臨床血液學(xué)檢驗(yàn)-1-7-造血檢驗(yàn)基本方法2細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)

第一章造血與血細(xì)胞檢驗(yàn)

第七節(jié)骨髓檢查

二、細(xì)胞化學(xué)染色1普通染色免疫細(xì)胞化學(xué)染色細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)細(xì)胞化學(xué)染色2【細(xì)胞化學(xué)染色概述】細(xì)胞化學(xué)染色的概念細(xì)胞形態(tài)學(xué)化學(xué)（化學(xué)反應(yīng)）酶類、脂類、糖類、鐵、蛋白、核酸等細(xì)胞化學(xué)染色3細(xì)胞化學(xué)染色的臨床應(yīng)用細(xì)胞化學(xué)染色的基本步驟幫助識(shí)別細(xì)胞了解細(xì)胞的生理狀態(tài)及功能輔助診斷及鑒別診斷血液系統(tǒng)疾病取材：新鮮骨髓片或血片制片染色：固定、有色沉淀反應(yīng)（顯色）、復(fù)染顯微鏡檢查：觀察染色是否成功，觀察目標(biāo)細(xì)胞的染色結(jié)果填寫報(bào)告單：定性（陽(yáng)性/陰性）、半定量（陽(yáng)性率/陽(yáng)性積分/陽(yáng)性程度）登記及存檔4固定物理法

化學(xué)法

干燥固定

火焰固定

蒸汽固定

液體固定

5偶氮偶聯(lián)法

雪夫反應(yīng)

聯(lián)苯胺法

普魯士藍(lán)反應(yīng)

金屬沉淀法

顯色

6

復(fù)染的目的在于使各種細(xì)胞能顯示出來以便于觀察。選擇復(fù)染液的顏色應(yīng)與有色沉淀的顏色有明顯的對(duì)比度，即能使細(xì)胞結(jié)構(gòu)顯示又能清楚地看出細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果復(fù)染

7（一）用于貧血的細(xì)胞化學(xué)染色（鐵染色）『用于貧血的常規(guī)細(xì)胞化學(xué)染色』外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（Ret/Retic/RC）

骨髓鐵染色8【復(fù)習(xí)：外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（Ret/Retic/RC）】『?jiǎn)栴}』在瑞氏染色下，能否較準(zhǔn)確地區(qū)別成熟紅細(xì)胞與未完全成熟的紅細(xì)胞（網(wǎng)織紅細(xì)胞）網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)有哪兩種方法？在手工操作法中，我們?nèi)旧坝^察的是哪種化學(xué)物質(zhì)網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的參考值是多少？有什么臨床意義手工活體染色法和儀器法RNA0.5％～1.5％反映骨髓中紅系的造血情況，用于貧血的診斷、鑒別診斷及療效觀察不能，未完全成熟的紅細(xì)胞在瑞氏染色下表現(xiàn)為嗜多色紅細(xì)胞94Fe3+＋3K4［Fe(CN)6］Fe4［Fe(CN)6］3＋12K+亞鐵氰化鉀亞鐵氰化鐵（普魯士藍(lán)色）酸性【骨髓鐵染色】染色原理及方法貯存鐵鐵蛋白含鐵血黃素10作用液30min流水沖洗5min，待干1％藏紅花染1min，水洗待干骨髓片標(biāo)本片12作用液需要新鮮配制：濃鹽酸0.25ml＋1.25ml20%亞鐵氰化鉀溶液（兩者比例為1∶5）23411正常血細(xì)胞的染色結(jié)果細(xì)胞外鐵：位于骨髓小粒內(nèi)或巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)（即幼紅細(xì)胞外）細(xì)胞內(nèi)鐵：位于幼紅細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的鐵鐵粒幼紅細(xì)胞：胞質(zhì)中出現(xiàn)藍(lán)色鐵顆粒的幼紅細(xì)胞。計(jì)數(shù)100個(gè)中幼紅和晚幼紅細(xì)胞中鐵粒幼紅細(xì)胞的百分比即為細(xì)胞內(nèi)鐵陽(yáng)性率鐵粒紅細(xì)胞：胞質(zhì)中出現(xiàn)藍(lán)色鐵顆粒的紅細(xì)胞環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞：幼紅細(xì)胞胞質(zhì)中藍(lán)色顆粒6顆以上，圍繞核周1/2以上者病理情況1213細(xì)胞外鐵（＋＋＋＋）細(xì)胞外鐵（＋＋＋）細(xì)胞外鐵（＋＋）細(xì)胞外鐵（＋＋＋）細(xì)胞外鐵（＋＋＋）細(xì)胞外鐵（＋）細(xì)胞外鐵（－）14鐵粒幼細(xì)胞鐵粒幼細(xì)胞幼紅細(xì)胞環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞、鐵粒紅細(xì)胞15參考值骨髓細(xì)胞外鐵：（+）~（++），約2/3人為（++），1/3人為（+）骨髓細(xì)胞內(nèi)鐵：鐵粒幼紅細(xì)胞的陽(yáng)性率為19%~44%，以I型為主，少數(shù)為II型16臨床應(yīng)用：用于貧血的診斷及鑒別診斷貧血細(xì)胞外鐵細(xì)胞內(nèi)鐵缺鐵性貧血陰性明顯減低或?yàn)?鐵粒幼細(xì)胞性貧血明顯增多增高環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞（≥15％）骨髓增生異常綜合征（MDS）RA-RS常增高增高環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞≥15％RCMD-RS非缺鐵性貧血溶貧、巨幼貧、再障等正?；蛟龈哒；蛟龈吒腥?、肝硬化、慢性腎炎、尿毒癥等增高減低17細(xì)胞內(nèi)鐵細(xì)胞外鐵細(xì)胞外鐵細(xì)胞內(nèi)鐵細(xì)胞內(nèi)鐵細(xì)胞外鐵細(xì)胞內(nèi)鐵細(xì)胞外鐵細(xì)胞內(nèi)鐵隱性缺鐵缺鐵性貧血早期缺鐵缺鐵性貧血鐵轉(zhuǎn)運(yùn)或利用異常繼發(fā)性貧血鐵負(fù)荷鐵粒幼細(xì)胞貧血巨幼細(xì)胞貧血再障MDS紅白血病圖貧血時(shí)鐵染色常見的四種情形1819（二）中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色（NAP染色）

染色原理及方法：Kaplow偶氮偶聯(lián)法α-磷酸萘酚鈉＋H2Oα-萘酚＋磷酸鈉＋堅(jiān)牢藍(lán)RR不溶性棕黑色沉淀pH9.6堿性磷酸酶成熟中性粒細(xì)胞胞質(zhì)中20固定液30s，水洗待干作用液5～15min，水洗，待干1％藏紅花3min，水洗，待干新鮮血片標(biāo)本片12作用液需要新鮮配制：α-磷酸萘酚鈉溶液1.5ml，在37℃預(yù)熱5min＋堅(jiān)牢藍(lán)RR1.5mg33421正常血細(xì)胞的染色結(jié)果陽(yáng)性反應(yīng)呈棕黑色顆粒，定位于成熟中性粒細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。其他細(xì)胞呈陰性油鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)成熟中性粒細(xì)胞，記錄其陽(yáng)性程度（－）、（＋）、（2＋）、（3＋）、（4＋），分別記為0、1、2、3、4分。計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)為陽(yáng)性率，陽(yáng)性細(xì)胞的分?jǐn)?shù)總和為陽(yáng)性積分2223NAP（＋＋＋）NAP（＋＋＋＋）NAP（＋＋）NAP（＋＋）NAP（＋）NAP（＋）NAP（－）嗜酸性粒細(xì)胞（－）24參考值：陽(yáng)性率＜40％，陽(yáng)性積分14～113。各實(shí)驗(yàn)室之間可有較大差異，應(yīng)建立各實(shí)驗(yàn)室的參考值臨床應(yīng)用NAP染色主要用于骨髓增生性腫瘤（MPN）的診斷與鑒別診斷。NAP是懷疑骨髓增生性腫瘤時(shí)應(yīng)作的常規(guī)細(xì)胞化學(xué)染色慢粒NAP顯著減低，甚至為0，其他MPN為正?；蛟龈呗AP顯著減低，甚至為0，類白NAP顯著增高鑒別其他疾病25圖NAP染色（慢粒血片）26圖NAP染色（類白血片）27（三）急性白血病形態(tài)學(xué)分型的細(xì)胞化學(xué)染色『急性白血病細(xì)胞分型的常規(guī)細(xì)胞化學(xué)染色』過氧化物酶（POX）染色/蘇丹黑B（SBB）染色特異性酯酶（NAS-DCE）染色非特異性酯酶（α-NAE/α-NBE/NAS-DAE/ANAE等）染色過碘酸-雪夫（PAS）染色酸性磷酸酶（ACP）染色28『?jiǎn)栴}』在各系各階段血細(xì)胞中，最難鑒別的細(xì)胞是什么細(xì)胞正常和一般疾病病人的骨髓片中可以看到原始細(xì)胞嗎在什么情況下，骨髓片中能看見大量的原始細(xì)胞如何鑒別原粒、原淋及原單？原始細(xì)胞原粒細(xì)胞＜2％，原紅＜1％，其他原始細(xì)胞罕見急性白血病骨髓中原始細(xì)胞≥20％MDS（RAEB）骨髓中原始細(xì)胞5～20％細(xì)胞化學(xué)染色（一組）29過氧化物酶（POX）染色（1）染色方法及原理復(fù)方聯(lián)苯胺法二氨基聯(lián)苯胺法四甲基聯(lián)苯胺法改良Pereira法（碘化鉀法）30過氧化氫四甲基聯(lián)苯胺亞硝基鐵氰化鈉藍(lán)色顆粒棕色顆粒圖POX染色原理（四甲基聯(lián)苯胺法）水聯(lián)苯胺藍(lán)過氧化物酶試劑試劑31（2）正常血細(xì)胞的染色反應(yīng)染色成功的標(biāo)志：成熟中性粒細(xì)胞為陽(yáng)性反應(yīng)各系細(xì)胞染色反應(yīng)粒系：除早期原粒外，其余為陽(yáng)性單核系：除早期原單外，其余為弱陽(yáng)性淋巴系：陰性漿細(xì)胞系、紅系、巨核系：均呈陰性32333435【蘇丹黑B染色（SBB染色）】（1）染色方法及原理（2）正常血細(xì)胞的染色反應(yīng)（3）臨床應(yīng)用同POX染色。POX更特異，SBB更敏感36特異性酯酶染色（氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色，CE染色）（1）原理及方法圖氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色法原理氯乙酸AS-D萘酚重氮鹽（堅(jiān)牢紫醬GBC）紅色沉淀特異性酯酶（氯乙酸AS-D萘酚酯酶）AS-D萘酚試劑試劑37（2）正常血細(xì)胞的染色反應(yīng)染色成功的標(biāo)志：成熟中性粒細(xì)胞為陽(yáng)性反應(yīng)各系細(xì)胞的染色反應(yīng)粒系：早期原粒為陰性，其余為陽(yáng)性單核系：陰性淋巴系：陰性漿細(xì)胞系、紅系、巨核系：均為陰性3839非特異性酯酶染色（1）染色方法及原理：需同時(shí)進(jìn)行NaF抑制試驗(yàn)最特異根據(jù)酯酶特異性高低特異性酯酶(氯乙酸AS-D萘酚酯酶)非特異性酯酶

pH值不同

酸性酯酶(酸性α-醋酸萘酚酯酶)堿性酯酶(α-丁酸萘酚酯酶)中性酯酶

α-醋酸萘酚酯酶醋酸AS-D萘酚酯酶

40（2）各系血細(xì)胞的染色反應(yīng)粒系：多為陰性，少數(shù)可呈陽(yáng)性，陽(yáng)性反應(yīng)不能被NaF抑制（α-NBE染色特異性較高，粒系為陰性）單核系：早期原單為陰性，其余為陽(yáng)性，陽(yáng)性反應(yīng)可被NaF抑制淋巴系：多為陰性，少數(shù)可呈弱陽(yáng)性，陽(yáng)性反應(yīng)不能被NaF抑制其他細(xì)胞

414243【酯酶雙染色】染色原理及方法：在同一張涂片上進(jìn)行特異性酯酶染色和非特異酯酶染色

CE染色與α-NAE染色CE染色與α-NBE染色各系血細(xì)胞的染色反應(yīng)臨床應(yīng)用：對(duì)AML-M4的診斷具有意義44過碘酸-雪夫反應(yīng)（PAS染色，又稱糖原染色）（1）染色方法及原理細(xì)胞內(nèi)含有乙二醇基的糖類在過碘酸氧化作用下產(chǎn)生雙醛基，后者與雪夫（Schiff）染料作用，使無(wú)色品紅變?yōu)樽霞t色物質(zhì)沉積，定位于含有多糖成分的部位45（2）正常血細(xì)胞的染色反應(yīng)染色成功的標(biāo)志：成熟中性粒細(xì)胞為陽(yáng)性反應(yīng)各系血細(xì)胞的染色反應(yīng)粒系：早期原粒陰性，其余為陽(yáng)性，呈彌散狀陽(yáng)性單核系：早期原單陰性，其余為陽(yáng)性，呈細(xì)顆粒狀陽(yáng)性淋巴系：多數(shù)為陰性，少數(shù)為陽(yáng)性，呈粗顆粒狀陽(yáng)性或塊狀陽(yáng)性紅系：陰性巨核系：陽(yáng)性其他細(xì)胞4647酸性磷酸酶（ACP）染色（1）染色方法及原理，同時(shí)做抗酒石酸酸性磷酸酶染色正常血細(xì)胞的染色結(jié)果：粒系、單核系、淋巴系、漿細(xì)胞系、巨核系、紅系等均呈陽(yáng)性，抗酒石酸酸性磷酸酶染色均呈陰性臨床應(yīng)用：主要用于毛細(xì)胞白血病（HCL）的診斷及鑒別診斷，毛細(xì)胞為陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性，不被酒石酸抑制48本組細(xì)胞化學(xué)染色的臨床應(yīng)用鑒別原粒、原單及原淋細(xì)胞鑒別急性白血病的類型急性白血病分類細(xì)胞化學(xué)染色鑒別急性白血病類型示例49細(xì)胞類型原粒原單原淋POX陰性或陽(yáng)性（常為陽(yáng)性）陰性或弱陽(yáng)性（常為弱陽(yáng)性）陰性NAS-DCE陰性或陽(yáng)性（常為陽(yáng)性）陰性陰性α-NAEα-NBENAS-DAEANAE陰性或陽(yáng)性（NaF不抑制）陽(yáng)性（NaF完全抑制）陰性或陽(yáng)性（NaF不抑制）PAS陰性或陽(yáng)性（彌散狀陽(yáng)性）陰性或陽(yáng)性（細(xì)顆粒陽(yáng)性）陰性或陽(yáng)性（粗顆粒陽(yáng)性）ACP陽(yáng)性（酒石酸抑制）陽(yáng)性（酒石酸抑制）陽(yáng)性（酒石酸抑制）50白血病慢性白血病急性白血病慢性淋巴細(xì)胞白血病慢性粒細(xì)胞白血病急性淋巴細(xì)胞白血病急性髓細(xì)胞白血病M0（微分化）M7（巨核細(xì)胞）M3（早幼粒細(xì)胞）M2（粒細(xì)胞部分成熟型）M6（紅、白細(xì)胞）M5（單核細(xì)胞）M4（粒、單核細(xì)胞）M1（粒細(xì)胞未成熟型）原淋原粒原粒+原單原單骨髓中白血病性原始細(xì)胞20%早幼粒細(xì)胞化學(xué)染色51ALL原淋M1原粒M4原粒+原單M5原單細(xì)胞化學(xué)染色52【細(xì)胞化學(xué)染色鑒別急性白血病的類型】POX染色：最重要、首選的常規(guī)細(xì)胞化學(xué)染色，是鑒別急性淋巴細(xì)胞白血病和急粒髓細(xì)胞白血病的重要指標(biāo)原始細(xì)胞陽(yáng)性率≥3%為AML的M1～M5原始細(xì)胞陽(yáng)性率＜3%為ALL等

CE染色：能較特異地識(shí)別粒系細(xì)胞，用于輔助鑒別急性白血病的類型（M1、M2、M3、M4）非特異性酯酶染色及NaF抑制試驗(yàn)：能較特異地識(shí)別單核系細(xì)胞，用于輔助鑒別急性白血病的類型（M4、M5）PAS染色：可以鑒別淋巴細(xì)胞與粒、單核細(xì)胞，用于輔助鑒別急性白血病的細(xì)胞類型。本法還用于鑒別幼紅細(xì)胞增生的性質(zhì)5354原始細(xì)胞：原淋55原始細(xì)胞：原單+原粒56『作業(yè)』鑒別鐵染色結(jié)果的相關(guān)概念貯存鐵鐵蛋白含鐵血黃素細(xì)胞外鐵細(xì)胞內(nèi)鐵鐵粒幼細(xì)胞環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞鐵粒紅細(xì)胞57『作業(yè)』骨髓鐵染色的參考值？貧血時(shí)鐵染色常見以下四種結(jié)果，分別說明機(jī)體內(nèi)鐵處于哪種狀態(tài)外鐵減少，內(nèi)鐵正常外鐵減少或消失，內(nèi)鐵減少外鐵增高，內(nèi)鐵減少外鐵增高，內(nèi)鐵增高58『作業(yè)』POX染色、CE染色、非特異性酯酶染色及NaF抑制試驗(yàn)、PAS染色這四種染色，粒系、單核系、淋巴系各階段細(xì)胞的結(jié)果是怎