小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型中脛骨軟骨下骨微結(jié)構(gòu)的Micro-CT分析

小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型中脛骨軟骨下骨微結(jié)構(gòu)的Micro-CT分析吉喆;黨曉謙;王坤正;周虹CT(Micro-CT)技術(shù)觀察和分析小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型中軟骨下骨微結(jié)構(gòu)的變化,為進(jìn)一步了解軟骨下骨在骨關(guān)節(jié)炎疾病發(fā)展中的作用提供一定128Micro-CT儀器中進(jìn)行掃描,應(yīng)用三維重建處理和分析軟件對內(nèi)側(cè)脛骨平臺軟骨下骨全部及其1/3(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)和組織骨密度(TMD)進(jìn)行檢測,并行膝關(guān)節(jié)的病,DMMMicro-CTTb.Th1/3BV/TV1/3BV/TV、Tb.ThTMD1/3Tb.Th1/3Tb.Sp1/3Tb.NTb.Sp1/3BV/TVTb.NDMMMicro-CT【期刊名稱】《西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）》【年(卷),期】2015(036)005【總頁數(shù)】6頁(P623-627,654)【關(guān)鍵詞】Micro-CT;骨關(guān)節(jié)炎;軟骨下骨;骨微結(jié)構(gòu)【作者】吉喆;黨曉謙;王坤正;周虹【作者單位】西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院骨科,陜西西安710004;西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院骨科,陜西西安710004;西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院骨科,陜西西安710004;悉尼大學(xué)ANZAC研究所,澳大利亞悉尼2139【正文語種】中文【中圖分類】R684.3骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，并常有軟骨、軟骨下骨、滑膜、半月板、韌帶、肌腱及關(guān)節(jié)表面肌肉受累［1］OA多數(shù)表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)的退行病變，臨床上患者長期受關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、僵硬及活動OA程中，不僅僅存在著軟骨的損傷和修復(fù)［2］，同時(shí)，也存在關(guān)節(jié)軟骨下骨的結(jié)構(gòu)和功能改變［3-5］。雖然目前尚缺乏足夠的證據(jù)證明軟骨下骨的病變是OA疾病發(fā)生的啟動因素，但大量的研究不僅證實(shí)了軟骨下骨的改變是OA疾病發(fā)生發(fā)展的重要方面，而且軟骨下骨微結(jié)構(gòu)與生物力學(xué)的改變也可以促使軟骨的退變［5-7］。因此，對軟骨下骨微結(jié)構(gòu)的研究可以更深層次地認(rèn)識軟骨下骨在OA疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用。學(xué)模型，計(jì)算得到骨的各項(xiàng)指標(biāo)［8］X（computedtomography，CT）Micro-CT重建和骨組織各項(xiàng)參數(shù)的定量分析等［9-11］。由于其在骨組織分析中的這些優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)在骨科研究中的應(yīng)用具有許多不可替代的優(yōu)勢［9-10，12］。本研究Micro-CTOA分析，為進(jìn)一步研究OA疾病的發(fā)展提供更多的理論依據(jù)。51250～60。實(shí)驗(yàn)動物由悉尼大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。小鼠飼養(yǎng)在恒溫（21～22℃）SPE（specificpathogenfree）12h（消毒自來水）9∶00～12∶00。實(shí)驗(yàn)中對動物的處置符合《澳大利亞關(guān)于善待和使用實(shí)驗(yàn)動物的科學(xué)研究準(zhǔn)則》以及中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》的相關(guān)要求。SkyScan1172Micro-CTCTVoxV3.0、DataViewerV1.5.1、CTAnalyserV1.14.426只，即內(nèi)側(cè)半月板-脛骨韌帶切斷術(shù)組（DMM）和對照組（假手術(shù)組）。DMM75g/L10g/L鹽酸甲苯噻嗪的生理鹽水腹腔注射進(jìn)行麻醉，仰臥固定，右下肢膝關(guān)節(jié)及周圍備皮、消毒、鋪無菌手術(shù)巾，于解剖顯微鏡下行右膝關(guān)節(jié)髕骨內(nèi)側(cè)切口，將髕骨翻向外側(cè)，顯露內(nèi)側(cè)半月板-脛骨韌帶（圖1），鏡下切斷此韌帶，避免損傷關(guān)節(jié)軟骨，通過內(nèi)側(cè)半月板的被動移位來確認(rèn)韌帶的完全橫斷［12-13］。復(fù)位髕骨，縫合關(guān)節(jié)囊及皮膚。對照組小鼠給予假手術(shù)處理，即顯微鏡下行右膝關(guān)節(jié)髕骨內(nèi)側(cè)表淺皮膚切開后立即關(guān)閉切口。術(shù)后實(shí)驗(yàn)動物分組分籠飼養(yǎng)，不限制其自由活動。術(shù)后8周進(jìn)行以下檢測。Micro-CT8（包括全膝關(guān)節(jié)及鄰近股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端），40g/L48h。制備好的全膝Micro-CT59kV167μA16bit295ms，9.18μm，5001000×1000BMPDataViewerV1.5.1CTAnalyserV1.14.4組織分析軟件，對全膝關(guān)節(jié)的Micro-CT掃描圖片進(jìn)行三維圖像重建，選取2組小鼠重組圖像相同位置的軟骨下骨感興趣區(qū)域（regionofinterest，ROI）進(jìn)行定量分析。具體分析指標(biāo)如下：骨體積分?jǐn)?shù)（bonevolumefraction，BV/TV）以%表示；骨小梁厚度（trabecularthickness，Tb.Th）以像素值表示；骨小梁數(shù)量（trabecularnumber，Tb.N）以1/像素值表示；骨小梁分離度（trabecularseparation，Tb.Sp）以像素值表示；組織骨密度（tissuemineraldensity，TMD）以g/cm3表示。織切片后，進(jìn)行甲苯胺藍(lán)-固綠溶液組織學(xué)染色。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用SPSSV22.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行兩組間比較的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，所有數(shù)據(jù)均采用±s表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Micro-CTMicro-CT2DMM骨下骨微結(jié)構(gòu)變化（3）：DMM排列較為整齊有序。另外，可觀察到實(shí)驗(yàn)組內(nèi)側(cè)脛骨平臺軟骨下骨的外、中、內(nèi)3個(gè)亞區(qū)域微結(jié)構(gòu)變化也存在差異，即內(nèi)、中部亞區(qū)域骨小梁改變較明顯，外部亞區(qū)域則改變較小，故對小鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)脛骨平臺軟骨下骨進(jìn)行了分區(qū)域研究。軟骨下骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)變化BV/TVDMMBV/TV3均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即在外1/3亞區(qū)域，實(shí)驗(yàn)組為（75.49±1.02）%，顯著大于對照組的（69.64±1.85）%（P=0.0197）；1/3（79.44±0.76）%，顯著大于對照組的（73.56±1.39）%（P0.0041）；1/31.83）%，顯著小于對照組的（73.25±1.06）%（P=0.0058，圖4）。Tb.ThDMM1/3Tb.Th（20.71±0.49）%（P=0.0001）；在中1/3亞區(qū)域，實(shí)驗(yàn)組為（21.23±0.72）%，顯著大于對照組的（17.71±0.57）%（P=0.0032）；在內(nèi)1/3亞區(qū)域，實(shí)驗(yàn)組為（21.57±0.76）%，顯著大于對照組的（18.78±0.62）%（P=0.0173，圖4）。Tb.NDMM1/3Tb.N均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即在全部亞區(qū)域，實(shí)驗(yàn)組為（0.029±0.001）%，顯著小于對照組的（0.035±0.001）%（P=0.0005）；1/3（0.038±0.001）%，顯著小于對照組的（0.042±0.001）%（P=0.0285）；在內(nèi)1/3亞區(qū)域，實(shí)驗(yàn)組為（0.031±0.001）%，顯著小于對照組的（0.039±0.001）%（P=0.0002，圖4）。Tb.SpDMM1/3Tb.Sp1/3（10.87±0.84）%，顯著小于對照組的（14.31±0.72）%（P=0.0110）；1/384）TMDDMMTMD1/3TMD1/30.012）%（P=0.0052）；在中1/3亞區(qū)域，實(shí)驗(yàn)組為（0.859±0.013）%，顯著大于對照組的（0.798±0.018）%（P=0.0217，圖4）。甲苯胺藍(lán)-固綠溶液組織學(xué)染色結(jié)果軟骨組織染為深紫藍(lán)色，骨組織染為淺青綠色；DMM（5）較對照組的形骨贅形成（5）。骨基質(zhì)礦化等多個(gè)方面［14］。Micro-CT通過XMicro-CTDMMOA目前有學(xué)者認(rèn)為，軟骨下骨結(jié)構(gòu)和功能改變可能是導(dǎo)致OA發(fā)病的重要因素之一［7，16-17］。GLASSON等［13］已經(jīng)證實(shí)了DMM誘導(dǎo)的小鼠是可靠的小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型，而且DMM術(shù)后8周的小鼠具有早中期骨關(guān)節(jié)炎病理變化的特征。而IIJIMA等［12］又發(fā)現(xiàn)，DMM誘導(dǎo)的大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型內(nèi)側(cè)脛骨平臺軟骨下骨在早期即有缺損且被纖維組織填充，并且內(nèi)側(cè)脛骨平臺表面軟骨也有不同區(qū)域的變化。本實(shí)驗(yàn)中DMM小鼠模型膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)脛骨平臺的軟骨下骨微結(jié)構(gòu)變化和組織學(xué)檢查與GLASSON等［13］實(shí)驗(yàn)的小鼠模型表型一致，如軟骨下骨骨小梁出現(xiàn)增寬、致密等表現(xiàn)并呈現(xiàn)“融合”現(xiàn)象，部分骨小梁排列紊亂不均勻，關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)邊緣處可見不同程度的橢圓形或圓形骨贅形成等。在本實(shí)驗(yàn)Micro-CT的宏觀成像圖（圖2）中，可以大致觀察到兩組小鼠內(nèi)側(cè)脛骨Micro-CTBV/TV反映骨組織體積所占總體積的比值，TMD指骨密度或骨礦物質(zhì)密度，反映骨BV/TVTMDOA軟骨下骨骨量和骨礦化水平在內(nèi)側(cè)脛骨平臺的外1/3和中1/3亞區(qū)域均明顯升高，1/3（或下降趨勢），但在全部亞區(qū)域均無明顯差異。這提示小鼠OA發(fā)展的早中期可能存在軟骨下骨局部鄰近亞區(qū)域之間的骨量轉(zhuǎn)移，使總骨量和礦化水平尚能維持不變，而這些變化與骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞之間的相互作用有關(guān)［18-19］。Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp分別指骨小梁的平均厚度、數(shù)量和稀疏程度；兩組間的這些數(shù)據(jù)顯示：OA小鼠各亞區(qū)域（除外1/3亞區(qū)域）的骨小梁平均厚度均明顯增寬；OA小鼠各亞區(qū)域（除外1/3亞區(qū)域）的Tb.N均明顯減少；OA1/31/3Tb.Th、Tb.NTb.SpOA1/31/3DMMOA（8）內(nèi)側(cè)脛DMMOA綜上所述，應(yīng)用Micro-CT技術(shù)對小鼠DMM骨關(guān)節(jié)炎模型的脛骨軟骨下骨多個(gè)OAOA究奠定實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)?！鞠嚓P(guān)文獻(xiàn)】［1］LOZITOTP，ALEXANDERPG，LINH，etal.Three-dimensionalosteochondralmicrotissuetomodelpathogenesisofosteoarthritis［J］.StemCellResTher，2013，4Suppl1：S6.［2］楊益民，王民，李萌.氨基胍對兔骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的影響［J］.學(xué)版，2008，29（3）：285-288.［3］ABRAMSONSB，ATTURM.Developmentsinthescientificunderstandingofosteoarthritis［J］.ArthritisResTher，2009，11（3）：227.［4］FELSONDT.Anupdateonthepathogenesisandepidemiologyofosteoarthritis［J］.RadiolClinNorthAm，2004，42（1）：1-9.［5］FELSONDT，NEOGIT.Osteoarthritis：isitadiseaseofcartilageorofbone？［J］.ArthritisRheum，2004，50（2）：341-344.［6］MANSELLJP，COLLINSC，BAILEYAJ.Bone，notcartilage，shouldbethemajorfocusinosteoarthritis［J］.NatClinPractRheumatol，2007，3（6）：306-307.［7］ZAMLIZ，ROBSONBK，TARLTONJF，etal.Subchondralboneplatethickeningprecedeschondrocyteapoptosisandcartilagedegradationinspontaneousanimalmodelsofosteoarthritis［J］.BiomedResInt，2014，2014：606870.［8］WANGX，ZAUELRR，RAODS，etal.Cancellousbonelamellaestronglyaffectmicrocrackpropagationandapparentmechanicalproperties：separationofpatientswithosteoporoticfracturefromnormalcontrolsusinga2Dnonlinearfiniteelementmethod（biomechanicalstereology）［J］.Bone，2008，42（6）：1184-1192.［9］GIELKENSPF，SCHORTINGHUISJ，DEJONGJR，etal.Acomparisonofmicro-CT，microradiographyandhistomorphometryinboneresearch［J］.ArchOralBiol，2008，53（6）：558-566.［10］BOUXSEINML，BOYDSK，CHRISTIANSENBA，etal.Guidelinesforassessmentofbonemicrostructureinrodentsusingmicrocomputedtomography［J］.JBoneMinerRes，2010，25（7）：1468-1486.［11］王佰亮，丁銘.Micro-CT技術(shù)在股骨頭微觀結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用［J］.中華骨科雜志，2010，30（2）：209-212.［12］IIJIMAH，AOYAMAT，ITOA，etal.Destabilizationofthemedialmeniscusleadstosubchondralbonedefectsandsite-specificcartilagedegenerationinanexperimentalratmodel［J］.OsteoarthrCartil，2014，22（7）：1036-1043.［13］GLASSONSS，BLANCHETTJ，MORRISEA.Thesurgicaldestabilizationofthemedialmeniscus（DMM）modelofosteoarthritisinthe129/SvEvmouse［J］.OsteoarthrCartil，2007，15（9）：1061-1069.［14］RUBINC，TURNERAS，MULLERR，etal.Quantityandqualityoftrabecularboneinthefemurareenhancedbyastronglyanabolic，noninvasivemechanicalinter