第十二章 胚胎工程

第12章胚胎工程提要胚胎工程的理論基礎：胚胎發(fā)育胚胎工程的主要操作對象：生殖細胞、受精卵、早期胚胎細胞。胚胎工程的研究內(nèi)容：體外受精、胚胎移植、胚胎分割、胚胎體外培養(yǎng)、胚胎冷凍保存、動物性別控制。一、胚胎發(fā)育（一）、發(fā)育

個體發(fā)育（ontogeny）：自受精卵開始到形成成熟個體所經(jīng)歷的一段過程。發(fā)育

系統(tǒng)發(fā)育（phylogeny）：同一起源的生物群的形成歷史。（二）、胚胎發(fā)育的基本過程受精卵裂囊胚的形成原腸腔的形成中胚層及體腔形成胚層分化1、受精1.1精子和卵子的產(chǎn)生第一次減數(shù)分裂前期青春期后第二次減數(shù)分裂中期卵子的成熟原始卵泡次級卵泡初級卵泡成熟卵泡次級卵泡1.2精子和卵子的結(jié)構(gòu)精子的結(jié)構(gòu)卵子的結(jié)構(gòu)圖1.3受精即：精子與卵子融合成受精卵的過程。主要包括以下幾個過程：精子的獲能（capacitation）、頂體反應（acrosomereaction）、皮層反應（corticalreaction）、原核形成和融合受精的早期事件引自JaniceP.Evans2002

精子的獲能剛排出的精子雖有運動能力，但不能穿過卵子的放射冠和透明帶，只有接受雌性生殖道的分泌物（獲能因子），才具有受精能力，這種作用稱為精子獲能。在體外條件下，血清白蛋白（serumalbumin）、高密脂蛋白（high-densitylipoproteins）、氨基聚糖（glycosaminoglycans）、孕酮、鈣離子載體（A23187）、ZP3、CO2等均可促進精子獲能。頂體酶原轉(zhuǎn)化為有活性的頂體酶。頂體反應獲能的精子首先借助頭后部（頂體后區(qū)）透明質(zhì)酸酶活性穿過卵母細胞外卵丘細胞層（放射冠），到達透明帶，然后精子通過頭前部（頂體區(qū)）質(zhì)膜表面的ZP結(jié)合蛋白與卵母細胞透明帶發(fā)生識別，完成結(jié)合過程，誘發(fā)頂體反應，即：頂體以外排的方式釋放出水解酶，將卵子的透明帶和卵黃膜溶解，形成精子穿過的通道

皮層反應精子進入卵子后，在精子接觸點上，磷脂酰肌醇信號途徑啟動，產(chǎn)生DAG和IP3。IP3導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣離子釋放鈣信號進而引起皮層反應，即：卵細胞膜下的皮層顆粒（內(nèi)含酶類的囊泡），以外排的方式，進入卵黃膜和卵膜之間的腔隙，酶類引起透明帶“硬化”，形成受精膜。多精受精阻斷受精后通過兩種機制阻止多精進入，一是膜瞬間去極化；二是通過皮層反應，破壞精子受體和形成受精膜。

多精進入會形成多余的分裂極和紡錘體，導致細胞異常分裂而使胚胎發(fā)育終止。原核形成精子的刺激使處于休眠狀態(tài)的卵子被激活，重新回到減數(shù)分裂階段，迅速完成第二次分裂，釋放極體。此時精子和卵子的細胞核分別稱為雄原核（malepronucleus）和雌原核（female

pronucleus）。融合兩個原核逐漸在細胞中部靠攏，核膜隨即消失，染色體混合，形成二倍體的受精卵（fertilizedovum）又稱合子（zygote）。2、卵裂卵裂（cleavage）是指受精卵經(jīng)過分裂，將卵質(zhì)分配到子細胞的過程，分裂產(chǎn)生的細胞叫做分裂球(blastomere)。哺乳動物的卵裂較慢，受精1天后才開始卵裂，8細胞之前，分裂球之間結(jié)合比較松散，8細胞之后突然緊密化（compaction），在64細胞以前為實心體，稱為桑椹胚。3、囊胚的形成在128細胞階段，細胞團內(nèi)部空隙擴大，成為充滿液體的囊胚腔（blastocoel），此時的胚胎稱為囊胚，或是胚泡。3、原腸胚蛙；外包法+內(nèi)移法；海膽文昌魚5、胚層分化

外胚層形成神經(jīng)系統(tǒng)、表皮、皮膚腺、毛發(fā)、指甲、爪和牙齒等；

中胚層形成骨骼、肌肉、泌尿生殖系統(tǒng)、淋巴組織、結(jié)締組織、血液；

內(nèi)胚層形成呼吸系統(tǒng)、消化道、肝、胰。二、體外受精（一）、體外受精概述

體外受精(InVitroFertilization)是指哺乳動物的精子和卵子在體外人工控制的環(huán)境中完成受精過程的技術(shù)，英文簡稱為IVF。由于它與胚胎移植技術(shù)(ET)密不可分，又簡稱為IVF-ET。在生物學中，把體外受精胚胎移植到母體后獲得的動物稱試管動物(test-tubeanimal)。（二）、體外受精技術(shù)的發(fā)展簡史1878年，德國人Scnenk就以家兔和豚鼠為材料，開始探索哺乳動物的體外受精技術(shù)。1951年，美籍華人張明覺和澳大利亞人Austin同時發(fā)現(xiàn)了哺乳動物的精子獲能現(xiàn)象，這一領域的研究才獲得突破性進展。

1959年，張明覺以家兔為實驗材料，從一只交配后12h的母兔子宮中沖取精子(即體內(nèi)獲能的精子)，從另外兩只超數(shù)排卵處理母兔的輸卵管中收集卵子，精子和卵子在體外人工配制的溶液中完成受精過程，然后，正常卵裂的36枚胚胎被移植到6只受體的輸卵管中，其中4只妊娠，并產(chǎn)下15只健康仔兔，這是世界上首批試管動物，它們的正常發(fā)育標志著體外受精技術(shù)的建立。試管小鼠(Whit-tingham，1968)大鼠(Toyoda和Chang，1974)、嬰兒(Steptoe和Edwards，1978)、牛(Brackett等，1982)、山羊(Hamda，1985)、綿羊(Hanada，1985)豬(Chang等，1986)等相繼出生。目前，采用IVF-ET技術(shù)，充分利用良種母牛的遺傳資源，不僅應用于畜牧生產(chǎn)，也成為研究其他胚胎生物技術(shù)，如克隆、轉(zhuǎn)基因、胚胎干細胞分離培養(yǎng)和性別控制等的重要輔助手段。

試管嬰兒人類第一例試管嬰兒子1978年7月23日誕生在英國，嬰兒名叫路易斯布朗。她的母親由于輸卵管堵塞不能生育。中國第一個試管嬰兒于1985年4月在臺灣誕生；我國大陸的第一位的試管嬰兒于1988年3月在北京醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院誕生。愛德華茲——試管嬰兒之父、劍橋大學名譽教授、英國皇家學會會員、2001年拉斯克臨床醫(yī)學獎得主。他將獨享1000萬瑞典克朗(約146萬美元)的獎金——主要是因為另一名重要的合作者，婦科醫(yī)生帕特里克·斯特普托(PatrickSteptoe)早在1988年便撒手人寰。

1、試管嬰兒技術(shù)包括哪些技術(shù)？體外受精、胚胎體外培養(yǎng)和胚胎移植技術(shù)。2.試管嬰兒和母親正常懷孕，生產(chǎn)的過程有何異同？相同之處：都通過有性生殖產(chǎn)生，在母體子宮內(nèi)發(fā)育形成胎兒。不同之處：受精作用在體外，并在體外發(fā)育成早期胚胎進行胚胎移植。（三）、體外受精技術(shù)的研究意義體外受精技術(shù)對動物生殖機理研究、畜牧生產(chǎn)、醫(yī)學和瀕危動物保護等具有重要意義。在家畜品種改良中，體外受精技術(shù)為胚胎生產(chǎn)提供了廉價而高效的手段，對充分利用優(yōu)良品種資源，縮短家畜繁殖周期，加快品種改良速度等有重要價值。在人類，IVF-ET技術(shù)是治療某些不孕癥的重要措施之一。國產(chǎn)奶牛：年均產(chǎn)奶量3000公斤左右國際良種奶牛：年均產(chǎn)奶量10000公斤左右引進一頭良種成年奶牛需要3萬－5萬元；牛的生育率低，一頭牛1胎只生1只，一生只能生育4~5次。牛的生育率雖然很低，但是牛的卵母細胞卻相當?shù)亩?，其卵巢中卵母細胞?shù)目要比一生中排卵數(shù)多1000倍左右；公牛產(chǎn)生的精子數(shù)目就更多了。胚胎移植采集良種母牛的卵母細胞卵母細胞的體外培養(yǎng)采集良種公牛精子精子體外獲能體外受精良種牛體外受精胚胎受體牛良種犢牛成熟期牛屠宰加工廠市場采集卵巢中的卵母細胞“試管牛”工廠化生產(chǎn)的技術(shù)流程圖（四）、體外受精技術(shù)的基本操作程序1、卵母細胞的采集和成熟培養(yǎng)1.1卵母細胞的采集：采集方法通常有三種。

(1)超數(shù)排卵：雌性動物用促卵泡素和促黃體素處理，促使卵巢排出更多的卵子，從輸卵管中沖取成熟卵子可直接與獲能精子受精。實驗動物如小鼠、兔，以及家畜豬、羊等大家畜中，由于操作程序復雜，成本較高，很少使用。(2)從活體卵巢中采集卵母細胞借助超聲波探測儀、內(nèi)窺鏡或腹腔鏡直接從活體動物的卵巢中吸取卵母細胞。按照目前的技術(shù)水平，一頭健康母牛每周可獲得5~10枚卵子。

(3)從屠宰后母畜卵巢上采集卵母細胞從剛屠宰母畜體內(nèi)摘出卵巢，經(jīng)洗滌、保溫（30℃~37℃)后，快速運到實驗室，在無菌條件下用注射器或真空泵抽吸卵巢表面一定直徑卵泡中的卵母細胞（牛卵泡直徑要求3-10mm）也可對卵巢進行切片，收集卵母細胞。1.2母細胞的選擇：采集的COC要求卵母細胞形態(tài)規(guī)則，細胞質(zhì)均勻，外圍有多層卵丘細胞緊密包圍。在家畜體外受精研究中，常把未成熟卵母細胞分為A、B、C和D四個等級。在體外受精實踐中，一般只培養(yǎng)A級和B級卵母細胞。

1.3卵母細胞的成熟培養(yǎng)：家畜卵母細胞的成熟培養(yǎng)液目前普遍采用TCM199添加孕牛血清、促性腺激素、雌激素和抗生素成份。2、體外受精2.1精子的獲能處理體內(nèi)獲能：直接從交配母畜的子宮內(nèi)取精子體外受精：先洗滌篩選，然后用肝素和鈣離子載體等藥物誘發(fā)精子獲能。2.2受精：（1）獲能精子與成熟卵子的共培養(yǎng)，（2）顯微注射受精

顯微注射受精(microinsemination)又稱輔助受精技術(shù)(Techniquesf.rassistedfertilizati.n)，克服在某些情況下精子不能穿過透明帶和卵黃膜的缺陷。透明帶下注射法方法卵細胞質(zhì)內(nèi)精子注射法應用價值在醫(yī)學上已成為治療某些男性不育癥的主要措施之一；在基礎生物學中，它對研究哺乳動物受精和發(fā)育機理有很重要的價值；對挽救瀕危動物和充分利用優(yōu)良種公畜等有重要意義3、早期胚胎體外培養(yǎng)受精卵需移入發(fā)育培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)以檢查受精狀況和受精卵的發(fā)育潛力（一般要發(fā)育到桑椹胚或囊胚階段），質(zhì)量較好的胚胎可移入受體母畜的生殖道內(nèi)繼續(xù)發(fā)育成熟或進行冷凍保存。

發(fā)育阻滯（developmentalblock）體外受精的早期胚胎在體外發(fā)育過程中，常會停在某一階段不再發(fā)育，此現(xiàn)象稱發(fā)育阻滯。產(chǎn)生因素：受精卵早期發(fā)育受母源性基因的調(diào)控，到2細胞之后，自身基因啟動時，母源性的mRNA失活，此期胚胎對環(huán)境超敏感；胚胎基因激活的細胞內(nèi)[H2O2]的升高，體外培養(yǎng)條件不能及時清除，使得胚胎發(fā)育阻滯?？朔铚F(xiàn)象的方法：改進培養(yǎng)液成分，改善培養(yǎng)條件，減少對胚胎發(fā)育不利的成分體細胞共培養(yǎng)(輸卵管上皮細胞共培養(yǎng)），以提供發(fā)育所需的物質(zhì)條件(（五）、體外受精技術(shù)存在的問題和發(fā)展方向

1、存在的問題

(1)囊胚發(fā)育率低，細胞數(shù)少。體外受精卵在培養(yǎng)過程中普遍存在發(fā)育阻斷(developmentalblock)(2)產(chǎn)犢率低2、發(fā)展方向(1)深入研究卵母細胞成熟和胚胎發(fā)育的分子機理(2)提高取卵率、加強腔前卵泡培養(yǎng)的研究。(3)加強體外受精與其他生物技術(shù)的結(jié)合。

三、胚胎移植胚胎移植又稱受精卵移植，就是將1頭母畜(供體)的受精卵移植到另一頭母畜(受體)的子宮內(nèi)，使之正常發(fā)育成為新個體的技術(shù)，俗稱“借腹懷胎”。胚胎移植實際上就是產(chǎn)生胚胎的供體和養(yǎng)育胚胎的受體分工合作共同繁殖后代。（一）、胚胎移植的研究歷史1、1890年，劍橋大學的Heape以兔為材料，首次獲得胚胎移植的成功，奠定了胚胎移植的生理學基礎和原則。2、20世紀30～70年代成為生物科學的主要研究方向之一，在多種家畜上移植成功。3、1971年世界上出現(xiàn)了第一個胚胎移植公司4、1974年國際胚胎移植協(xié)會(IETS)成立

5、目前，胚胎移植已成為畜牧業(yè)中最活躍的產(chǎn)業(yè)。在商業(yè)化應用上，牛的胚胎移植開始最早，商業(yè)化生產(chǎn)應用較為成熟，占的比例也最大羊的胚胎移植應用最先開始于澳大利亞，20世紀70年代，澳大利亞每年要進口300萬美元的馬海毛（安哥拉山羊毛），從而使安哥拉山羊處于一種不切實際的高價地位，為胚胎移植提供了市場條件，促進了澳大利亞安哥拉山羊胚胎移植的發(fā)展和應用。我國牛、羊胚胎移植的發(fā)展過程分為三個階段：試驗研究階段（20世紀70年代初至80年代中）發(fā)展提高階段（20世紀80年代中至90年代中）推廣應用階段（20世紀90年代中至現(xiàn)在）奶牛、肉牛、安哥拉山羊、波爾山羊和良種綿羊的胚胎移植開始在畜牧生產(chǎn)中應用2000年全國奶牛胚胎移植數(shù)量達到5000頭2002起，農(nóng)業(yè)部在北京、新疆、黑龍江、內(nèi)蒙古、寧夏、陜西、山西、河北和山東等9?。▍^(qū)）實施“萬枚高產(chǎn)奶牛胚胎移植富民工程”，極大地促進了奶牛胚胎移植的產(chǎn)業(yè)化進程，使我國奶牛胚胎移植數(shù)量突破10000頭2003年我國共生產(chǎn)奶、肉牛胚胎30000枚以上(二)胚胎移植的意義1、充分發(fā)揮優(yōu)良母畜的繁殖潛力，大大加速了良種母畜的建立和擴大。2、誘發(fā)肉畜產(chǎn)雙胎，提高生產(chǎn)效率。對發(fā)情的母畜配種后再移植一個胚胎到排卵對側(cè)子宮角內(nèi)。據(jù)報道，這樣處理后的受胎率可高達70%以上，雙胎率可達40-60%。另有報道，當向每一側(cè)子宮角移植一個胚胎時，有72%的母牛受胎，其中雙胎率可達到73%。3、縮短世代間隔，增加選擇強度，也可以減少種畜的引進和保存品種資源等。加速了良種母畜的建立和擴大

(三)、胚胎移植的生理基礎1、母牛發(fā)情后生殖器官的孕向發(fā)育在發(fā)情后的最初一段時期，不論是否已受精，母牛生殖系統(tǒng)均處于受精后的生理狀態(tài)，在生理現(xiàn)象上，妊娠與未孕并無區(qū)別。2、早期胚胎的游離狀態(tài)胚胎在發(fā)育早期有相當一段時間(附植之前)是獨立存在的，它的發(fā)育基本上靠本身貯存的養(yǎng)分，還未和子宮建立實質(zhì)性聯(lián)系。3、在同一物種之內(nèi)，并沒有免疫排斥現(xiàn)象。4、移植的胚胎，在一定時期會和受體子宮內(nèi)膜建立生理上和組織上的聯(lián)系，保證了以后的正常發(fā)育。此外，受體并不會對胚胎產(chǎn)生遺傳上的影響。

(四)、胚胎移植的操作原則1、胚胎移植前后所處環(huán)境的一致性2、胚胎收集期限牛一般受精后3-8天采集3、在全部操作過程中，胚胎不應受到任何不良因素(物理的、化學的、微生物的)的影響而危及生命力。4、移植的胚胎必須經(jīng)鑒定并認為是發(fā)育正常者。

選擇供體母牛受體母牛……同期發(fā)情處理……超數(shù)排卵供體公牛配種沖卵質(zhì)量檢查、培養(yǎng)胚胎移植妊娠檢查分娩（胚胎移植的犢牛）(五).胚胎移植的基本程序1、供體、受體的選擇供體是要加速繁殖的、有生產(chǎn)應用價值的、健康的優(yōu)良畜種。受體是繁殖力強的健康本地種。3、同步發(fā)情處理即：利用某些激素制劑人為的控制和調(diào)整一群母畜的發(fā)情周期，使之在預定時間內(nèi)發(fā)情。同期發(fā)情技術(shù)就是以卵巢和垂體分泌的某些激素在母畜發(fā)情周期中的作用作為理論依據(jù)用激素制劑和類似物，有意識地干預某些母畜的發(fā)情過程，暫時打亂它們的自然發(fā)情周期的規(guī)律，繼而將發(fā)情周期的進程調(diào)整到統(tǒng)一的步調(diào)之內(nèi)，人為地造成發(fā)情同期化。

添加孕酮等孕激素延長抑制卵泡發(fā)育，延長黃體期；添加前列腺素類

溶解黃體使得發(fā)情期提前到來，有時為了使同期發(fā)情同期排卵更有效，以便提高受胎率，而采取的配套的促性腺激素，如孕馬血激素、

絨毛膜激素、促卵泡素，促黃體素及促性腺激素釋放激素，它可促進

內(nèi)源促性腺激素的釋放。

母牛的發(fā)情周期

黃體期卵泡期周期第18至第21天周期第1至第17天4、采卵即：胚胎回收

手術(shù)法：按外科剖腹術(shù)的要求進行術(shù)前準備收集胚胎的方法非手術(shù)法：采卵一般在輸精后5-7天進行?？刹捎枚穼Ч艿臎_卵器5、胚胎檢查

(1)檢卵將收集的沖卵液于37℃溫箱內(nèi)靜置10-15min。胚胎沉底后，移去上層液。取底部少量液體移至平皿內(nèi)，靜置后，鏡檢。低倍(10-20倍)下檢查胚胎數(shù)量，高倍(50-100倍)下觀察胚胎質(zhì)量。(2)吸卵可用1毫升的注射器裝上特別的吸頭進行吸卵。要求目標準確，速度快，帶液量少，無丟失。目的是移取、清洗、處理胚胎，(3)胚胎質(zhì)量鑒定正常發(fā)育的胚胎，細胞(卵裂球)外形整齊，大小一致，分布均勻，外膜完整。無卵裂現(xiàn)象(未受精)和異常卵(外膜破裂、卵裂球破裂等)都不能用于移植。不同動物胚胎移植時間不同牛、羊：桑椹胚或囊胚階段小鼠、家兔：卵裂期或囊胚階段試管嬰兒：8個或16個細胞階段

6.胚胎培養(yǎng)發(fā)育到適宜階段時，可將其取出向受體移植或冷凍保存。對供體和受體于術(shù)后要注意觀察是否發(fā)情。供體發(fā)情時即可正常配種，或經(jīng)過40-80天再重復作為供體。胚胎移植的成功率，即受體妊娠率，鮮胚移植達60-70%，凍胚也達到45-50%，半胚移植達55.6%。超數(shù)排卵與胚胎移植技術(shù)在畜牧業(yè)生產(chǎn)應用中到底有多大的意義呢？超數(shù)排卵與胚胎移植技術(shù)發(fā)展到現(xiàn)在，仍然有幾個基礎問題需要進行深入研究：研究控制卵泡發(fā)育動態(tài)的原理和方法，進一步縮小超數(shù)排卵的個體差異、提高超排穩(wěn)定性，提高胚胎移植在家畜品種改良和育種中的應用效率在胚胎移植工作中，后代數(shù)量遠遠少于預期數(shù)。這里面肯定存在著從卵泡生長發(fā)育、卵母細胞生長成熟及早期胚胎發(fā)育的內(nèi)在原因，但到底是什么原因，這是我們需要進一步探索清楚的問題。供體母畜各個體之間所獲得的胚胎移植效果存在著較大的差異(P<0.05)，

四、胚胎分割技術(shù)胚胎分割技術(shù)就是將一枚胚胎用顯微手術(shù)方法分割成二分、四分、八分胚，經(jīng)體內(nèi)或體外培養(yǎng)，然后移植入受體中，得到同卵雙生或多生后代的技術(shù)。是胚胎克隆的一種方法。胚胎分割技術(shù)研究的理論根據(jù)是動物早期胚胎細胞具有全能性。1979年，英國一位科學家利用綿羊的幼胎進行試驗，當綿羊的受精卵從1個分裂為8個細胞時，他把這8個細胞分成4份，每份2個細胞，然后將分割的細胞重新送到母羊子宮里孕育。結(jié)果，母羊產(chǎn)下了4頭活潑健康的小羊羔。1986年我國科學家曾用綿羊作試驗，把一高產(chǎn)綿羊的胚胎分成5份，分別移植在4頭普通的發(fā)情母羊子宮內(nèi)培育，結(jié)果得到5頭小羊羔。

胚胎分割、移植技術(shù)對提高動物繁殖率的效果是極其顯著的。如在正常情況下，一頭良種奶牛一生產(chǎn)仔只是10頭左右，如采用胚胎分割、移植技術(shù)，這奶牛就能得到幾百頭良種奶牛。受精卵分割半胚徒手切割

五、胚胎的保存

（一）、胚胎保存原因?qū)μ囟ǖ墓w而言，能夠獲得的胚胎數(shù)是不可預測的室溫或體溫條件下，在特定培養(yǎng)液中胚胎只能存活10-20小時(牛羊移植用的鮮胚要在4-8小時進行）。（二）、胚胎保存的意義

1、可以免去移植時要求的同期發(fā)情處理。2、可以不受時間、地點和選定受體母牛的限制，隨時隨地可以進行胚胎移植。

（三）、胚胎的保存方法1972年Whittinghan等發(fā)現(xiàn)了在-196℃下保存2～8細胞期小鼠胚胎的冷凍技術(shù)。常規(guī)速冷凍法冷凍保存方法一步冷凍法玻璃化法常采用多種抗凍保護劑。六、動物性別控制（一）、動物性別控制（sexcontrol）指通過人為的手段進行干預，使動物按人們的意愿繁殖出特定性別后代的技術(shù)。

動物的性別由什么決定呢？在二倍體動物的體細胞中,都有一對與性別決定有明顯而直接關(guān)系的染色體叫性染色體。1902年Mcclung研究蝗蟲時，在歷史上首次提出了性別決定的染色體理論。（二）理論基礎

動物的性染色體分為兩類：XY型雄性中是一對大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)不同的性染色體，大的一條叫X染色體,小的一條叫Y染色體，即：XY型。雌性的體細胞中是一對X染色體，即：XX型。稱為雄異配型。大部分動物屬于此類型。ZW型是雌異配型，主要是鳥類和極少數(shù)昆蟲。在XY型染色體中，精子有兩種類型，一是含有X染色體的精子，另一個是含有Y染色體的精子。在哺乳動物中，含X染色體精子受精后生產(chǎn)出雌體，含Y染色體精子受精后生產(chǎn)出雄體。

（三）、性別控制的方法與技術(shù)1、X、Y精子分離法(受精之前干預）

2、早期胚胎性別鑒定(受精之后干預）

3、激素和環(huán)境

1、X、Y精子分離法1.1理論依據(jù)：X、Y精子的差別Y精子有F小體即Y染色體長臂末端有比其他部分強的熒光亮點精子的重量X染色體的DNA含量比Y染色體的多，所以在液體中運動力和沉降速度不同。？精子的運動Y精子的運動活力比較強，運動速度快精子的耐酸堿性Y精子喜堿性，X精子喜酸性精子表面抗原Y精子表面有H-Y抗原（雄性特異性次要組織相容性抗原）1.2分離方法（1）沉降法

利用一定的密度、粘度、pH值、滲透壓并且在有營養(yǎng)的液體中對精液沉降分離，用層次沉淀達到分離目的。上層主要為Y精子，下層主要為x精子（2）離心法

這種方法主要是依據(jù)精子的比重關(guān)系來分離精子。以上兩種方法有一定效果其結(jié)果都不穩(wěn)定（3）電泳法

利用X，Y精子所帶生物點不同，采用電泳法對精子進行分離，分別收集向陽極和陰極移動的精子。大量實驗表明，陽極方向多為X精子，陰極方向多為Y精子（4）流式細胞分離法

主要依據(jù)是X、Y精子DNA的含量不同。

(5)免疫學方法目前國內(nèi)外對H—Y克隆抗體都有廣泛的研究，可以期望未來免疫學方法能在控制性別上得到應用（6）改變調(diào)控受精環(huán)境（牛的性控常用方法）調(diào)節(jié)生殖道PH值

有人在人工授精時用化學試劑改變陰道里pH值（精氨酸，蘇打水等沖洗），從而控制動物后代性別比例?？刂戚斁珪r間該方法應用關(guān)鍵是如何準確判斷發(fā)情和確定何時排卵。先排卵再輸精，產(chǎn)雄性的幾率高，反之，則雌性的幾率高。冷凍精液（奶牛生產(chǎn)常用方法）Y精子由于活動力強，存活時間短，冷凍后在復蘇活力大減，