基因工程抗體

基因工程抗體及其進展【摘要】著對分子生物學研究和抗體分子結構功能的深入研究,利用細胞工程和遺傳工程對抗體分子進行改建并賦予其新的功能,進而開發(fā)了新的抗體應用領域，使單克隆抗體技術又向前發(fā)展了一步。基因工程抗體是按人類設計所重新組裝的新型抗體分子，可保留或增加天然抗體的特異性和主要生物學活性，去除或減少無關結構，從而可克服單克隆抗體在臨床應用方面的缺陷。細胞工程產(chǎn)生的鼠源單克隆抗體及基因工程產(chǎn)生的人源單克隆抗體?？贵w產(chǎn)生的技術革命為抗體治療開辟了廣闊的前景?！娟P鍵字詞】基因工程抗體人源化抗體小分子抗體廣闊的前景基因工程抗體以其獨特的優(yōu)點（免疫原性低、可按人的意愿加以改造等）正逐漸取代動物源性單抗。隨著基因工程和蛋白質(zhì)工程等生物技術在抗體研制領域的廣泛應用，適應不同需要的基因工程抗體的種類日趨多樣化，構建日趨合理化，在體內(nèi)的生物學效應也日臻完善，使之較天然單抗的治療效果更好，范圍更廣，并在初步臨床試用中展示了光輝的前景。分子生物學技術的發(fā)展，推動了免疫球蛋白遺傳學的研究?？贵w的研究從原來的血清學方法、氨基酸水平分析發(fā)展到大免疫球蛋白基因結構、表達及調(diào)控DNA水平的研究，揭示了抗體多樣性、等位基因排斥現(xiàn)象、抗體的分泌型和膜結合型形式、H鏈類別轉(zhuǎn)換以及親和力成熟機制等多種生物學現(xiàn)象。自1975年Milstein和kOhler等人研制出單克隆抗體以來，抗體技術得到了廣泛的應用和發(fā)展，但在生物研究和臨床疾病的治療中卻遇到了一定的困難。異源性鼠抗體在人體內(nèi)誘生免疫應答，產(chǎn)生抗小鼠抗體；人單克隆雜交瘤制備困難，生產(chǎn)量少，穩(wěn)定性差;獲得特異性類別抗體比較困難。隨著對抗體基因的研究和DNA分子重組技術的應用，通過基因改造獲得特異性抗體成為可能。1989年Huse等首次構建了抗體基因庫，從而使抗體的研究從細胞水平進入到分子水平，并推動了第3代抗體一基因工程抗體技術的發(fā)展。至此，抗體的產(chǎn)生技術經(jīng)歷了三個階段：經(jīng)典免疫方法產(chǎn)生的異源多克隆抗體；細胞工程產(chǎn)生的鼠源單克隆抗體及基因工程產(chǎn)生的人源單克隆抗體。抗體產(chǎn)生的技術革命為抗體治療開辟了廣闊的前景。1、基因工程抗體概述及分類基因工程抗體又稱重組抗體，是指利用重組DNA及蛋白質(zhì)工程技術對編碼抗體的基因按不同需要進行加工改造和重新裝配，經(jīng)轉(zhuǎn)染適當?shù)氖荏w細胞所表達的抗體分子。目前報道的基因工程抗體很多，分類方法不一，大體可以分為三類。1-1完整的抗體分子該類抗體類似于天然抗體分子，但經(jīng)改造后更接近于人的免疫球蛋白，可在一定程度上降低HAMA。1?1?1-甘欠合抗體（chimericantibody）由在基因水平上連接的小鼠抗體V區(qū)及人抗體C區(qū)組成。這種抗體含75%?80%人抗體，20%鼠抗體，保留了原來鼠源單抗的特異性,但對人體仍具一定的免疫原性。1.1.2.人源化抗體(humanizedantibody)1.1.2.人源化抗體(humanizedantibody)又稱重構型抗體、改型抗體（reshapedantibody）或CDR移植抗體（CDRgraftingantibody）:通過置換三個發(fā)夾狀環(huán)的鼠抗體超變區(qū)（又稱互補決定區(qū)，CDR），使構成抗原結合部位的輕重鏈各3個CDR區(qū)是鼠源的，其余均為人源的。該抗體對人的免疫原性大大降低，但與抗原的親和力也有所下降。1.1.3.完整的人抗體?電humanantibody)這是由人淋巴細胞產(chǎn)生的理想的抗體分子，不包含任何鼠源成分。此種抗體不僅完全避免了HAMA的產(chǎn)生，而且特異性、親和力不受影響。盡管利用人細胞制備單抗的工藝尚不成熟，但抗體庫技術、體外親和力成熟及轉(zhuǎn)基因動物的研究等，已使生產(chǎn)完整的人抗體成為可能。1-2抗體分子片段小分子抗體片段具有免疫原性低，分子量小，易于滲入目標組織及清除，不與Fc受體陽性細胞相結合等優(yōu)點，并便于發(fā)展其他效應，如與毒素相連，融合表達免疫毒素；與放射性同位素相連，在體內(nèi)成像定位檢查時本底低，能呈現(xiàn)清晰圖像。1-3新型抗體分子將抗體的部分片段連接到與抗體無關的序列上或被其他功能性分子所取代，使這些抗體不僅具有與抗原結合的特性，還能發(fā)揮其他效應。2基因工程抗體的臨床應用近年來隨著生物工程技術的發(fā)展，許多基因工程抗體陸續(xù)問世，并在醫(yī)學領域的許多方面都極具應用潛力，如病毒感染、腫瘤、自身免疫性疾病、同種異體移植物注射、哮喘、中風和青光眼治療,尤其在診斷和治療腫瘤性疾病及抗感染方面優(yōu)勢明顯。2-1在腫瘤性疾病診療方面的應用放射性標記抗體在腫瘤影像和治療中很重要，并可有效進行藥代動力學評估。以標記抗體注入人體內(nèi)顯示腫瘤部位抗原與抗體結合的放射濃集稱放射免疫顯像，由于基因工程抗體如單鏈抗體、Fab片段等分子量小、能很快清除、組織穿透力強，所以更適于放射免疫顯像。例如，中等大小的雙特異性抗體(60KD)與半衰期較短的同位素相連，由于清除率快被用于臨床影像學。治療用的放射性標記抗體如小抗體(90KD),和半衰期較長的同位素相連，可在腫瘤部位達到較高濃度,適合用于腫瘤治療。2002年，美國FDA批準了第一株用于腫瘤免疫治療的放射性標記抗體(Zevalin)上市。惡性腫瘤的導向治療，是通過重組技術將抗腫瘤相關抗原的抗體與多種分子融合，這些分子在抗體結合靶分子后可提供重要輔助功能。這些分子包括:放射性核素、細胞毒藥物、毒素、小肽、蛋白、酶和用于基因治療的病毒。對腫瘤治療來說，設計的雙特異性抗體可有效針對低水平的腫瘤相關抗原，并將細胞毒物質(zhì)輸送到腫瘤細胞。此外，抗體還可與攜帶藥物的脂質(zhì)體、各種PEG偶聯(lián),從而增強體內(nèi)運輸和藥代動力學。作為免疫脂質(zhì)體,轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體可使藥物通過血腦屏障到達大腦?？贵w酶復合物作為前體藥物也被用于基礎腫瘤治療。2-2基因工程抗體的抗感染作用預防和治療感染性疾病常用的藥物是疫苗和抗生素，但對于一些尚無有效預防及治療手段的感染性疾病如SARS、AIDS等，抗體治療可做為首選方案。如在治療AIDS方面,利用抗體工程技術已成功地制備出HIV病毒整合菌的單鏈抗體ScAb2219,對HIV病毒感染的早期和晚期具有有效的抑制作用，并可望成為AIDS基因治療的有效手段。呼吸道合胞病毒(RSV)易引起嬰兒呼吸道疾病，如細支氣管炎和肺炎，并可引起嚴重的并發(fā)癥，目前已有人源化單克隆抗體Palivizumab經(jīng)美國FDA批準上市，臨床實驗證明無毒、副反應,并可顯著降低嬰兒的住院率。我國率先建立了針對SARS的基因工程抗體庫,這對于SARS的預防、診斷和治療都將起到重要作用和深遠影響。對于中和其它病原分子,FDA已批準Fab單體分子作為抗蛇毒藥物;scFv片段和寡克隆復合物作為抗細菌毒素藥物。

2.32.3細胞內(nèi)抗體術。這項技術是指在細胞內(nèi)表達并被定位于亞細胞區(qū)室如胞核、胞漿或某些細胞器，與特定的靶分子作用從而發(fā)揮生物學功能的一類新的工程抗體，最典型的是scFv,被稱為內(nèi)抗體。胞內(nèi)抗體技術主要應用在抑制病毒復制特別是HIV21復制、腫瘤基因治療方面，現(xiàn)已逐漸拓展到中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、移植排斥和自身免疫性疾病等領域。體外培養(yǎng)來源于無關供體的角質(zhì)形成細胞同種移植物用于嚴重的燒傷病人的治療,往往會引起排斥反應，而MHCI類分子是引起移植排斥的重要抗原。Mhashikar等用編碼抗MHCI單鏈抗體的腺病毒轉(zhuǎn)染角質(zhì)形成細胞，結果顯示明顯降低了MHCI的表達，細胞內(nèi)抗體介導的表型敲除是否有利于同種移植物的存活還需要進一步研究。2.4用于未來診斷的生物傳感器和微矩陣技術生物傳感器和微陣列技術在不久以后將有可能成為主要的體外診斷技術。對于大量診斷試劑盒，抗體有高敏感性和高特異性。從最初的玻璃界面到現(xiàn)在的多種蛋白親和界面，用于診斷的抗體微矩陣界面不斷發(fā)展。隨著體外機械人的出現(xiàn)，這一技術將進一步發(fā)展,并用于微生物污染、寄生蟲和生物病原體的檢測。3人源性單抗的研制3-1噬菌體抗體庫技術噬菌體抗體庫技術是從外周血淋巴細胞或脾細胞中提取RNA或基因組DNA,設計核酸引物，用PCR技術擴增出整套的抗體基因片段如Fab或scFv,通過隨即重組，插入噬菌體或噬菌粒表達載體中，與噬菌體外殼蛋白基因PIII或P伽連接，感染大腸桿菌并以融合蛋白的形式使抗體片段表達展示于噬菌體表面 ，形成含有全套抗體譜(repertoire)的噬菌體抗體庫，利用抗原2抗體特異性結合進行篩選、富集，并擴增所需克隆。噬菌體展示技術是將編碼外源肽或蛋白的DNA片段插入噬菌體的外殼蛋白共同表達于噬菌體表面，以利于配體的識別和結合，而插入的DNA片段對噬菌體的生物學特性無大的影響。3-1-1絲狀噬菌體絲狀噬菌體包括f1、fd、M13衍生的載體表達系統(tǒng)。這類噬菌體的基因組為閉合環(huán)狀的單股正鏈DNA(ssDNA)，基因組DNA的長度可隨插入DNA片段大小不同而變化;編碼10種蛋白質(zhì)，它們在分子量和拷貝數(shù)上有很大的差別，其中應用較多的是次要衣殼蛋白PIII、PW、PW、PIX和主要衣殼蛋白P伽。PIII是噬菌體的吸附蛋白，每個噬菌體平均含有5個拷貝，分子量為4.2X104,其前體在N端含有18個氨基酸的信號肽。PI作為外源性插入部位的優(yōu)點是裝載量大，甚至可容納5X104外源片段;拷貝數(shù)少,有利于分離到高親和性的表位外伽含量豐富，每個噬菌體含有2700?3000拷貝，分子量為5.2X103，其前體含有一個23氨基酸的信號肽。P伽作為外源基因插入部位的優(yōu)點是表達的抗體效價較高,但抗體親和力較低。Gao等將VH和VL基因分別連接到PW、PIX的N2末端，經(jīng)重疊PCR擴增、酶切消化后整合入載體，使之在噬菌體表面以異二聚體形式表達，成功地構建了一個噬菌體抗體庫。這類載體表達系統(tǒng)的缺點:一些較大插入片段在增殖時易發(fā)生缺失；包裝效率低，只有重組DNA鏈中一條以ssDNA形式合成包裝到病毒顆粒;宿主細胞在噬菌體感染后會發(fā)生變化3-1-2噬菌粒驗室噬菌粒是噬菌體和質(zhì)粒的混合體,含有單鏈噬菌體的復制原點和基因間隔區(qū)間及至少一種外殼蛋白編碼序列(PI或P伽)。噬菌粒作為載體應用最廣泛，其優(yōu)點:轉(zhuǎn)化率高，比噬菌體高2?3個數(shù)量級，可產(chǎn)生大量DNA及抗體蛋白；既可以表達可溶性Fab又可表達附著性Fab;在抗體庫擴增時，融合蛋白滲漏表達水平低，毒性小。但是，此類載體需要有輔助噬菌體來產(chǎn)生單鏈基因，并組裝成有感染力的噬菌粒。3-2核糖體展示核糖體展示技術的核心是利用體外核糖體表達載體構建ScFv抗體庫，并于體外轉(zhuǎn)錄為mRNA,體外翻譯表達，隨后以固相化的抗原分子親和篩選出核糖體mRNA2ScFv復合物中的高親和力ScFv。這種技術在試驗中不用任何細胞，是第一個完全在體外篩選有功能蛋白的方法。該技術克服了其它一些蛋白質(zhì)篩選技術,如噬菌體展示需轉(zhuǎn)化細菌或真核細胞，因效率不高而降低庫容，減少抗體多樣性的局限，并避免了宿主隨細胞基因組復制過程中可能丟失產(chǎn)生的庫容下降，同時亦解決了因抗體篩選條件不利于宿主細胞生存而導致抗體丟失這一難題。由于核糖體展示技術的體外翻譯、體外篩選的特點，大大縮短了試驗周期，具有省時、省力、方便、快速的特點。1997年Plukthun實驗室Hanes等的多聚核糖體展示技術(polyribosomedisplay)進行改進建立了核糖體展示技術,可在體外篩選或改造功能蛋白(如抗體)。首先構建核糖體展示的DNA模板,然后依次體外轉(zhuǎn)錄、體外翻譯和親和篩選，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA不含任何終止密碼子，在體外翻譯過程中核糖體會停留在mRNA的3'2末端;在體外翻譯和親和篩選是保證核糖體不會從mRNA上解離，使篩選蛋白的基因型和表型以mRNA2核糖體2蛋白復合物的形式偶聯(lián)在一起。經(jīng)過每輪展示，篩選蛋白一般能夠被富集100?1000倍。整個過程完全在體外進行，不經(jīng)轉(zhuǎn)化，可以進行大容量庫(>1011)的構建和篩選，可以方便地引入突變，調(diào)整篩選條件和選擇壓力，因此可以篩選到高親和力的蛋白分子及進行其。定向進化的研究。1997年Roberts和Szostak與Nemoto分別獨立設計了另外一種與核糖體展示類似方法，稱為mRNA展示技術或RNA2多肽融合技術(RNA2peptidefusion)或體外病毒技術。這個展示系統(tǒng)是利用嘌吟霉素分子將mRNA分子和其所編碼的多肽共價結合起來。嘌吟霉素與單鏈DNA連接物的3’端連接，然后這個DNA連接物再與文庫編碼的mRNA3'端連結。當mRNA在體外翻譯時，核糖體到達mRNA和DNA的結合點并穩(wěn)定下來,嘌吟霉素進入核糖體氨酰化位點,并在氨酰轉(zhuǎn)移酶的作用下與所編碼的多肽偶聯(lián)。mRNA2DNA2嘌吟霉素分子文庫可在體外翻譯，然后用固相化的靶分子將純化的RNA2多肽復合物淘選出來，像核糖體展示系統(tǒng)那樣，這個復合物可通過RT2PCR得到進一步的擴增。其它體外篩選技術還有1998年Arnold等，1999年Forrer等建立的體外篩選酶活性技術(selectionforenzymaticactivityinvitrcl);1999年Doi和Yana2gawa建立的STABLE技術在油包水乳劑中模擬活細胞區(qū)域化進行翻譯和篩選；以及Actinova公司的共價展示技術(covaeentdisplay)等。4基因工程抗體的應用前景基因工程抗體的發(fā)展已使抗體制備技術進入了一個全新的時代，此項技術已廣泛深入到生物醫(yī)學中的許多領域，尤其是噬菌體抗體庫技術的建立，使得不經(jīng)過免疫、利用抗原直接從庫中篩選特異性抗體成為可能,使抗體的制備變得簡單易行，穩(wěn)定有效,使人源抗體的制備有了突破,這是抗體工程領域的重大進展。這極大地推動了各種性能優(yōu)良抗體及多功能抗體融合蛋白的開發(fā)和應用，而且在蛋白質(zhì)純化工程中也有廣闊的應用前景。隨著分子生物學、分子免疫學的發(fā)展及噬菌體抗體庫技術的成熟，人們可以根據(jù)需要改造和制備各種人和動物用抗體?？梢灶A見,一個隨意定向地制造抗體的時代即將到來。全人源抗體的研究在近30年中得到了極大的發(fā)展，目前全球已有500余種診斷和治療用的單克隆抗體投放市場，100多種用于臨床研究。全人源抗體在醫(yī)學領域的許多方面都極具應用潛力，如病毒感染、腫瘤、自身免疫性疾病、同種異體移植物注射、哮喘、中風等疾病治療，尤其在診斷和治療腫瘤疾病及抗感染方面優(yōu)勢明顯。但是全人源抗體的研究仍有許多問題等待解決，如抗體親和力的成熟、全人源雜交瘤細胞分泌抗體的穩(wěn)定性、抗體的大規(guī)模生產(chǎn)等。隨著制備技術的完善和成熟，全人源抗體必將成為當今以及未來生命科學及生物技術的研究熱點和產(chǎn)業(yè)化增長點。基因工程抗體的發(fā)展已使抗體制備技術進入了一個全新的時代，此項技術已廣泛深入到生物醫(yī)學中的許多領域，不僅可用于戒毒、血液性疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病、器官移植、腫瘤、中毒性疾病、變態(tài)反應性疾病等方面的診療,而且在蛋白質(zhì)純化工程中也有廣闊的應用前景。隨著分子生物學和免疫學技術的不斷發(fā)展,基因工程抗體勢必將會對人類的生產(chǎn)、生活起到更大的促進作用。參考文獻:【1】TodorovskaA,RooversRC,DolezalO,etal.Designandapplicationofdiabodies,triabodiesandtetrabodiesforcancertargeting[J].JImmunolMethods,2001,1(2):47266.【2】Koelemijr,KuppenPJK,VandeveldeCJH,etal.Bispecificantibodiesrecruitingmyeloideffectorcellsfortumortherapy[J].CriticalReviewsinOncology/Hematalogy,2001,38:47261.【3】GirandA,AtamanOY,BattailN,etal.Generationofmono2clonalantibodiestomativehumanimminodeficiencyvirustypeIenvelopeglycoprteinbyimmunizationofmicewithnakedRNA[J].JVirolMethodes,1999,79(1):75284.【4】DengXK,NesbitLA,MorrowKJ,etal.Recombinantsingle-chainvariablefragmentantibodiesdirectedagainstClostridiumdifficiletoxin