第三章 DNA的復制

人工基因組的設計與合成李炳志bzli@2014-035’和3’的定義和識別第三章 DNA的復制李炳志bzli@2014-03中心法則蛋白質翻譯轉錄逆轉錄復制DNARNA復制幾個基本概念

復制：以親代DNA或RNA為模板，根據(jù)堿基配對的原則，在一系列酶的作用下，生成與親代相同的子代DNA或RNA的過程。

逆轉錄：以RNA為模板，在逆轉錄酶的作用下，

生成DNA的過程。

翻譯：亦叫轉譯，以mRNA為模板，將mRNA的密碼解讀成蛋白質的氨基酸順序的過程。

轉錄：以DNA為模板，按照堿基配對原則合成RNA，即將DNA所含的遺傳信息傳給RNA，形成一條與DNA鏈互補的RNA的過程。主要內容第三章 DNA的復制第四章

轉錄第五章

蛋白合成第六章

表達調控蛋白質翻譯轉錄逆轉錄復制復制DNARNA第三章 DNA的復制DNA復制的特點DNA復制的條件DNA復制的過程DNA復制的類型DNA復制的特點

半保留復制半不連續(xù)復制特點一：DNA的半保留復制以親代DNA雙鏈為模板以堿基互補方式合成子代DNA，這樣新形成的子代DNA中，一條鏈來自親代DNA，而另一條鏈則是新合成的，這種復制方式叫半保留復制。AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈DNA

復制過程子代DNA

半保留復制DNA半保留復制圖示：半保留復制的證明Meselson和Stahl將同位素15N標記的15NH4Cl加入大腸桿菌的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12代，使大腸桿菌的DNA都帶上15N的標記，然后將該大腸桿菌轉入14N的普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，分離子一代、子二代、子三代、子四代DNA，進行氯化銫密度梯度離心，實驗證明了DNA的半保留復制。半保留復制的假設半保留復制實驗證據(jù)（Meselson-Stahl)[15N][15N-14N][14N][15N-14N][15N-14N]特點二：DNA的復制是半不連續(xù)的

DNA復制在合成前導鏈（leadingstrand)時是連續(xù)的；而在合成滯后鏈(laggingstrand)時是先形成岡崎片段（Okazakifragment

），隨后再將它們連接而成大片段。因滯后鏈是不連續(xù)合成的而先導鏈是連續(xù)合成的，所以我們稱之為半不連續(xù)復制（semidiscontinuousreplication)。兩條新鏈具有不同的特征ThetwonewDNAstrandshavedifferentfeaturesOkazakifragment連接酶（Ligase)將Okazakifragment連接在一起前導鏈和滯后鏈合成的協(xié)同兩個假設：1）同一DNA聚合酶完成多個岡崎片段的合成；2）每個岡崎片段有不同的DNA聚合酶合成。1）模板(template)：解開成單鏈的DNA母鏈2）底物(substrate)或稱原料：dATP、dGTP、dCTP、dTTP3）引物(primer)：復制需要一小段RNA作引物4）能源：需ATP供能，原料dNTP本身也是高能化合物5）酶和蛋白質因子：DNA聚合酶(polymerase)等3.2參與DNA復制的物質及作用解鏈酶拓撲異構酶SSB引物酶DDDP-ⅢDDDP-Ⅰ連接酶解鏈酶（helicase）作用：利用ATP供能，解開DNA雙鏈消耗2ATP/解開1bp可隨復制叉的伸展向前移動也稱：解螺旋酶解鏈酶拓撲異構酶SSB引物酶DDDP-ⅢDDDP-Ⅰ連接酶拓撲異構酶拓撲異構酶

（topoisomerase，Topo）Topo：拓撲是指物體或圖像作彈性位移而又保持物體不變的性質作用：松馳DNA超螺旋，克服扭結現(xiàn)象解鏈酶拓撲異構酶SSB引物酶DDDP-ⅢDDDP-Ⅰ連接酶拓撲異構酶工作原理：DNA的超螺旋可以通過單鏈的剪切來消除。單鏈DNA結合蛋白(SSB)

(singlestrandDNAbindingprotein)作用：能與DNA單鏈可逆的結合，其作用有二解鏈酶拓撲異構酶SSB引物酶DDDP-ⅢDDDP-Ⅰ連接酶也稱：DNA結合蛋白（DNAbindingprotein，DBP)①防止DNA復性②防止DNA單鏈模板被水解引物酶（primase）模板以DNA單鏈為模板底物NTP（ATP、GTP、CTP、UTP）按堿基配對原則（A=UG≡C）按5→3方向解鏈酶拓撲異構酶SSB引物酶DDDP-ⅢDDDP-Ⅰ連接酶作用：復制起始時催化生成RNA引物本質：是一種RNA聚合酶（可以使兩個游離的NTP聚合，此不同于催化轉錄過程的RNA聚合酶）

DNA聚合酶全稱：依賴DNA的DNA聚合酶簡稱：DNApol（DDDP）主要作用：5→3的聚合活性解鏈酶拓撲異構酶SSB引物酶DDDP-ⅢDDDP-Ⅰ連接酶dTTP3'3'ATGCAATTGC5'||||5

TACGppiTDNA聚合酶機理：

使核苷酸之間生成3，5磷酸二酯鍵主要作用：5→3的聚合活性模板以DNA單鏈為模板底物dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）引物以小片段RNA為引物注：引物的原料（ATP、GTP、CTP、UTP）按堿基配對原則（A=TG≡C）按5→3方向在RNA引物的

3

-OH末端上開始逐個添加dNTP解鏈酶拓撲異構酶SSB引物酶DDDP-ⅢDDDP-Ⅰ連接酶DNA聚合酶E.coli大腸桿菌DNA聚合酶的作用解鏈酶拓撲異構酶SSB引物酶DDDP-ⅢDDDP-Ⅰ連接酶DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ分子數(shù)/細胞4004020聚合的核苷酸數(shù)/分鐘100050150,000（2500bp/s）5→3的聚合√√√3→5的外切√√√5→3的外切√××主要作用切除引物填補空隙校讀損傷修復校讀損傷修復DNA復制校讀真核生物DNA聚合酶的種類及其功能解鏈方向35353′3′3′

先導鏈滯后鏈

岡崎片段5′3′5′3′5′3′DNA連接酶(DNAligase)作用：消耗ATP，將隨從鏈中相鄰的兩個DNA片段連接起來催化同一模板DNA鏈上的兩個相鄰DNA片段的3＇端與5＇端間形成磷酸二酯鍵，把相鄰的兩段DNA連成完整的鏈解鏈酶拓撲異構酶SSB引物酶DDDP-ⅢDDDP-Ⅰ連接酶DNA連接酶ATPADPHO5’3’5’3’3’5’5’3’復制原點oriC和原點的識別：

DNA的復制有特定的起始位點，叫做復制原點。常用oriC(或o）表示。復制原點由DnaA蛋白識別，在原點由解螺旋酶將雙螺旋解開成單鏈狀態(tài)，分別作為模板，合成其互補鏈,在原點處形成一個眼狀結構，叫復制眼。3.3DNA的復制過程復制眼概念

復制眼：在一個長的未復制區(qū)域內DNA已經復制的區(qū)域復制子DNA中發(fā)生一次復制的單位稱為復制子(replicon)。復制子是根據(jù)它含有復制所需的控制元件來定義的，在復制啟動位點具起始點（origin)，在復制終止位點具終點（terminus)。起始點僅作用于所在復制子。

在每個細胞周期中，每個復制子發(fā)生一次復制，且只發(fā)生一次。原核生物一般有一個復制子真核生物有多個復制子質粒一般是一個自主環(huán)狀的DNA基因組，構成一個獨立復制子；原核生物基因組中一般只含一個復制子，在唯一的起始點啟動就會引起整個基因組復制；真核生物基因組含多個復制子（一般40-100kb/個）。在原核生物中，復制起始點通常為一個，而在真核生物中則為多個。

Replicationeye質粒不相容的主要原因是由于相似的復制子無法被區(qū)分。復制起始1、拓撲異構酶解開超螺旋。2、DnaA蛋白識別起始位點。3、解螺旋酶解開DNA雙鏈。4、單鏈結合蛋白結合于單鏈。5、引物合成酶開始合成RNA引物。在DNA聚合酶的催化下，以四種5‘–脫氧核苷三磷酸為底物，在RNA引物的3’端以磷酸二酯鍵連接上脫氧核糖核苷酸并釋放出焦磷酸。DNA鏈的延伸同時進行前導鏈和滯后鏈的合成。兩條鏈方向相反。

前導鏈滯后鏈岡崎片段半不連續(xù)復制岡崎模型鏈的延長岡崎片段引物的切除、缺口的填補和切口的連接:復制叉:雙螺旋DNA兩條親本鏈分開使復制能進行的部位。復制叉的概念及其移動方向的確定放射性自顯影法：對于大基因組內的不確定區(qū)域，兩次連續(xù)的放射脈沖可以用來標記復制的移動。如果一個脈沖比另一個脈沖強，我們可以用相對的標記強度來區(qū)分，這些可用放射自顯影觀察。單向復制：在復制眼的一端，一種類型的標記后緊跟著另一種標記；雙向復制：在復制眼的兩端產生一種（對稱的）模式。在真核生物中普遍存在。原核生物可以有多重復制叉存在。復制的終止順時針終止陷阱逆時針終止陷阱Ter:終止陷阱，引起復制終止的特定區(qū)域，20bp的序列，終止利用物質Tus可識別并結合，從而導致DNA復制的終止。參與DNA復制的酶與蛋白因子總覽圖DNA聚合酶控制復制的保真性DNA的復制方式θ-復制D-環(huán)復制滾環(huán)復制結合轉移中DNA復制線性復制θ-復制D-環(huán)復制一條鏈復制67%,另一條鏈才開始復制。TheAproteiniscis-acting滾環(huán)復制結合轉移中DNA復制單鏈復制在供體中完成，然后轉移到受體細胞，在受體中完成雙鏈的配對，整合入受體細胞。真核生物DNA復制的特點4、真核生物染色體在全部復制完之前起點不再重新開始復制；而在快速生長的原核生物染色體DNA復制中，起點可以連續(xù)發(fā)動復制。真核生物快速生長時，往往采用更多的復制起點