，回收率低，因此生產效率低下，成本高，不利于商業(yè)化生產并滿足市場需求（純化成本一般占生產成本50%以上，牢記）原料來源：依原料性質而論安全風險：原料生物污染瘋牛病/病毒污染/其它微生物污染豬很可能是人-禽類病毒傳染的媒介避免動物來源原料是生物制藥行業(yè)的總體趨勢39生物技術制藥的優(yōu)越性開發(fā)安全、高效、低成本生產工藝，始終是促進生物制藥行業(yè)發(fā)展的主要推動力原料：來源穩(wěn)定，不受季節(jié)影響，成分明確，非動物工藝：過程重復性好，生產穩(wěn)定，過程可放大以滿足大規(guī)

模商業(yè)化生產產率：目標蛋白質濃度高，益于純化，高收率雜質：宿主細胞蛋白藥物安全性：免疫原性：非人源糖型有可能誘導免疫反應宿主內源性病毒明確（如嚙齒類逆轉錄病毒顆粒），純化工藝將其控制在安全范圍之內宿主細胞蛋白質、DNA控制在安全范圍從生產原料上阻斷生物污染（如病毒）40

在蛋白質藥物商業(yè)化生產中，借助于基因工程技術，細胞培養(yǎng)技術與微生物發(fā)酵技術大規(guī)模表達生產重組蛋白質藥物，不但無限拓寬了蛋白質藥物品種，也能在質量控制體系（GMP）的框架之內高效、低成本生產重組蛋白質藥物，幾乎全面取代生化制藥（臟器藥物提?。；蚬こ蹋ㄖ亟MDNA技術）以分子遺傳學理論為基礎，以分子生物學和微生物學的現(xiàn)代方法為手段，將不同來源的基因（DNA片段，轉基因），按預先設計的藍圖（基因表達載體），在體外構建成雜交DNA分子，然后導入活細胞，以細胞自有機制對轉基因進行轉錄、翻譯，甚至后修飾、分泌。宿主細胞選擇原核：E.coli真核：哺乳動物、昆蟲、酵母414242遺傳信息傳遞43蛋白質結構一級結構：按照基因上遺傳密碼的排序，不同氨基酸通過肽鍵連接成線性序列；二級結構：依靠不同氨基酸之間的C=O和N-H基團間的氫鍵形成的穩(wěn)定結構，主要為α-螺旋和β-折疊等；三級結構：通過多個二級結構元素在三維空間的排列所形成的一個蛋白質分子的三維結構（蛋白質分子或亞基）。四級結構：用于描述由不同多肽鏈（亞基）間相互作用形成具有功能的蛋白質復合物分子。44蛋白質翻譯后修飾在翻譯完成之后，前體蛋白通常沒有活性，需要一系列的翻譯后加工步驟，才能具有生物學功能；翻譯后加工類型：N-端Met的切除二硫鍵的形成肽鏈剪切化學修飾：引入官能團，以改變蛋白質的化學性質磷酸化、硫酸化、醋酸化、烷基化、乙酰化、生物素化、硫辛酸化等糖基化：糖蛋白質普遍存在45蛋白質糖基化蛋白質與寡糖結合方式：數(shù)十個基因參與O-糖苷鍵：絲氨酸、蘇氨酸的羥基與糖的半縮醛羥基N-糖苷鍵：天冬酰胺的酰胺基與糖的半縮醛羥基同一糖基化位點糖基結構可能不同（microheterogeinity）并非所有糖基化位點全部占用，同蛋白分子可能有不同糖基化組合（macroheterogeinity）46蛋白質糖基化糖基化對蛋白質的影響：細胞內：糖基化在肽鏈（ER）翻譯與折疊的同時即已開始，以影響多肽的溶解性、聚集和折疊產物的穩(wěn)定性糖基化對蛋白質分子在血液循環(huán)中的半衰期影響甚大非糖基化蛋白質比糖基化蛋白質更快被肝臟截獲，糖鏈末端唾液酸化可以降低肝臟對蛋白質的截獲糖基化為許多蛋白質生物活性所必需IgG：與補體和Fc受體結合（ADCC）所必需Epo：生物活性所必需47蛋白質糖基化糖基的免疫原性（Antigenicity）絕大多數(shù)蛋白質藥物系糖蛋白質；細胞內糖基化酶系高度保守，糖型具有種屬特異性；非人細胞所表達蛋白質有可能因糖型差異而引發(fā)免疫反應，誘導體內產生抗體，其后果是蛋白質藥物被抗體中和而失效；重組蛋白質藥物生產必須采用適當細胞株，避免或最大限度降低由糖基引起的免疫原性48重組蛋白質藥物表達主要細胞（株）來源細胞（株）注釋中國倉鼠ChineseHamsterOvary（CHO）由于歷史原因，CHO細胞是目前采用最多的生產細胞株。非人源糖型，免疫原性未引起大問題人HEK293,PerC6人源糖型，潛力巨大小鼠NS0,SP2/0,hybridomas非人源糖型，免疫原性很低敘利亞倉鼠BHK昆蟲Sf9,Hi-Five非人源糖型，疫苗（抗原）表達酵母畢赤酵母非人源糖型，非糖基化蛋白質或疫苗（抗原）表達細菌大腸桿菌形成包涵體，非糖基化、無二硫鍵蛋白質表達，二硫鍵可在氧化復性環(huán)境或伴侶蛋白協(xié)助下形成4949MolecularCellBiology(5thed.)byLodishetal.原核細胞-真核細胞5050蛋白質產物分子量真核：基本上對分子量沒限制原核：適合表達分子量低于5KD的蛋白質多肽翻譯后修飾機制真核：YES，但種屬差異很大原核：NO后修飾為許多蛋白質功能所必需如抗體、促血紅素產物分泌機制真核：YES，蛋白質以天然構象形式分泌至胞外原核：NO，缺乏多肽鏈正確折疊與二硫鍵正確連接的機制，多肽以包涵體形式存在，后續(xù)加工包括細胞破碎、包涵體溶解、蛋白質復性，工藝復雜，成本高真核與原核細胞基因表達的主要差別生物技術藥物的特性分子結構復雜：分子量較大；分子結構復雜，除肽鏈之外，可能還有二硫鍵連接以及翻譯后修飾如糖基化、磷酸化等具有種屬特異性：治療針對性強、療效高：生物藥物是天然存在的蛋白質或多肽，量微且生物活性強，極小用量就會產生顯著效應，相對來說不良反應較少，毒性較低，安全性較好；穩(wěn)定性低：易變性失活，易被蛋白酶破壞，易微生物污染；51生物技術藥物的特性

5.基因穩(wěn)定性：生產菌株或細胞系的穩(wěn)定性和生產條件的穩(wěn)定性非常重要，變異會導致藥物生物活性的變化或不希望的生物學活性。6.免疫原性：一些人源性蛋白質在人體中也能產生抗體，重組藥物可能與天然蛋白質存在結構和構象上的差異；7.體內半衰期短：生物藥物降解迅速，體內降解的部位廣泛；8.受體效應：許多生物藥物是通過與特異性受體結合、信號傳導機制而發(fā)揮藥效作用，且受體分布具有動物種屬特異性和組織特異性，因此在體內有組織特異性和藥效反應快的特點；52生物技術藥物的特性

9.多效性和網絡性效應：許多生物藥物作用于多種組織或細胞，且在體內相互誘生、調節(jié)、協(xié)同或頡頏，形成網絡效應，從而具有多種功能、多種藥理作用；10.檢驗的特殊性：生產系統(tǒng)復雜，生產批次間的一致性及安全性的變化大于化學產品，因此，對生產過程的監(jiān)測、GMP步驟的要求和質控的要求更為重要和嚴格。53非動物宿主細胞生產蛋白質藥物54Drug(Tradename)Activity/UseGranulocytecolony-stimulatingfactor(Neupogen)WhitebloodcellgrowthforneutropeniaInsulin(Humulin)Diabetes-Interferon(Intron-A)Anticancer,viralinfectionsSomatotropin(Humatrope)GrowthdeficienciesSomatotropin(Protopin/Nutropin)GrowthdeficienciesInterleukin-2(Proleukin)KidneycancerSource:CellCultureBioprocessingEngineering,2012動物細胞表達非抗體蛋白質藥物55Source:CellCultureBioprocessingEngineering,2012TradenameTypeTherapeuticuseManufacturerUSapprovalHostActivaseTissueplasminogenactivatorAcutemyocardialinfarctionGenentech1987CHOEpogen/ProcritEPOAnemiaAmgen/OrthoBiotech1989CHOPulmozymeDeoxyribonucleaseICysticfibrosisGenentech1993CHOCerezyme-glucocerebrosidaseGaucher’sdiseaseGenzyme1994CHOAvonexInterferon-RelapsingmultiplesclerosisBiogenIdec1996CHOFollistim/Gonal-FFolliclestimulatinghormoneInfertilitySerono/NVOrganon1997CHOEnbrelTNFreceptorfusionRheumatoidarthritisAmgen,Wyeth1998CHOBenefixFactorIXHemophiliaAWyeth2000CHOTenecteplaseTissueplasminogenactivator

(engineered)AcutemyocardialinfarctionGenentech2000CHOReFactoFactorVIIIHemophiliaAWythe2000CHOAranespEPO(engineered)AnemiaAmgen2001CHORebifInterferon-RelapsingmultiplesclerosisSerono2002CHOFabrazyme-galactosidaseFabrydiseaseGenzyme2003CHOAdvateFactorVIII(engineered)HemophiliaABaxter2003CHOLuverisLuteinizinghormoneInfertilitySerono2004CHONaglazymeN-acetylgalactosamine4-sulfataseMucopolysaaccharidosisVIBioMarin2005CHOOrenciaIg-CTLA44fusionRheumatoidarthritisBristol-MyersSquibb2005CHOMyozyme-galactosidasePompe’sdiseaseGenzyme2006CHOAldurazymeLaronidaseMucopolysaaccharidosisIGenzyme2006CHO動物細胞表達抗體藥物（早期）56Source:CellCultureBioprocessingEngineering,2012TradenameMabTypeTherapeuticuseManufacturerUSHostOKT3Anti-CD3,MurineAcutekidneytransplantrejectionJ&J1986HybridomaReoProAnti-AbciximabPreventionofbloodclotsCentocor1994SP2/0RituxanAnti-CD20Non-Hodgkin’slymphomaGenentech1997CHOZenapaxHumanized,anti--chain,IL-2receptorAcutekidneytransplantrejectionPDL1997NS0SimulectChimeric,anti--chain,IL-2receptorAcutekidneytransplantrejectionNovartis1998SynagisHumanized,anti-A-antigenofRSVLowerrespiratorytractdiseaseMedImmune1998CHORemicadeAnti-TNF-ActiveCrohn’sdiseaseCentocor1998SP2/0HerceptinAnti-HER2MetastaticbreastcancerGenentech1998CHOMylotargAnti-CD33AcutemyeloidleukemiaWythe2000CHOCampathAnti-CD52ChroniclymphocyticleukemiaMillennium2001CHOZevalinAnti-CD20,murineNon-Hodgkin’slymphomaBiogenIdec2002CHOHumiraAnti-TNF-RheumatoidarthritisAbbott2002CHOXolairHumanized,anti-IgEModerate/severeasthemaGenzyme2003CHOBEXXARAnti-CD20FollicularNon-Hodgkin’slymphomaGSK2003CHORaptivaAnti-CD11aChronicpsoriasisGenentech2003CHOErbituxChimericmAbanti-hEGFreceptorEGFRexpressingmetastaticcolorectalcancerBMS,Merck2004CHOAvastinAnti-VEGFMetastaticcolorectal&lungcancerGenentech2004CHOVectibixAnti-EGFRMetastaticcolorectalcancerAmgen2006CHOSolirisAnti-CD5ParoxysmalnocturnalhemoglobinuriaAlexion2007NS0抗體藥物雜交瘤細胞與單克隆抗體Kohler&

Milstein（1975）將小鼠骨髓瘤細胞（有分裂增殖能力）與免疫的動物脾細胞（B細胞，分泌單一種抗體）融合，形成即能增殖又能分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞；抗原-抗體結合具有極高特異性與親和力，抗體可以成為靶向藥物的基礎（生物導彈）。57抗體藥物作用機制58中和效應因子：抗體與腫瘤壞死因子（TNF-）結合，使其不能再與細胞表面受體結合，減緩炎癥，適用于類風濕性關節(jié)炎、牛皮癬和克羅恩?。荒[瘤生物治療：抗體可以負載細胞毒性藥物或放射性，在腫瘤組織上與表面抗原結合、富集、殺傷腫瘤細胞；抗體錨定腫瘤組織之后，其Fc與天然免疫細胞（如巨噬細胞和自然殺傷細胞）表面Fc受體結合，誘發(fā)后者殺傷效應；封閉T淋巴細胞表面PD-1或腫瘤組織表面PD-L1，阻止腫瘤細胞對T淋巴細胞的壓制，達到T淋巴細胞對腫瘤的殺傷效應。南開大學藥學院細胞培養(yǎng)工程細胞培養(yǎng)工程Nature480(22):480-489,29December2011CancerimmunotherapycomesofageMellman,Coukos&Dranoff60激活或抑制T淋巴細胞功能的抗體藥物對于腫瘤治療具有很好的前景已處于臨床試驗階段抗體藥物6161抗體藥物類型抗體藥物類型演化降低種屬差異免疫反應提高藥效OKT3鼠源抗體免疫反應使其作用失效抗體工程：IgG抗體結構與功能干細胞與組織工程

特殊生物反應器專用無血清培養(yǎng)基腫瘤免疫治療（DC-CIK）636464現(xiàn)代動物細胞培養(yǎng)

生物醫(yī)藥工業(yè)的主要技術構成分子生物學與基因工程技術基因表達機制基因表達載體構建宿主細胞設計：CHO：DHFR雙敲除CHO/NS0：GS系統(tǒng)PERC6，HEK293蛋白質純化親和層析：Protein-A/G;AKTA：提高純化工藝過程開發(fā)速度和質量；更多的樹脂選擇；膜技術：過濾、濃縮。大規(guī)模細胞培養(yǎng)技術細胞株構建與篩選合成培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基