實(shí)驗(yàn)八產(chǎn)淀粉酶菌種的鑒定

實(shí)驗(yàn)八產(chǎn)淀粉酶菌種的鑒定實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解微生物分類與鑒定中的基本程序和常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)與方法；2.熟悉16SrRNA基因PCR擴(kuò)增進(jìn)行細(xì)菌鑒定的基本原理并初步掌握PCR的操作技術(shù)；3.初步學(xué)會(huì)網(wǎng)上的有關(guān)網(wǎng)站的微生物資源信息和數(shù)據(jù)庫(kù)的使用并利用其進(jìn)行細(xì)菌鑒定分析。實(shí)驗(yàn)原理細(xì)菌分類鑒定的方法：形態(tài)學(xué)特征的鑒定生理生化特征的鑒定分子特征的鑒定形態(tài)學(xué)的鑒定固體平板菌落，固體斜面，液體的培養(yǎng)特征；顯微鏡下的細(xì)胞形狀，革蘭氏染色反應(yīng)，抗酸性染色，是否具有芽孢（芽孢在細(xì)胞內(nèi)的位置）、莢膜和鞭毛（鞭毛著生的位置）等。分子鑒定16SrDNA是編碼原核生物核糖體RNA小亞基16SrRNA的基因，與細(xì)菌整個(gè)基因組的變化相比，它具有高度的保守性，其變化的概率與細(xì)菌的變異和進(jìn)化程度是一致的，所以有助于細(xì)菌的鑒定和分類。結(jié)合完善的數(shù)據(jù)庫(kù)，16SrDNA序列分析可以快速準(zhǔn)確的對(duì)細(xì)菌進(jìn)行種屬鑒定，確定細(xì)菌在進(jìn)化中的位置。16SrDNA序列包含10個(gè)可變區(qū)和與之相間的11個(gè)恒定區(qū)。根據(jù)恒定區(qū)的保守性可以設(shè)計(jì)出細(xì)菌的通用引物，并且擴(kuò)增出所有細(xì)菌的16SrDNA片段。可變區(qū)因細(xì)菌而異，能夠揭示生物物種特征核酸序列，是種屬鑒定的分子基礎(chǔ)。擴(kuò)增細(xì)菌的16SrDNA基因需要其染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR，可以提取細(xì)菌染色體DNA作為模板，也可以直接挑取平板上經(jīng)過(guò)活化的菌落做PCR以達(dá)到快速簡(jiǎn)便的目的。PCR的原理和步驟原理

PCR是一種由引物介導(dǎo)的選擇性體外擴(kuò)增DNA的方法。步驟1.變性（Denature）：目的雙鏈DNA片段在95℃下解鏈；2.退火（Anneal）：兩種引物在適當(dāng)溫度（59℃左右）下與模板上的互補(bǔ)序列通過(guò)氫鍵配對(duì)；3.延伸（Extension）：在TaqDNA聚合酶合成DNA的最適溫度下，以目的DNA為模板進(jìn)行合成。由這三個(gè)基本步驟組成一輪循環(huán)，理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴(kuò)增一倍，這些合成的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板，所以經(jīng)25-35輪循環(huán)就可使DNA擴(kuò)增達(dá)106倍。5’5’3’3’PCRCycle1Denaturation95℃

strandsseparate

PrimersTaqTaqTaqpolymeraseisthermostable3’5’5’3’Annealing59℃PrimersbindTaqTaqForwardprimerannealstolowerstrandReverseprimerannealstoupperstrandPCRCycle13’5’5’3’TaqsynthesisesDNAinthe5’to3’directionPCRCycle1TaqTaqExtension72℃TaqcopiesDNAstranddNTPs瓊脂糖凝膠電泳的原理原理：帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下，向著與其電性相反的電極泳動(dòng)的現(xiàn)象。

在本實(shí)驗(yàn)中，DNA分子帶負(fù)電荷，向正極泳動(dòng)。影響泳動(dòng)率的因素：電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)（即DNA分子本身的大小和構(gòu)型）。

在本實(shí)驗(yàn)中，分子量越小，泳動(dòng)越快。實(shí)驗(yàn)器材

1.產(chǎn)淀粉酶的待檢菌的平板菌落（提前24小時(shí)劃線接種）；2.革蘭氏染色全套試劑，載玻片，酒精燈，接種環(huán)，光學(xué)顯微鏡；3.PCR反應(yīng)試劑：Taq酶，反應(yīng)緩沖液，dNTP，16SrRNA基因上下游引物，模板（菌落）；4.瓊脂糖，溴化乙錠，凝膠電泳儀，水平電泳槽，紫外檢測(cè)燈，TAE電泳緩沖液；5.微量移液槍，槍頭，PCR管，PCR儀。實(shí)驗(yàn)步驟（一）提前24h進(jìn)行菌種活化1.提前一天挑取單菌落，劃線淀粉培養(yǎng)基平板一塊（二）產(chǎn)淀粉酶待檢菌的培養(yǎng)特征與形態(tài)特征觀察與鑒定

1.培養(yǎng)特征的觀察：菌落形狀與大小，邊緣，表面，隆起形狀，透明度，菌落與培養(yǎng)基顏色等；

2.細(xì)菌的革蘭氏染色：按照實(shí)驗(yàn)二的操作方法進(jìn)行（設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)的革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌為對(duì)照）。

3.細(xì)菌細(xì)胞的顯微觀察：細(xì)胞形狀是桿狀（長(zhǎng)桿或短桿）還是球狀？有無(wú)芽孢？（三）菌種保藏從淀粉劃線平板上挑取PCR的單菌落，轉(zhuǎn)接固體斜面試管一支，至30℃培養(yǎng)24h.用滅菌白槍頭在一平板單菌落邊緣挑取少許菌體，刮蹭于PCR管壁底部。反應(yīng)體系：在一個(gè)PCR管中用微量移液槍加入下列物質(zhì)的混合液25μl，置于冰上備用。

Taqbuffer（10×）

MgCl2（25mM）dNTP（2.5mM）

PrimerForward（50mM）

PrimerReverse（50mM）

rTaq（2U/μl）

ddH2O

震蕩，將菌體和反應(yīng)體系充分混勻

PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min后，95℃變性1min，59℃退火1min，72℃延伸2min，共25個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min,4℃保存。

混合液25μl（四）細(xì)菌的16SrRNA分子鑒定（五）瓊脂糖凝膠電泳（下次實(shí)驗(yàn)做）

1.制膠：配制1%瓊脂糖溶液20mL，用1×TAE電泳緩沖液做溶劑，加熱溶解，稍冷后，加入模具中，插入梳子，待膠凝固；

2.制樣：PCR反應(yīng)結(jié)束后，取出PCR管，用微量移液槍吸取5ul與1ul6×樣品Buffer混合后全部點(diǎn)入浸于TAE電泳緩沖液中的瓊脂糖凝膠的樣品孔中;

3.電泳：100V電泳20分鐘；

4.染色：將凝膠置于樣品染料溴化乙錠中染色；10min，然后將凝膠置于紫外燈下進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)在凝膠上出現(xiàn)預(yù)期大小的DNA條帶（約1.5Kb），則認(rèn)為是PCR陽(yáng)性，這時(shí)將與此電泳樣品對(duì)應(yīng)的PCR反應(yīng)管放置冰箱短期保存。（六）PCR擴(kuò)增片段測(cè)序獲得的PCR陽(yáng)性樣品由專人送往測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，大約一周后測(cè)序結(jié)果可以返回，然后在電腦的相關(guān)軟件上進(jìn)行讀序。（七）序列比對(duì)分析使用NCBI網(wǎng)站對(duì)待測(cè)菌的16SrDNA序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中各種菌的16SrDNA序列進(jìn)行比對(duì)。登陸

美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站，使用BLASTn在GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB基因庫(kù)中進(jìn)行同源性搜索。從Genebank中選擇近與待測(cè)菌目的基因序列同源性最高的已知分類的菌株的16SrR