蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、DNA相互作用研究方法加實例

蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用研究方法蛋白質(zhì)與DNA相互作用研究方法蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用的研究方法酵母雙雜交系統(tǒng)YeastTwo-HybridSysterm免疫共沉淀Co-immunoprecipitation(Co-IP)GSTpull-down技術(shù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移FluorescentResonantEnergyTransfer（FRET）雙分子熒光互補（BimolecularFluorescentComplement）BIFC蛋白質(zhì)芯片技術(shù)其它方法酵母雙雜交系統(tǒng)1.1酵母雙雜交技術(shù)的原理

酵母雙雜交系統(tǒng)由Fields和Song等首先在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中建立。他的產(chǎn)生是基于對酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4性質(zhì)的研究.

基因轉(zhuǎn)錄不僅需要有特定的DNA順式序列結(jié)構(gòu)，而且也需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。轉(zhuǎn)錄激活因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,其中有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNAbindingdomain,

DB)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain,

AD),它們都是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。單獨的BD或AD都不能激活基因轉(zhuǎn)錄，但不同轉(zhuǎn)錄激活因子的DB和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉(zhuǎn)錄的功能。

如果要研究兩個蛋白之間有無相互作用，可以把這兩個蛋白分別與DB和AD形成的融合蛋白。與DB融合的蛋白稱為“誘餌”(bait)，與AD融合的蛋白稱為“獵物”(prey)。

如果這兩個蛋白能發(fā)生相互作用,這兩個融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的轉(zhuǎn)錄激活因子,從而激活報告基因(reportergene)的轉(zhuǎn)錄與表達。

通過檢測報告基因的表達產(chǎn)物,可判別“誘餌”和“獵物”這兩個蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。

1.1酵母雙雜交技術(shù)的原理同時將上述兩種載體轉(zhuǎn)化改造后的酵母，這種改造后的酵母細胞的基因組中既不能產(chǎn)生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏這些營養(yǎng)的培養(yǎng)基上無法正常生長。當上述兩種載體所表達的融合蛋白能夠相互作用時，功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，從而通過功能互補和顯色反應篩選到陽性菌落。1.2酵母雙雜交操作主要流程1.分別構(gòu)建BD和AD融合蛋白載體2.分別將重組載體轉(zhuǎn)化酵母菌細胞3.對酵母轉(zhuǎn)化子進行自激活檢測4.將重組載體共轉(zhuǎn)化酵母菌細胞5.檢測報告基因表達產(chǎn)物6.分析酵母雙雜交實驗結(jié)果BDADBDADBDADxYIdentificationandCharacterizationofFAM124BasaNovelComponentofaCHD7andCHD8ContainingComplex實例Method：ForyeasttwohybridstudieswegeneratedtheconstructsFAM124B-1,3-pGADT7(transcriptvariant1)andFAM124B-1,2-pGADT7(transcriptvariant2)FAM124B-1,3-pGBKT7(transcriptvariant1,FAM124B-1,2-pGBKT7(transcriptvariant),Thesebothplasmidswereco-transformedintoY2HGoldstraincellstogetherwitheithertheCHD7-CR1-3-pGBKT7(aminoacids1591-2181)ortheCHD8-pGBKT7(aminoacids1789–2302)plasmids.TserendulamBatsukh,YvonneSchulz,et.al.IdentificationandCharacterizationofFAM124BasaNovelComponentofaCHD7andCHD8ContainingComplex.PLoSOne.2012;7(12):e52640Yeasttwohybridassay.DirectyeasttwohybridexperimentwiththeconstructsFAM124B-1,3-pGADT7(fulllengthtranscriptvariant1)andCHD7-CR1-3-pGBKT7(aminoacids1591-2181,demonstratingnodirectinteractionbetweenFAM124Btranscriptvariant1andtheCHD7part,while(B)DirectyeasttwohybridexperimentwiththeconstructsFAM124B-1,3-pGADT7(fulllengthtranscriptvariant1)andCHD8-pGBKT7(aminoacids1789–2302,showsadirectinteraction.ThesameexperimentswereperformedforFAM124Btranscriptvariant2.(C)DirectyeasttwohybridexperimentwiththeconstructsFAM124B-1,2-pGADT7(fulllengthtranscriptvariant2)andCHD7-CR1-3-pGBKT7(aminoacids1591-2181,(D)DirectyeasttwohybridexperimentwiththeconstructsFAM124B-1,2-pGADT7(fulllengthtranscriptvariant2)andCHD8-pGBKT7(aminoacids1789–2302,FAM124Btranscriptvariant2interactsdirectlywiththeCHD8part,whilenodirectinteractionwiththeCHD7partcouldbeobserved.

酵母雙雜交系統(tǒng)是一種在酵母細胞內(nèi)分析蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)。主要有二類載體:a含DNA-bindingdomain的載體;b含Transcription-activatingdomain的載體。另外還需要特殊的酵母菌株如GAL4缺陷型。1.3應用

它可用于：檢驗蛋白質(zhì)間的相互作用；分析蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域；發(fā)現(xiàn)新的作用蛋白質(zhì)。1.4酵母雙雜交技術(shù)的優(yōu)點：是一種細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)，比體外的蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)更接近生物體內(nèi)的真實情況。基于基因重組技術(shù)和分子遺傳學的原理，更便于觀察和檢測實驗結(jié)果。酵母菌是一種低等真核微生物，能反映真核生物的基本生命現(xiàn)象和規(guī)律。4.酵母菌生長迅速、容易培養(yǎng)，便于進行高通量、大規(guī)模的組學研究。1.5酵母雙雜交技術(shù)的弱點：1.假陽性：自激活、多因子參與……假陰性：毒性蛋白、膜蛋白、難表達的蛋白……低等真核細胞不能完全等同于高等真核生物的情況

酵母雙雜交實驗的結(jié)果必須經(jīng)過多方面的驗證，包括：體外相互作用驗證體外親和純化（GSTpull-down）、體外免疫共沉淀……哺乳動物細胞內(nèi)驗證亞細胞共定位、體內(nèi)免疫共沉淀……優(yōu)點：生理條件下的結(jié)合缺點：可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用二、免疫共沉淀2.1定義及原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）：是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。原理：當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)x的抗體免疫沉淀x，那么與x在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)y也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。2.2方法1)收獲培養(yǎng)的細胞（1×107－1×108）冷PBS洗滌2次2）細胞裂解液裂解細胞，冰浴30min3)12000rpm離心30min4）收集上清并加入適量抗體，4oC搖動1h～過夜5）加入ProteinA/G-Sepharose(瓊脂糖凝膠)懸液，4oC搖動1h6）細胞裂解液洗滌ProteinA/G-Sepharose混合液7）離心棄上清8）沉淀加2×蛋白LoadingBuffer煮沸5－10min9）離心，上清液跑SDS膠10）考馬氏亮蘭染色、銀染

WesternBlot質(zhì)譜分析3.注意事項1）細胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細胞內(nèi)存在的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或TritonX-100)。每種細胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗確定。不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)，細胞裂解液中要加各種蛋白酶酶抑制劑，如商品化的cocktailer。2）使用明確的抗體，有的抗體不適宜做免疫共沉淀。3)對照實驗的設(shè)計。IdentificationandCharacterizationofFAM124BasaNovelComponentofaCHD7andCHD8ContainingComplex實例(A)Usingtheanti-CHD8(abcam,ab84527)ortheanti-CHD7(abcam,ab31824)antibodyforprecipitation,wedetectedwiththeanti-HAantibody(Roche)anapproximately51kDabandcorrespondingtotheestimatedsizeofFAM124Btranscriptvariant1.Lane1:co-transfectedCo-IP,lane2:untransfectedHeLacellsasnegativecontrol.三、GSTpull—down技術(shù)3.1定義及原理—定義：該技術(shù)是通過以適當標簽和目的基因進行融合表達作為誘餌．從細胞提取物中釣出與目的蛋白相互作用的蛋白。多組分蛋白質(zhì)復合物的分離主要利用固定在瓊脂糖樹脂的反標簽系統(tǒng)完成。—原理：將誘餌蛋白質(zhì)和用谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-transferase，GST）標簽融合表達，一步純化后與含有目的蛋白質(zhì)的溶液進行孵育．利用谷胱甘肽瓊脂糖球珠將GST-融合蛋白-目的蛋白復合物沉淀下來，然后進行聚丙烯酞胺凝膠電泳(SDS—PAGE)鑒定與誘餌蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)

兩種應用：1）確定融合（或探針）蛋白與未知（或靶）蛋白間的新的相互作用2）證實探針蛋白與已知蛋白質(zhì)間可疑的相互作用3.2方法：

1）GST融合蛋白先與下列蛋白溶液之一孵育（a,單一明確的重組蛋白；b，細胞裂解蛋白混合液；c,體外翻譯cDNA表達得到的未知蛋白）2）混合液與谷胱甘肽瓊脂糖球珠反應4oC2h3）離心棄上清4）沉淀加入2×蛋白LoadingBuffer煮沸，離心5）取上清進行SDS電泳，6）考馬氏亮蘭染色觀察特異沉降的蛋白帶，進一步做質(zhì)譜分析確定沉降的蛋白；電泳后的膠也可以做WesternBlot來確定沉降的蛋白中是否有目的蛋白注意：該實驗設(shè)立GST對照，反應均在4oC進行右邊為GST對照3.3GST融合蛋白沉降實驗結(jié)果CK2α′GST-TP1GST

Fig10GSTpulldownassayM:proteinmolecularweightstandardLane1:GSTLane2:GST-TP1+CK2α′Lane3:CK2α＇3.4GSTpull-down技術(shù)優(yōu)缺點優(yōu)點：融合蛋白親具有高通量性、高選擇性的特點，由于融合蛋白的多樣性以及表達系統(tǒng)的多樣性(如細菌、果蠅、哺乳動物)，該方法能夠研究蛋白質(zhì)在復雜體系中的相互作用。缺點：該方法的成功應用取決于是否能夠得到足夠多，并且保持蛋白質(zhì)活性的重組融合蛋白，以及如何避免內(nèi)源性誘餌蛋白的干擾。四、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）Fluorescenceresonanceenergytransfer4.1熒光信號的產(chǎn)生

熒光基團在某波長的激發(fā)光刺激下，產(chǎn)生一個更長波長的發(fā)射光。4.2什么是FRET?

熒光能量共振轉(zhuǎn)移是距離很近的兩個熒光分子間產(chǎn)生的一種能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。當供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊，并且兩個分子的距離在10nm范圍以內(nèi)時，就會發(fā)生一種非放射性的能量轉(zhuǎn)移，即FRET現(xiàn)象，使得供體的熒光強度比它單獨存在時要低的多（熒光猝滅），而受體發(fā)射的熒光卻大大增強（敏化熒光）實際相當于將短波長熒光基團釋放的熒光屏蔽。4.3綠色熒光蛋白

60年代，Shimomura等首先從水母（AequoriaVictoria

）中分離出一種水母發(fā)光蛋白(aequoren)，該蛋白與鈣和腸腔素結(jié)合后可產(chǎn)生藍色熒光。然而水母中提取的顆粒都呈綠色，后經(jīng)證實在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)光蛋白即綠色熒光蛋白GFP,

后經(jīng)研究表明，在水母體內(nèi)Ca2+和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結(jié)合后，水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生藍色熒光，GFP在藍光的激發(fā)下，產(chǎn)生綠色熒光。

人們在GFP基因的基礎(chǔ)上已經(jīng)制造出藍色熒光蛋白，黃色熒光蛋白，青色熒光蛋白，又發(fā)現(xiàn)了紅色熒光蛋白。其中蘭色熒光蛋白和綠色熒光蛋白，青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白之間可以發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移Tsien&Miyawaki采用FRET技術(shù)檢測細胞內(nèi)Ca2+的濃度變化。他們將CFP和YFP分別于鈣調(diào)蛋白和鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽融合表達于同一個細胞內(nèi)。當細胞內(nèi)具有高的Ca2+濃度時，鈣調(diào)蛋白和鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽結(jié)合，可誘發(fā)FRET，使受體蛋白YFP發(fā)出黃色熒光，因此細胞呈黃色。當細胞內(nèi)Ca2+濃度低時，F(xiàn)RET幾乎不發(fā)生，因此檢測時CFP被激發(fā)，發(fā)出綠色熒光，細胞呈綠色。4.4應用在生命科學領(lǐng)域，F(xiàn)RET技術(shù)是檢測活體中生物大分子納米級距離和納米級距離變化的有力工具，可用于檢測某一細胞中兩個蛋白質(zhì)分子是否存在直接的相互作用。正如前述，當供體發(fā)射的熒光與受體發(fā)色團分子的吸收光譜重疊，并且兩個探針的距離在10nm范圍以內(nèi)時，就會產(chǎn)生FRET現(xiàn)象。而在生物體內(nèi)，如果兩個蛋白質(zhì)分子的距離在10nm之內(nèi)，一般認為這兩個蛋白質(zhì)分子存在直接相互作用。五、雙分子熒光互補技術(shù)（BiFC）(BimolecularFluorescenceComplementation)基本原理：方法利用綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)及其突變體的特性作為報告基因，將熒光蛋白分割成兩個不具有熒光活性的分子片段，再分別與目標蛋白連接.如果兩個目標蛋白因為有相互作用而靠近，就使得熒光蛋白的兩個分子片段在空間上相互靠近，重新形成活性的熒光基團而發(fā)出熒光.在熒光顯微鏡下，就能直接觀察到兩目標蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活細胞生理狀態(tài)的條件下觀察到其相互作用發(fā)生的時間、位置、強弱等情況。將熒光蛋白分割成兩個不具有熒光活性的分子片段分別與目標蛋白連接.如果兩個目標蛋白因為有相互作用而靠近，就使得熒光蛋白的兩個分子片段在空間上相互靠近，重新形成活性的熒光基團而發(fā)出熒光IdentificationoftheSIRTUIN1(SIRT1)-bindingdomainofBMAL1.

BindingofSIRT1toBMAL1deletionmutantswasanalyzedbybimolecularfluorescencecomplementation(BiFC).COS7cellsweretransfectedwithplasmidsencodingSIRT1-N-terminalofVenus(VN)andBMAL1-C-terminalofVenus(VC)wildtype(WT)oritsvariousmutants(Δnuclearlocalizationsequence[NLS],BMAL1withoutafunctionalnuclearlocalizationsignal;Δbasic-helix-loop-helix[bHLH],encodingBMAL1Δ71to140;ΔPer-Arnt-Sim[PAS]-A,BMAL1Δ210to320;ΔPAS-B,BMAL1Δ350to480;Δtranscriptionalactivationdomain[TAD],BMAL1Δ553to625).Theimageswerecapturedbyfluorescenceimagingmicroscopyusingspecificfiltersetsforyellowfluorescentproteinandredfluorescentprotein.六、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)

蛋白質(zhì)芯片可以用來大規(guī)模篩選蛋白之間的相互作用。將熒光標記的探針蛋白與蛋白質(zhì)芯片孵育，洗脫非特異性結(jié)合的蛋白后，可以通過掃描芯片上的熒光點檢測到穩(wěn)定的相互作用蛋白點。GongW.etal.(2008)MolecularPlant1:27-41.其它蛋白互作技術(shù)串聯(lián)親和純化（TAP）表面等離子共振（SPR）噬菌體展示技術(shù)(phagedisplayapproach)融合蛋白親和色譜法(proteinfusionaffinitychromatography)原子作用力顯微技術(shù)(atomicforcemicroscopy,AFM)蛋白質(zhì)與DNA相互作用

（一）酵母單雜交系統(tǒng)（Yeastone-hybridsystem）該技術(shù)是上世紀90年代中發(fā)展起來的研究DNA-蛋白質(zhì)之間相互作用的新技術(shù)，在酵母細胞內(nèi)研究真核生物中DNA-蛋白質(zhì)之間的相互作用，并通過篩選DNA文庫直接獲得靶序列相互作用蛋白的編碼基因?；驹恚簩㈨樖阶饔迷c最基本啟動子（minimalpromoter，Pmin）相連并將報告基因連到Pmin下游，將待測轉(zhuǎn)錄因子cDNA與酵母轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（transcr