生物分離工程第二章

第二章細胞分離與破碎1總體學(xué)習(xí)目的和要求

通過本章學(xué)習(xí)，要求掌握細胞分離和目標產(chǎn)物釋放的原理和方法，熟知各種方法的優(yōu)缺點和應(yīng)用范圍。

2收集含生化物質(zhì)的液相，分離除去固體懸浮物（細胞、菌體、細胞碎片、蛋白質(zhì)的沉淀物和它們的絮凝體等）。收集胞內(nèi)產(chǎn)物的細胞或菌體，分離除去液相。固液分離的目的32.1細胞分離

重力沉降

離心沉降

過濾

4重力沉降重力沉降是化工過程中常用的氣固、液固和液液分離手段，在生化分離過程中亦有一定程度的應(yīng)用。5以液固沉降為例，重力沉降過程中固體顆粒受到重力、浮力和摩擦阻力的作用?？紤]球形的固體顆粒，則當浮力、摩擦阻力和重力達到平衡時，固體顆粒勻速沉降，沉降速度為

上式為球形粒子的Stokes沉降速度，、、和分別表示粒徑、固體顆粒密度、液體密度和重力加速度，為重力沉降速度，為液體粘度。6

菌體和動植物細胞的重力沉降雖然簡便易行，但菌體細胞體積很小，沉降速度很慢。因此，實用上需使菌體細胞聚并成較大凝聚體顆粒后進行沉降操作，提高沉降速度。7提高重力沉降的途徑加入中性鹽：雙電層排斥電位降低加入高分子絮凝劑：架橋作用形成大絮凝團引入外力8離心沉降是利用沉降設(shè)備使流體和顆粒旋轉(zhuǎn)，在離心力的作用下，由于顆粒和流體間存在密度差，所以顆粒沿徑向與流體產(chǎn)生相對運動，從而使顆粒和流體分離。離心沉降

9應(yīng)用1878年瑞典牛奶——奶油1896年用于回收酵母離心分離技術(shù)在生工方面主要用于：分離DNA、大分子、菌體、動植物細胞、胞內(nèi)產(chǎn)物。 10離心沉降速度

離心設(shè)備的一個重要技術(shù)指標是其所能達到的離心力與重力的比值，稱為分離因數(shù)。分離因數(shù)是衡量離心程度的參數(shù)，用Z表示式中，r為離心半徑，即從旋轉(zhuǎn)軸心到沉降顆粒的距離，N為離心機的轉(zhuǎn)數(shù)(s-1)。11離心沉降和重力沉降只是對沉降的作用力不同，因此，將式(1)中的g用Zg代替，可得離心沉降速度Vs為或12即：13提高離心沉降速度的主要措施d－顆粒直徑；ρS－固體顆粒密度；ρL－液體介質(zhì)密度；μL－液體介質(zhì)粘度；ω－旋轉(zhuǎn)角速度；r－轉(zhuǎn)軸中心到顆粒中心距離增大dp增大ρS提高離心機轉(zhuǎn)數(shù)N提高離心半徑r降低液體粘度14離心分離法差速離心區(qū)帶離心15差速離心分級差速離心(Differentialcentrifugation)是生化工業(yè)中最常用的離心分離方法。以菌體細胞的收集或除去為目的的固液離心分離是分級離心操作的一種特殊情況，即為一級分級分離。操作中，根據(jù)實際物料的特點(目標產(chǎn)物和其他組分的性質(zhì)和相互作用等)、分離的目的和所需分離的程度，選擇適當?shù)牟僮鳁l件(離心轉(zhuǎn)數(shù)和時間)，可使料液中的不同組分得到分級分離。

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差速離心1718主要菌體和細胞的離心分離19區(qū)帶離心

區(qū)帶離心(Zonalcentrifugation)是生化研究中的重要分離手段，根據(jù)離心操作條件不同，分為差速區(qū)帶離心(Ratezonaldensitygradientsedimentation)平衡區(qū)帶離心(Isopycnicdensitygradientsedimentation)20梯度

離心2122兩種區(qū)帶離心法均事先在離心管中用某種低分子溶質(zhì)(如蔗糖、甘油等溶液)調(diào)配好密度梯度，在密度梯度之上加待處理的料液后進行離心操作。區(qū)帶離心的密度梯度一般可用蔗糖配制。事先調(diào)配不同濃度(密度)的蔗糖溶液，然后在離心管中依濃度從大到小層層加入即可。將一定濃度的蔗糖溶液經(jīng)一定時間的高速離心后可制成連續(xù)的蔗糖密度梯度。區(qū)帶離心法可用于蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的分離純化，但處理量小，一般僅限于實驗室水平。

23密度梯度離心（densitygradient）

生物大分子及顆粒的沉降不僅決定于它的大小，而且也取決于它的密度。顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時，質(zhì)量和密度大的顆粒沉降的快，并且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時，即停止不前，最后各自在離心管中被分離成獨立的區(qū)帶。分成區(qū)帶的樣品可以在管底刺一個小孔逐滴放出，分步收集。常用的介質(zhì)有蔗糖、氯化銫等。滴加樣品蔗糖濃度離心管蔗糖密度梯度24密度梯度沉降平衡法在核酸研究中的應(yīng)用1、核酸密度的測定=o+4.2

2(2-02)10-102、測定DNA中G-C之含量

Rolfe-Meselson公式：=0.100xG-C+1.6583、溶液中核酸構(gòu)象的研究：單鏈DNA雙鏈DNA蛋白質(zhì)雙鏈DNARNA4、核酸的制備

氯化銫密度梯度超離心經(jīng)染料-氯化銫密度梯度超離心后，質(zhì)粒DNA及各種雜質(zhì)的分布超螺旋DNA閉環(huán)質(zhì)粒DNA開環(huán)質(zhì)及線型DNA蛋白質(zhì)石蠟油25*差速和平衡區(qū)帶離心異同區(qū)帶離心種類差速區(qū)帶離心平衡區(qū)帶離心共同點事先在離心管內(nèi)用低分子量溶質(zhì)調(diào)配好密度梯度梯度介質(zhì)常用蔗糖常用氯化銫密度梯度最大的密度梯度低于最大密度的沉降樣品最大的密度梯度大于最大密度的沉降樣品區(qū)帶形成條件根據(jù)各個組分沉降系數(shù)的差別，形成各自的區(qū)帶根據(jù)各組分密度差形成區(qū)帶離心條件在最前的沉降物質(zhì)達到管底前停止，短時間，低速度使各組分沉降到其平衡的密度區(qū)，長時間，高速度

26離心分離設(shè)備離心機是生化實驗室及生化工業(yè)廣泛使用的分離設(shè)備。實驗室用離心機以離心管式轉(zhuǎn)子離心機為主，離心操作為間歇式。工業(yè)離心分離設(shè)備中，較為常用的有管式和碟片式兩大類。27管式離心機碟片式離心機各種轉(zhuǎn)子區(qū)帶轉(zhuǎn)子分析轉(zhuǎn)子28管式離心機碟片式離心機29離心機的選用原則顆粒的大小、形狀及硬度原料液的組成、密度及粘度產(chǎn)物熱敏性30過濾

過濾速度過濾設(shè)備

31過濾

過濾操作是借助于過濾介質(zhì)，在一定的壓力差ΔP作用下，使懸浮液中的液體通過介質(zhì)的孔道，而固體顆粒被截留在介質(zhì)上，從而實現(xiàn)固液分離的單元操作。

過濾介質(zhì)

:過濾采用的多孔物質(zhì)。織物狀介質(zhì)，棉花、石棉、蠶絲、麻、羊毛及各種人造纖維與金屬絲等多孔陶瓷介質(zhì)，此為特殊的介質(zhì)，低溫?zé)?，具有大量微細孔道的濾管或濾板（其他多孔材料，PE等）膜分離介質(zhì)，微濾分離等32（1）過濾推動力：懸浮液自身壓強差、重力懸浮液的—外加壓力過濾介質(zhì)的—抽真空離心力（2）過濾阻力：介質(zhì)阻力濾餅阻力大多情況下，過濾阻力主要取決于濾餅阻力。33（3）過濾速率Rm表示介質(zhì)的阻力；Rc表示濾餅的阻力；μL為濾液的粘度34（4）過濾速度的強化a．降低濾餅阻力如絮凝劑、凝固劑助濾劑等。b．降低濾液黏度μ

黏度愈低，過濾阻力愈小。加熱、去雜蛋白、絮凝、調(diào)pH、選擇合適的放罐時間。c．降低懸浮液中懸浮固體的濃度過濾速度與獲得濾餅體積成反比。因此應(yīng)盡可能降低培養(yǎng)基配料濃度（如玉米粉、豆餅粉的濃度）。d.對發(fā)酵液進行預(yù)處理，改善濾液性質(zhì)。35過濾設(shè)備

內(nèi)裝微孔濾膜

進液口出液口微孔濾膜濾器3637生化分離中，工業(yè)規(guī)模過濾設(shè)備主要有加壓葉濾機、板框過濾機、旋轉(zhuǎn)真空過濾機。38板框壓濾機plateandframefilter

板框壓濾機的過濾推動力來自泵產(chǎn)生的液壓或進料貯槽中的氣壓。廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)基制備的過濾及霉菌、放線菌、酵母菌和細菌等多種發(fā)酵液的固液分離。適合于固體含量1-10%的懸浮液的分離。

392.2細胞破碎理解：各種細胞破碎方法、原理、優(yōu)缺點及其適用范圍。應(yīng)用：采用不同的細胞破碎方法對細胞進行不同程度的破碎。40一、概述大多數(shù)情況下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目標產(chǎn)物存在于發(fā)酵液中。有些目標產(chǎn)物存在于生物體中。尤其是由基因工程菌產(chǎn)生的大多數(shù)蛋白質(zhì)是在細胞內(nèi)沉積。脂類物質(zhì)和一些有用酶包含在生物體中。41**細胞破碎（cellrupture）技術(shù)是指利用外力破壞細胞膜和細胞壁，使細胞內(nèi)物質(zhì)包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù)。細胞破碎技術(shù)是分離純化細胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)（產(chǎn)品）的基礎(chǔ)。為了研究細胞破碎，提高其破碎率，有必要了解各種生物細胞壁的組成和結(jié)構(gòu)。42二、常見細胞壁的結(jié)構(gòu)細菌酵母霉菌葡聚糖糖蛋白蛋白質(zhì)幾丁質(zhì)43三、細胞破碎技術(shù)壓縮/撞擊作用剪切作用撞擊法44機械破碎搗碎法研磨法勻漿法超聲法物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法化學(xué)破碎有機溶劑表面活性劑酸堿酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過機械運動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細胞破碎。通過各種物理因素的作用，使組織、細胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細胞破碎。通過各種化學(xué)試劑對細胞膜的作用，而使細胞破碎通過細胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達到細胞破碎四、細胞破碎方法及其原理45（一）機械法機械破碎法又可分為高壓勻漿破碎法（homogenization）高速珠磨破碎法（beadgrinding）超聲波破碎法（ultrasonication）461高壓勻漿法高壓勻漿又稱高壓剪切破碎。高壓勻漿器的破碎原理是：細胞懸浮液在高壓作用下從閥座與閥桿之間的環(huán)隙高速(可達到450m/s)噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細胞在受到高速撞擊作用后，急劇釋放到低壓環(huán)境，從而在撞擊力和剪切力等綜合作用下破碎。高壓勻漿器的操作壓力通常為50-70MPa。

474849高壓勻漿法中影響細胞破碎的因素主要有壓力、循環(huán)操作次數(shù)和溫度。細胞破碎率S與操作壓力P和循環(huán)操作次數(shù)N之間的關(guān)系可表達為細胞破碎率用胞內(nèi)產(chǎn)物釋放率表示,是單位質(zhì)量細胞的產(chǎn)物釋放量，mg/cell

50式中：S—破碎率，為N次循環(huán)后，蛋白質(zhì)的釋放量R與最大釋放量Rmax之比；k－與溫度有關(guān)的速度常數(shù)；P－操作壓力，MPa；ɑ、b－與微生物種類和培養(yǎng)條件有關(guān)的常數(shù)。51高壓勻漿法適用于酵母和大多數(shù)細菌細胞的破碎，料液細胞濃度可達到20％左右。團狀和系狀菌易造成高壓勻漿器堵塞，一般不宜使用高壓勻漿法。高壓勻漿操作的溫度上升約2～3℃／10MPa，為保護目標產(chǎn)物的生物活性，需對料液作冷卻處理，多級破碎操作中需在級間設(shè)置冷卻裝置。因為料液通過勻漿器的時間很短，通過勻漿器后迅速冷卻，可有效防止溫度上升，保護產(chǎn)物活性。

522珠磨法beadmill珠磨是常用的方法細胞懸浮液與極細的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于1mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細胞之間的互相剪切、碰撞，使細胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在工業(yè)規(guī)模的破碎中，常采用高速珠磨機WSK臥式高效全能珠磨機53（1）高速珠磨機工作原理磨室內(nèi)放置玻璃小珠，裝在同心軸上的圓盤攪拌器高速旋轉(zhuǎn)，使細胞懸浮液和玻璃小珠相互攪動；細胞破碎是由剪切力層之間的碰撞和磨料滾動引起在出口處，旋轉(zhuǎn)圓盤和出口平板之間的狹縫很小，可阻擋玻璃小珠，使不被料液帶出。由于操作過程中會產(chǎn)生熱量，故磨室還裝有冷卻夾套，以冷卻細胞懸浮液和玻璃小珠。54

珠磨法破碎操作時，產(chǎn)生大量的熱能。但有效能量利用率僅為1％左右。在設(shè)計操作時應(yīng)充分考慮換熱能力問題。珠磨法適用于絕大多數(shù)微生物細胞的破碎，但與高壓均質(zhì)法相比，影響破碎率的操作參數(shù)很多，操作過程的優(yōu)化設(shè)計較復(fù)雜。55珠磨法(Beadmilling)破碎細胞可采用間歇或連續(xù)操作。兩種情況下細胞的破碎動力學(xué)均可近似表示

其中k為破碎速率常數(shù)

t在間歇操作時為破碎操作時間，連續(xù)操作時為細胞懸浮液在破碎室內(nèi)的平均停留時間

56式中：S—破碎率；k—破碎速率常數(shù)；k與攪拌轉(zhuǎn)速、細胞懸浮液濃度和循環(huán)速度、玻璃小珠裝量和珠體直徑，以及溫度等相關(guān)。57

噴霧撞擊法細胞是彈性體，比一般的剛性固體例子難于破碎。將細胞冷凍使其成為剛性球體，降低破碎的難度。噴霧撞擊破碎正是基于這樣的原理。如下圖，細胞懸浮液以噴霧狀高速凍結(jié)（凍結(jié)速度為每分鐘數(shù)千℃

），形成粒徑小于50微米的微粒子。高速載氣(如N2，流速為300m/s)將凍結(jié)的微粒子送入破碎室，高速撞擊撞擊板，使凍結(jié)的細胞發(fā)生破碎。噴霧撞擊破碎的結(jié)構(gòu)58與珠磨法和高壓均質(zhì)法相比，本方法中，細胞破碎僅發(fā)生在與撞擊板撞擊的瞬間，細胞破碎程度均勻，可避免細胞反復(fù)受力發(fā)生過度破碎的現(xiàn)象細胞破碎程度可通過無級調(diào)節(jié)載氣壓力（流速）控制，避免細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞，適用于細胞器（線粒體、葉綠體等）的回收。噴霧撞擊破碎適用于大多數(shù)微生物細胞和植物細胞的破碎，通常處理細胞懸浮液質(zhì)量濃度為100－200g/L。實驗室規(guī)模的撞擊破碎器間歇處理能力約50－500mL，而工業(yè)規(guī)模的連續(xù)處理能力在10L/h以上。59針對目標產(chǎn)物的性質(zhì)（如相對分子質(zhì)量、分子形態(tài)、穩(wěn)定性等），選擇合適的細胞破碎法，并確定適宜的破碎操作條件是非常重要的。如核酸相對分子質(zhì)量很大，破碎中易受剪切損傷。利用高壓均質(zhì)、珠磨、超聲波和噴霧破碎等數(shù)種機械破碎器破碎大腸桿菌，提取質(zhì)粒DNA的研究表明，只有珠磨法的完整質(zhì)粒收率在90％以上，而其他方法的收率低于50％。60超聲波破碎

超聲波破碎法(Ultrasonication)利用發(fā)射15—25kHz的超聲波探頭處理細胞懸浮液。超聲波破碎的機理是：在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用(cavitation)，空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細胞破碎。超聲波的細胞破碎效率與細胞種類、濃度和超聲波的聲頻、聲能有關(guān)。

61JY92-IID超聲波細胞破碎機62超聲波破碎的適用范圍超聲波破碎適用于多數(shù)微生物的破碎。一般桿菌比球菌易破碎，G-細菌比G+細菌易破碎，對酵母菌的效果較差。但超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團能使某些敏感性活性物質(zhì)失活。超聲波破碎的有效能量利用率極低。由于對冷卻的要求相當苛刻，所以不易放大，但在實驗室小規(guī)模細胞破碎中常用。63技術(shù)原理效果成本破碎率舉例高壓勻漿法(孔型)須使細胞通過小孔，使細胞受到剪切力而破碎劇烈適中<50%細胞懸浮液大規(guī)模處理珠磨破碎法細胞被玻璃珠或鐵珠剪切碰撞劇烈便宜90%細胞懸浮液和植物細胞的大規(guī)模處理超聲波法用超聲波的空穴作用使細胞破碎適中昂貴<50%細胞懸浮液小規(guī)模處理不同機械破碎方法的比較64（二）化學(xué)和生物化學(xué)滲透酸、堿處理化學(xué)試劑處理酶溶651、酸堿處理

蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)，改變pH可改變其荷電性質(zhì)，使蛋白質(zhì)之間或蛋白質(zhì)與其他物質(zhì)之間的相互作用力降低而易于溶解。因此，利用酸堿調(diào)節(jié)pH值，可提高目標產(chǎn)物溶解度。662、化學(xué)試劑處理

用表面活性劑(如十二烷基硫酸鈉，TritonX—100等)、螯合劑(如乙二胺四乙酸，簡稱EDTA)、鹽(改變離子強度)或有機溶劑(苯、甲苯等)處理細胞，可增大細胞壁通透性。脲(urea)和鹽酸胍(guanidineHCl)等變性劑(chaotropicagent)能破壞氫鍵作用，降低胞內(nèi)產(chǎn)物之間的相互作用，使之容易釋放。

673、酶溶

酶溶法(Enzymaticlysis)利用溶解細胞壁的酶處理菌體細胞，使細胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細胞膜，進一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性。

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外加酶法常用的溶酶溶菌酶蝸牛酶葡聚糖酶蛋白酶纖維素酶糖苷酶肽鍵內(nèi)切酶殼多糖酶69酶解法的優(yōu)缺點優(yōu)點：發(fā)生酶解的條件溫和。能選擇性地釋放產(chǎn)物。胞內(nèi)核酸等泄出量少，細胞外形較完整。與機械法結(jié)合大大提高破碎率。缺點：溶解酶價格高。溶酶法通用性差（不同菌種需選擇不同的酶)。

70溶菌酶(lysozyme)適用于革蘭氏陽性菌細胞壁的分解，應(yīng)用于革蘭氏陰性菌時，需輔以EDTA使之更有效地作用于細胞壁；酵母細胞的酶溶需用Zymolyase(幾種細菌酶的混合物)、β-1,6—葡聚糖酶(β-1，6-dextranase)或甘露糖酶(mannanase)；破壞植物細胞壁需用纖維素酶(cellulase)。

71化學(xué)滲透法比機械破碎速度低，效率差，并且化學(xué)或生化試劑的添加形成新的污染，給進一步的分離純化增添麻煩。但是，化學(xué)滲透法比機械破碎的選擇性高，胞內(nèi)產(chǎn)物的總釋放率低，特別是可有效地抑制核酸的釋放，料液粘度小，有利于后處理過程。72（三）物理滲透法

滲透壓沖擊法凍結(jié)—融化法73