第16章 程序性細(xì)胞死亡與細(xì)胞衰老

第十六章細(xì)胞死亡與細(xì)胞衰老第一節(jié)細(xì)胞死亡死亡是生命的普遍現(xiàn)象，但細(xì)胞死亡并非與機(jī)體死亡同步。正常的組織中也發(fā)生細(xì)胞死亡，它是維持個(gè)體的正常生長發(fā)育及其生命活動(dòng)所必需的。要求特定基因表達(dá)。2002年10月7日英國人Sydney、美國人Horvitz和英國人Sulston，因在PCD方面的研究獲諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。H.RobertHorvitzJohnE.SulstonSydneyBrenner（一）細(xì)胞壞死（二）細(xì)胞凋亡（研究較深入）（三）自噬第一節(jié)細(xì)胞死亡（一）細(xì)胞壞死

1.特點(diǎn)被動(dòng)是細(xì)胞受到意外損傷時(shí)立即出現(xiàn)的反應(yīng)?！続TP】↘

無法維持細(xì)胞存活。細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，細(xì)胞質(zhì)膜破損，線粒體腫脹，繼而溶酶體破裂，細(xì)胞內(nèi)容物流出，引起炎癥。DNA隨機(jī)降解，彌散帶。壞死細(xì)胞的形態(tài)變化2.意義：“替補(bǔ)”凋亡凋亡不能正常發(fā)生而細(xì)胞必須死亡時(shí)。（一）細(xì)胞凋亡cellapoptosis1.概念、特征

Kerr（1972）最先提出，受基因調(diào)控的主動(dòng)的生理性細(xì)胞自殺行為，具有一系列生物學(xué)特征。（P3421、2、3自學(xué)）與細(xì)胞壞死的區(qū)別是：①細(xì)胞凋亡生理性，而細(xì)胞壞死是病理性變化。②細(xì)胞通過出芽的方式形成許多凋亡小體；③凋亡小體內(nèi)有結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞器,線粒體無變化，溶酶體活性不增加；④細(xì)胞質(zhì)膜始終保持完整，細(xì)胞內(nèi)含物不發(fā)生外泄，不引起炎癥；⑤內(nèi)切酶活化，DNA有控降解，凝膠電泳圖譜呈梯狀。/線粒體腫脹腫脹內(nèi)切酶活化，DNA有控降解正常凋亡胸腺細(xì)胞正常凋亡小結(jié)壞死與凋亡的區(qū)別

凋亡壞死

胞體變小變大胞膜皺縮腫脹胞核濃縮,溶解,

染色質(zhì)固縮形成染色質(zhì)裂解塊狀小體,為顆粒狀,

位于膜下散在分布胞質(zhì)濃縮腫脹結(jié)果形成凋亡小體細(xì)胞崩解無炎癥反應(yīng)引起炎癥反應(yīng)只影響散在單個(gè)細(xì)胞涉及周邊大量細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)不被破壞組織結(jié)構(gòu)被破壞

形態(tài)上

凋亡壞死生DNA由內(nèi)切酶切為不規(guī)則斷裂

180-200bp或其倍數(shù)的片段大小片段不一化電泳結(jié)果“梯狀”條帶（DNAladders）

“彌散”條帶酶核酸內(nèi)切酶等的激活無酶的激活上大分子新基因表達(dá)RNA無合成和調(diào)控因子合成2、細(xì)胞凋亡的生理和病理學(xué)意義生理學(xué)意義：

生長發(fā)育：組織與器官的塑造（趾的分化）；動(dòng)物變態(tài)；皮膚角質(zhì)形成；

免疫細(xì)胞分化：克隆選擇，異常淋巴細(xì)胞凋亡；生理保護(hù)：清除體內(nèi)多余、受損或危險(xiǎn)的細(xì)胞而不對(duì)周圍的細(xì)胞或組織產(chǎn)生損害。Sculptingthedigitsinthedevelopingmousepawbyapoptosis（Wood2000）趾的分化趾的分化動(dòng)物變態(tài)2、細(xì)胞凋亡的生理和病理學(xué)意義生理學(xué)意義：

生長發(fā)育：組織與器官的塑造（趾的分化）；動(dòng)物變態(tài)；皮膚角質(zhì)形成；

免疫細(xì)胞分化：克隆選擇，異常淋巴細(xì)胞凋亡；生理保護(hù)：清除體內(nèi)多余、受損或危險(xiǎn)的細(xì)胞而不對(duì)周圍的細(xì)胞或組織產(chǎn)生損害。細(xì)胞凋亡使得神經(jīng)元與靶細(xì)胞的數(shù)量相匹配50%神經(jīng)元凋亡，存活神經(jīng)元與靶細(xì)胞建立連接病理學(xué)意義

病原體侵染；誘導(dǎo)凋亡——HIVAIDS抑制凋亡——Poxvirus痘病毒

細(xì)胞凋亡不足腫瘤，自身免疫疾??；

細(xì)胞凋亡過度神經(jīng)退行性疾病（AD，帕金森癥）、心肌梗塞、

再生障礙性貧血、骨組織壞死。形態(tài)學(xué)觀測：染色法、透射和掃描電鏡觀察3、細(xì)胞凋亡的檢測方法梯狀條帶DNA電泳：DNA片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶（DNAladders）凝膠中裂解，短時(shí)電泳。正常細(xì)胞圓球形。彗星電泳法（cometassay）流式細(xì)胞分析亞二倍體峰出現(xiàn)

TUNEL測定法，即DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法提取DNA熒光標(biāo)記3’末端4、細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制（1）Caspase依賴性細(xì)胞凋亡（cysteine

aspartate-specificprotease）

半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（2）非Caspase依賴性細(xì)胞凋亡模式生物：秀麗隱桿線蟲（C.elegans）是研究PCD的理想材料（生命周期短3d，細(xì)胞數(shù)量少，透明）。凋亡基因突變，一系列突變體。有1090個(gè)體細(xì)胞，131個(gè)細(xì)胞發(fā)生了PCD。線蟲(C.elegans)凋亡研究發(fā)現(xiàn)ced3，ced4基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制細(xì)胞凋亡，胚胎期死亡。Ced3哺乳類同源物是Caspase1（cysteine

aspartate-specificprotease）。（1）Caspase依賴性細(xì)胞凋亡

①Caspase家族相當(dāng)于線蟲的ced-3，是引起凋亡的關(guān)鍵酶。特點(diǎn)：胞質(zhì)中一組結(jié)構(gòu)類似的蛋白酶，選擇性切割某些蛋白質(zhì)?；钚晕稽c(diǎn)均包含半胱氨酸殘基；特異切割靶蛋白天冬氨酸殘基后的肽鍵caspase（cysteine

aspartate-specificprotease）。哺乳動(dòng)物caspase超家族15種P346表16-1Caspase-1、-4、-11主要負(fù)責(zé)白介素前體的活化（切割），不直接參與凋亡信號(hào)的傳遞。凋亡起始者

2、8、9、10、112、9含Caspase募集結(jié)構(gòu)域CARD，

8、10含串聯(lián)重復(fù)的死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域DEDCARD、DED與接頭蛋白結(jié)合，或彼此結(jié)合而聚合。凋亡執(zhí)行者

3、6、7藥物靶標(biāo)分子

Caspase抑制劑對(duì)細(xì)胞過度凋亡引發(fā)的疾病有效

Caspase活性調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)放大Caspase活化凋亡信號(hào)↓凋亡起始者酶原分子聚集成復(fù)合物達(dá)一定濃度，彼此切割，構(gòu)象改變↓活性二聚體↓招募異性活化執(zhí)行者前體Caspase

（切割）產(chǎn)生有活性的執(zhí)行者↓（切割）細(xì)胞核、質(zhì)中結(jié)構(gòu)蛋白，已知280種↓細(xì)胞凋亡同性活化級(jí)聯(lián)放大激活期：執(zhí)行期：滅活細(xì)胞凋亡發(fā)生的抑制劑直接破壞裂解細(xì)胞結(jié)構(gòu)裂解某些功能性的酶蛋白

②死亡受體起始的外源途徑

死亡配體主要是腫瘤壞死因子（TNF）家族成員。TNF主要由單核-巨噬細(xì)胞分泌。一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，主要生理效應(yīng)是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和誘發(fā)炎癥反應(yīng)。死亡受體代表成員：Fas和TNF-R1。胞質(zhì)部分均含有死亡結(jié)構(gòu)域（deathdomain,DD）。負(fù)責(zé)招募凋亡信號(hào)通路中的信號(hào)分子。fas又稱作APO-1，1993年人白細(xì)胞分型國際會(huì)議統(tǒng)一命名為CD95。Fas誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡Fas蛋白與Fas配體組成Fas系統(tǒng)，二者的結(jié)合后引起Fas三聚化，通過胞內(nèi)的DD區(qū)與接頭蛋白FADD的DD區(qū)結(jié)合。FADDN端通過DED區(qū)（deatheffectordomain）與Caspase-8酶原結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物DISC。Caspase-8酶原通過自身切割激活。

Caspase-8激活執(zhí)行者Caspase-3酶原，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。王曉東：歷史上最年輕美國科學(xué)院院士（41）美籍華人在學(xué)術(shù)領(lǐng)域地位最高的科學(xué)家原籍河南新鄉(xiāng)從事的是細(xì)胞凋亡規(guī)律的研究。

1996年，發(fā)現(xiàn)線粒體釋放細(xì)胞色素C,引起細(xì)胞凋亡;

2000年，發(fā)現(xiàn)線粒體釋放Smac，可促細(xì)胞凋亡.

與鄧興旺一起聘為北京生命科學(xué)研究所第一任所長。②線粒體起始的內(nèi)源途徑其他因素刺激（DNA損傷、紫外線、射線、藥物、NO、活性氧等），Caspase-8把Bid（促凋亡）切割成兩個(gè)片段；含BH3結(jié)構(gòu)域的片段被運(yùn)送到線粒體；與Bcl-2/Bax（抑凋亡）的BH3結(jié)構(gòu)域形成復(fù)合物；引起線粒體外膜通透性改變，導(dǎo)致多種凋亡因子（關(guān)鍵因子Cytc

）釋放；Cytc與胞質(zhì)中Apaf-1（凋亡蛋白酶活化因子，結(jié)合蛋白）結(jié)合募集Caspase-9酶原形成很大的凋亡復(fù)合體；Caspase-9活化，凋亡信號(hào)進(jìn)一步擴(kuò)大。Bcl-2genefamily（Zimmermann2001）含有1-4個(gè)Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域（BH3）。其他因素刺激（DNA損傷、紫外線、射線、藥物、NO、活性氧等），Caspase-8把Bid（促凋亡）切割成兩個(gè)片段；含BH3結(jié)構(gòu)域的片段被運(yùn)送到線粒體；與Bcl-2/Bax（抑凋亡）的BH3結(jié)構(gòu)域形成復(fù)合物；引起線粒體外膜通透性改變，導(dǎo)致多種凋亡因子（關(guān)鍵因子Cytc

）釋放；Cytc與胞質(zhì)中Apaf-1（凋亡蛋白酶活化因子，結(jié)合蛋白）結(jié)合募集Caspase-9酶原形成很大的凋亡復(fù)合體；Caspase-9活化，凋亡信號(hào)進(jìn)一步擴(kuò)大。BCL-2家族成員

促凋亡基因，如：Bid、Bax、Bak；

抑凋亡基因，如：Bcl-2。

Caspase級(jí)聯(lián)激活反應(yīng)還可能起始于細(xì)胞核、高爾基體、溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，機(jī)制不清。（2）Caspase非依賴細(xì)胞凋亡不完全清楚凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）位于線粒體外膜↓細(xì)胞質(zhì)↓細(xì)胞核↓DNA斷裂形成50kb片段線粒體限制性內(nèi)切酶G（EndoG）以核小體為單位DNA片段存活因子：多種有絲分裂原、生長因子?！せ钍荏w胞內(nèi)激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB↓內(nèi)源性Caspase抑制因子↓存活（3）細(xì)胞凋亡的調(diào)控外源性Caspase抑制因子天花病毒蛋白CrmA，桿病毒蛋白p35，皰疹病毒，痘病毒。內(nèi)源性凋亡激活因子Smac/DIABLO、Omi/HtrA2，與內(nèi)源性Caspase抑制因子IAP結(jié)合釋放被封閉Caspase，引發(fā)凋亡線粒體凋亡信號(hào)P53腫瘤抑制基因，促凋亡因子基因組的守護(hù)者。輻射誘導(dǎo)的DNA損傷可通過ATM（DNA損傷檢驗(yàn)的重要蛋白激酶）激活p53，阻斷細(xì)胞周期，誘導(dǎo)凋亡?！胺肿泳臁盤53的促凋亡機(jī)制：（1）修復(fù)受損的DNA，如修復(fù)失敗則通過細(xì)胞核途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。（2）激活線粒體途徑（3）誘導(dǎo)Fas增加（4）誘導(dǎo)溶酶體的不穩(wěn)定性(三)自噬壽命較長的細(xì)胞結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)通過細(xì)胞自噬途徑降解。1.特征

細(xì)胞中出現(xiàn)大的雙層膜（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、胞質(zhì)膜泡）的自噬小體，溶酶體降解。不需吞噬細(xì)胞協(xié)助。2.意義營養(yǎng)危機(jī)細(xì)胞凋亡的補(bǔ)充途徑（凋亡關(guān)鍵因子被抑制時(shí)）3.機(jī)制（了解較少）PI3K/AKT信號(hào)途徑二、植物細(xì)胞與酵母PCD（一）植物細(xì)胞PCD（較晚，不甚清楚）1.典型PCD：木質(zhì)部管狀細(xì)胞成熟過程過敏反應(yīng)（感染后自動(dòng)快速死亡）2.特征：死亡細(xì)胞殘余物被細(xì)胞壁固定在原位被自身液泡水解酶消化。誘發(fā)機(jī)制不同，植物細(xì)胞PCD的形態(tài)不同例：過敏反應(yīng)染色質(zhì)凝集，DNA降解為50kb片段等等

管狀細(xì)胞細(xì)胞壁增厚，液泡膜破裂，核DNA迅速降解等。（二）酵母PCD1.誘導(dǎo)因素藥物2.特征與動(dòng)物細(xì)胞凋亡類似3.意義控制群體數(shù)量，有限營養(yǎng)優(yōu)先供應(yīng)。第二節(jié)細(xì)胞的衰老一、概念及特征復(fù)制衰老：細(xì)胞復(fù)制能力有限，有限次數(shù)分裂。

防止細(xì)胞過度生長和癌化的一種保護(hù)機(jī)制。

Hayflick界限(HayflickLimitation）

Hayflick界限(HayflickLimitation）概念：關(guān)于細(xì)胞增殖能力和壽命是有限的觀點(diǎn)細(xì)胞，至少是培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞，不是不死的，而是有一定的壽命；它們的增殖能力不是無限的，而是有一定的界限，這就是Hayflick界限。癌細(xì)胞或培養(yǎng)的細(xì)胞系是不正常細(xì)胞，其染色體數(shù)目或形態(tài)已經(jīng)不同于原先的細(xì)胞細(xì)胞的增殖能力與供體年齡有關(guān)物種壽命與培養(yǎng)細(xì)胞壽命之間存在著一定的關(guān)系二倍體細(xì)胞的衰老是由細(xì)胞本身決定的 ◆決定細(xì)胞衰老的因素在細(xì)胞內(nèi)部，不是外部的環(huán)境 ◆是細(xì)胞核而不是細(xì)胞質(zhì)決定了細(xì)胞衰老（一）細(xì)胞核的變化

1.大小體外培養(yǎng)二倍體細(xì)胞中，分裂次數(shù)↗，核↗，呈函數(shù)關(guān)系。

2.核膜內(nèi)折與齡俱增

3.染色質(zhì)固縮化與染色質(zhì)蛋白二硫鍵數(shù)量有關(guān)，體外培養(yǎng)細(xì)胞（體內(nèi)某些細(xì)胞）與齡俱增（二）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化

RER解體趨勢，排列有序→彌散性，總量減少。（三）線粒體的變化數(shù)量隨齡減少，體積隨齡增大。（四）致密體的形成←溶酶體、線粒體轉(zhuǎn)化（五）膜系統(tǒng)液晶相→凝膠相或固相（六）其他間隙連接減少細(xì)胞衰老的特征原生質(zhì)失水、代謝降低、結(jié)構(gòu)逐漸瓦解！二、細(xì)胞衰老的特征原生質(zhì)失水、代謝降低、結(jié)構(gòu)逐漸瓦解！體外培養(yǎng)細(xì)胞衰老生物學(xué)特征生長不可逆停滯，細(xì)胞停止分裂衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活化

pH4.0→pH6.0表現(xiàn)活性

β-半乳糖苷酶底物染色1.DNA：復(fù)制與轉(zhuǎn)錄受阻，端粒DNA、mtDNA缺失。DNA氧化、斷裂、缺失和交聯(lián)，甲基化程度降低。2.RNA：含量降低。3.蛋白質(zhì)：含成下降，發(fā)生修飾、交聯(lián)。4.酶分子：活性中心被氧化，金屬離子丟失，酶分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)，溶解度，等電點(diǎn)發(fā)生改變，酶失活。5.

脂類：不飽和脂肪酸被氧化。分子水平的變化（一）差錯(cuò)學(xué)派（脅迫誘導(dǎo)的早熟性衰老）代謝廢物積累：如：脂褐質(zhì)自由基攻擊：導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)變異，正常細(xì)胞內(nèi)存在清除自由基的防御系統(tǒng)：酶系統(tǒng)：超氧化物歧化酶(SOD)，過氧化氫酶(CAT)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)；非酶系統(tǒng)：維生素E，醌類等電子受體。二、細(xì)胞衰老的分子機(jī)理1、細(xì)胞有限分裂學(xué)說“Hayflick”極限，即細(xì)胞最大分裂次數(shù)。L.Hayflick(1961)報(bào)道，人的成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)增殖次數(shù)是有限的（60~70代）。細(xì)胞增殖次數(shù)與端粒DNA長度有關(guān)。2、重復(fù)基因失活學(xué)說：如哺乳動(dòng)物rRNA基因數(shù)隨年齡而減少。（二）遺傳論學(xué)派Harley等發(fā)現(xiàn)人體成纖維細(xì)胞端粒每年縮短14－18bp，1990年，他提出細(xì)胞衰老的端粒假說。主要思想：端粒是細(xì)胞衰老的“有絲分裂鐘”，細(xì)胞增殖次數(shù)與端粒DNA長度有關(guān)，隨細(xì)胞每次分裂，端粒不斷縮短；當(dāng)端粒長度縮短達(dá)到一個(gè)閾值時(shí)（Hayflick點(diǎn)）細(xì)胞進(jìn)入衰老。復(fù)制衰老的分子機(jī)制---細(xì)胞衰老的端粒假說端粒：是染色體末端由簡單串聯(lián)重復(fù)序列組成的特殊結(jié)構(gòu)；細(xì)胞分裂過程中，端粒不能完全復(fù)制而逐漸縮短。端粒酶：是一種由RNA和蛋白質(zhì)組成的核糖核蛋白酶，具有反轉(zhuǎn)錄酶性質(zhì),可使端粒長度增加，常見于生殖細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。細(xì)胞的增殖次數(shù)是有限的，如人胚成纖維細(xì)胞可培養(yǎng)60-70代。端粒每復(fù)制一次減少50-100bp。正常體細(xì)胞缺乏端粒酶，故隨細(xì)胞分裂而變短，細(xì)胞隨之衰老。stop端粒長度復(fù)制型衰老的信號(hào)通路3、衰老基因?qū)W說子女的壽命與雙親的壽命有關(guān)；各種動(dòng)物都有相當(dāng)恒定的平均壽命和最高壽命；成人早衰癥：平均39歲時(shí)出現(xiàn)衰老，47歲生命結(jié)束；嬰幼兒早衰癥：1歲時(shí)出現(xiàn)明顯的衰老，12~18歲生命結(jié)束，早衰癥患者體內(nèi)解旋酶發(fā)生突變。Caenrhabditis

elegans的平均壽命僅3.5天，該蟲age-1單基因突變，可提高平均壽命65%，提高最大壽命110%。Werner'ssyndrome成人早衰癥嬰幼兒早衰癥三、細(xì)胞衰老與個(gè)體衰老和癌癥的關(guān)系因?yàn)榕囵B(yǎng)環(huán)境不同，細(xì)胞衰老模型不能解釋個(gè)體衰老。衰老相關(guān)基因剔除→易發(fā)腫瘤→體外細(xì)胞衰老與腫瘤相關(guān)。TheEND促凋亡因子Bax、Bak發(fā)生寡聚化從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體外膜與膜