醫(yī)療器械生物相容性概述

醫(yī)療器械生物相容性概述第一頁，共六十五頁，2022年，8月28日相關(guān)概念生物相容性：生命體組織對非活性材料產(chǎn)生反應(yīng)的一種性能。醫(yī)療器械：制造者專門或主要設(shè)計成為下列目的應(yīng)用于人體的，不論是單獨(dú)使用還是組合使用的，包括使用所需軟件在內(nèi)的任何儀器、設(shè)備、器具、材料或者其他物品。預(yù)期用于人體的任何材料或器械的選擇與評價需遵循一定的評價程序。主要依據(jù)為：GB/T16886ISO10993在設(shè)計過程中，應(yīng)對衡量各種所選材料的優(yōu)缺點(diǎn)和試驗(yàn)程序進(jìn)行判斷并形成文件。為了保證最終產(chǎn)品安全有效地用于人體，這一程序應(yīng)包括生物學(xué)評價。第二頁，共六十五頁，2022年，8月28日標(biāo)準(zhǔn)分類醫(yī)療器材生物學(xué)評估架構(gòu)與原則第1部分：評價與試驗(yàn)

材料特性與實(shí)質(zhì)對等第7部分：環(huán)氧乙烷滅菌殘留量第9部分：潛在降解產(chǎn)物的定性和定量框架第13部分：聚合物醫(yī)療器械的降解產(chǎn)物的定性與定量第14部分：陶瓷降解產(chǎn)物的定性與定量第15部分：金屬與合金降解產(chǎn)物的定性與定量第17部分：可瀝濾物允許限量的建立第18部分：材料的化學(xué)特性第19部分：材料的物理化學(xué)、形態(tài)學(xué)和地形學(xué)特點(diǎn)第三頁，共六十五頁，2022年，8月28日標(biāo)準(zhǔn)分類具體實(shí)驗(yàn)第2部分：動物保護(hù)要求第3部分：遺傳毒性、致癌性和生殖毒性試驗(yàn)第4部分：與血液相互作用試驗(yàn)選擇第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)第6部分：植入后局部反應(yīng)試驗(yàn)第10部分：刺激與遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)第11部分：全身毒性試驗(yàn)第16部分：降解產(chǎn)物和可溶出物的毒代動力學(xué)研究設(shè)計第20部分：醫(yī)療器械免疫學(xué)毒性試驗(yàn)原則和方法第四頁，共六十五頁，2022年，8月28日開始是否直接或間接接觸？獲得材料的識別信息并應(yīng)考慮化學(xué)表征（ISO10993-18）材料是否與市場上器械所用材料相同？與人體接觸是否相同？是否有風(fēng)險評定所需充分的論證和/或臨床相關(guān)數(shù)據(jù)（化學(xué)和生物學(xué)）？這些數(shù)據(jù)是否與接觸記錄和途徑相關(guān)？進(jìn)行毒理學(xué)風(fēng)險評定（附錄B）根據(jù)材料的化學(xué)性質(zhì)和接觸類別和時間對器械進(jìn)一步評價生物學(xué)評價完成是否是是否否否GB/T16886.1不適用器械是否有相同的化學(xué)組成？制造和滅菌是否相同？生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的選擇（附錄A）試驗(yàn)和（或）豁免建議試驗(yàn)的論證是否材料中所有化學(xué)物的充分的毒理學(xué)數(shù)據(jù)？這些數(shù)據(jù)是否適用于化學(xué)混合物？是是是是是是是否否否否否醫(yī)療器械生物學(xué)評價流程第五頁，共六十五頁，2022年，8月28日生物學(xué)評價試驗(yàn)的選擇第六頁，共六十五頁，2022年，8月28日第3部分遺傳毒性、致癌性和生殖毒性試驗(yàn)遺傳毒性試驗(yàn)：采用哺乳動物或非哺乳動的細(xì)胞培養(yǎng)或其他技術(shù)，測定由器械、材料和/或其浸提液引起的基因突變、染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量的改變，以及DNA或基因的其他毒性。體外遺傳試驗(yàn)：細(xì)菌基因突變試驗(yàn)哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗(yàn)哺乳動物細(xì)胞誘裂性試驗(yàn)體內(nèi)遺傳試驗(yàn)嚙齒動物微核試驗(yàn)嚙齒動物骨髓中期分析哺乳動物肝細(xì)胞程序外DNA合成試驗(yàn)注意：所有體外試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，為避免對動物的過度使用，通常不再論證并不宜再進(jìn)行動物遺傳毒性試驗(yàn)。若全部體外試驗(yàn)的結(jié)果均為陽性，則應(yīng)進(jìn)行體內(nèi)誘變性試驗(yàn)，否則推定該化合物為誘變物。第七頁，共六十五頁，2022年，8月28日第3部分遺傳毒性、致癌性和生殖毒性試驗(yàn)細(xì)菌基因突變試驗(yàn)（AMES實(shí)驗(yàn)his-→his+

）鼠傷寒沙門氏菌的組氨酸營養(yǎng)缺陷型（his-）菌株，在含微量組氨酸的培養(yǎng)基中，除極少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)胞外，一般只能分裂幾次，形成在顯微鏡下才能見到的微菌落。受誘變劑作用后，大量細(xì)胞發(fā)生回復(fù)突變，自行合成組氨酸，發(fā)育成肉眼可見的菌落。某些化學(xué)物質(zhì)需經(jīng)代謝活化才有致變作用，在測試系統(tǒng)中加入哺乳動物微粒體酶（S9），可彌補(bǔ)體外試驗(yàn)缺乏代謝活化系統(tǒng)之不足。鑒于化學(xué)物質(zhì)的致突變作用與致癌作用之間密切相關(guān)，故此法現(xiàn)廣泛應(yīng)用于致癌物的篩選。第八頁，共六十五頁，2022年，8月28日AMES實(shí)驗(yàn)測試系統(tǒng)：細(xì)菌鼠傷寒沙門氏菌：組氨酸營養(yǎng)缺陷型埃希氏大腸桿菌：色氨酸營養(yǎng)缺陷型濃度設(shè)置：陰性對照組/溶劑對照組；陽性對照組；受試物至少五個劑量組；決定受試物最高劑量的標(biāo)準(zhǔn)是對細(xì)菌的毒性及其溶解度。對原料而言：一般最高劑量組可為5mg/皿。對產(chǎn)品而言：有殺菌作用，最高劑量可為最低抑菌濃度，無殺菌作用的受試物，最高劑量可為原液，最低劑量為0.1μg/皿。方法：平板摻入法（標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)法）預(yù)培養(yǎng)法（提高測試靈敏度）點(diǎn)試法（預(yù)試驗(yàn)）第九頁，共六十五頁，2022年，8月28日AMES實(shí)驗(yàn)-菌株特性鑒定菌株組/色氨酸突變?nèi)笔Э蓹z測的突變類型修復(fù)LPSVIT質(zhì)粒TA1535G46urvB-rfa-

bio----堿基置換TA1537C3076urvB-rfa-bio----移碼TA97D6610urvB-rfa-bio-pKM101移碼TA98D3052urvB-rfa-bio-pKM101移碼TA100G46urvB-rfa-bio-pKM101堿基置換TA102G428urvB+rfa-bio-pKM101堿基置換WP2uvrAtrypEuvrA---pKM101堿基置換組氨酸需求紫外線損傷修復(fù)缺陷脂多糖屏障丟失（rfa）R因子（抗氨芐青霉素、抗四環(huán)素）自發(fā)回變第十頁，共六十五頁，2022年，8月28日AMES實(shí)驗(yàn)平板摻入法預(yù)培養(yǎng)法第十一頁，共六十五頁，2022年，8月28日AMES實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察和判斷：摻入法：以直接計數(shù)培養(yǎng)基上長出回變菌落數(shù)的多少而定，如在背景生長良好條件下，受試回變菌落數(shù)增加一倍以上，并有劑量反應(yīng)關(guān)系或至少某一測試點(diǎn)有可重復(fù)的并有統(tǒng)計學(xué)意義的陽性反應(yīng)，即可認(rèn)為該受試物為誘變陽性。點(diǎn)試法的判定：如在受試物點(diǎn)樣紙片周圍長出較多密集的回變菌落與空白對照相比有明顯區(qū)別者，可初步判定該受試物為陽性，但應(yīng)該用摻入法試驗(yàn)來確證。第十二頁，共六十五頁，2022年，8月28日第3部分遺傳毒性、致癌性和生殖毒性試驗(yàn)哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗(yàn)（小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)MLAtk+

→tk-）MLA是以抗藥性的出現(xiàn)作為觀察突變指標(biāo),其小鼠淋巴瘤細(xì)胞株(L5178Ytk+/--3.7.2C)的tk基因產(chǎn)物為胸苷激酶(TK)。該酶催化胸苷的磷酸化反應(yīng),生成胸苷單磷酸(TMP),進(jìn)一步生成DNA復(fù)制所必須的胸苷三磷酸。如果存在三氟胸苷(TFT)等嘧啶類似物,則產(chǎn)生異常的TMP,而異常TMP的存在將導(dǎo)致細(xì)胞死亡。如在被檢物存在下,細(xì)胞對TFT發(fā)生抗藥性,則說明tk基因發(fā)生突變。試驗(yàn)細(xì)胞株的tk+/-基因位于11號常染色體上,為雜合子基因,這樣只需一側(cè)的tk+

→tk-即能對嘧啶類似物產(chǎn)生抗性。第十三頁，共六十五頁，2022年，8月28日小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（MLA）試驗(yàn)系統(tǒng)：小鼠淋巴瘤L5178YTK+/-細(xì)胞方法：軟瓊脂平皿法（softagarmethod）在美國使用較多。在平皿中生長的抗性突變細(xì)胞集落呈近似正態(tài)分布，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可計算克隆效率（cloningefficiency，CE）和突變率（mutationfrequency，MF）等指標(biāo)。微孔平板（microwellmethod）（即96孔培養(yǎng)板）法在歐洲使用較多。在微孔中生長的抗性突變細(xì)胞集落呈Poisson分布，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可計算接種效率（platingefficiency，PE）和突變率等指標(biāo)。優(yōu)點(diǎn)：既能檢測點(diǎn)突變，也能夠檢測出大的染色體損傷缺點(diǎn)：自發(fā)突變率高，需要定期清除自發(fā)突變。第十四頁，共六十五頁，2022年，8月28日CellsExpression(2d)Chemicaltreatment(3hor24h)PlatingforPE0PlatingforPE2PlatingforTFTrIncubation(12d)ColonycountingandcalculationIncubation(12d)小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（MLA）細(xì)胞集落形成率,即平板效率(PlatingEfficiency,PE)的相對存活率(RelativeSurvival,RS)作為細(xì)胞毒性指標(biāo)。第十五頁，共六十五頁，2022年，8月28日突變集落在TK基因突變試驗(yàn)中，經(jīng)過TFT選擇后長出的抗性細(xì)胞集落（即tk-/-突變體）可分為兩種類型，即大集落（λ集落）和小集落（σ集落）。微孔平板法：大集落≥微孔直徑的1/4

小集落＜微孔直徑的1/4軟瓊脂平皿法：大集落直徑≥0.6mm

小集落直徑＜0.6mm大集落呈彌散性生長，其密度低；小集落呈集中性生長，其密度高。一般認(rèn)為大、小集落突變體是由于基因損傷的范圍和程度不同所致。大集落突變體的基因損傷多僅局限于tk位點(diǎn)；而小集落突變體是由較大范圍的染色體改變（染色體斷裂、缺失、重組或分離異常等）所致。這是TK基因突變試驗(yàn)?zāi)軌驒z出基因突變和染色體畸變兩類終點(diǎn)，并能在一定程度上對二者加以區(qū)分的重要機(jī)理。小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（MLA）第十六頁，共六十五頁，2022年，8月28日試驗(yàn)結(jié)果的判定

各處理組的MF值呈濃度依賴性升高，判定為陽性；MF值≥陰性對照值+126，判定為陽性。（微孔法中的GEF=99+27=126）陽性對照參考值其一，陽性對照組總誘導(dǎo)率IMF至少≥300×10-6，其中小克隆IMF至少120×10-6其二，小克隆IMF至少≥150×10-6滿足上述標(biāo)準(zhǔn)之一，并且陽性對照相對總生長率（RTG）

≥10%結(jié)果評判小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（MLA）第十七頁，共六十五頁，2022年，8月28日第3部分遺傳毒性、致癌性和生殖毒性試驗(yàn)哺乳動物細(xì)胞誘裂性試驗(yàn)（體外哺乳動物細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)）在加入和不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下，使培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞暴露于受試物中。用中期分裂相阻斷劑（如秋水仙素或秋水仙胺）處理，使細(xì)胞停止在中期分裂相，隨后收獲細(xì)胞，制片，染色，分析染色體畸變。第十八頁，共六十五頁，2022年，8月28日體外哺乳動物細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)測試系統(tǒng)：中國地鼠卵巢（CHO）細(xì)胞株；中國地鼠肺（CHL）細(xì)胞株；人外周血淋巴細(xì)胞劑量設(shè)置陰性對照組/溶劑對照組；陽性對照組；受試物至少三個劑量組；最高濃度的選擇：決定最高濃度的因素是細(xì)胞毒性、受試物在試驗(yàn)系統(tǒng)中的溶解度以及pH或滲透分子濃度(osmolality)的改變。最高濃度應(yīng)能明顯降低細(xì)胞覆蓋程度、細(xì)胞計數(shù)或有絲分裂指數(shù)（均應(yīng)大于50%）。對于那些相對無細(xì)胞毒性的化合物，最高濃度應(yīng)是5μl/mL，5mg/mL或0.01mol/L。對于相對不溶解的物質(zhì)，當(dāng)濃度低于不溶解濃度時仍無毒性，則最高劑量應(yīng)是：當(dāng)處理期結(jié)束時，在最終培養(yǎng)液中溶解度限值以上的一個濃度。第十九頁，共六十五頁，2022年，8月28日體外哺乳動物細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)方法：細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)；受試物處理；加入秋水仙素，使細(xì)胞停止于分裂中期；收獲細(xì)胞，滴片空氣干燥，染色處理條件：包括代謝活化和非代謝活化條件在處理后6和24小時收獲細(xì)胞代謝活化條件下，受試物處理時間為3小時第二十頁，共六十五頁，2022年，8月28日體外哺乳動物細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)讀片分析：有絲分裂指數(shù)－毒性染色體結(jié)構(gòu)畸變?nèi)旧w數(shù)目畸變第二十一頁，共六十五頁，2022年，8月28日a.染色單體斷裂b.三輻射體

c.染色體斷片d.雙著絲點(diǎn)染色體e.環(huán)狀染色體

f.無著絲點(diǎn)斷片第二十二頁，共六十五頁，2022年，8月28日嚙齒動物微核試驗(yàn)微核試驗(yàn)是檢測染色體或有絲分裂器損傷的一種遺傳毒性試驗(yàn)方法。無著絲粒的染色體片段或因紡錘體受損而丟失的整個染色體，在細(xì)胞分裂后期仍留在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)成為微核。最常用的是嚙齒類動物骨髓嗜多染紅細(xì)胞(PCE)微核試驗(yàn)。以受試物處理嚙齒類動物，然后處死，取骨髓，制片、固定、染色，于顯微鏡下計數(shù)PCE中的微核。如果與對照組比較，處理組PCE微核率有統(tǒng)計學(xué)意義的增加，并有劑量-反應(yīng)關(guān)系，則可認(rèn)為該受試物是哺乳動物體細(xì)胞的致突變物。采用大鼠或小鼠（6～10周）分析骨髓中嗜多染紅細(xì)胞中的微核，嗜多染紅細(xì)胞是紅細(xì)胞成熟的一個階段，主核已排出，容易觀察微核第二十三頁，共六十五頁，2022年，8月28日微核是染色單體或染色體的無著絲粒斷片，或因紡錘體受損而丟失的整個染色體，在細(xì)胞分裂后期，仍然遺留在細(xì)胞質(zhì)中，末期之后，單獨(dú)形成一個或幾個規(guī)則的次核，被包含在子細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。第二十四頁，共六十五頁，2022年，8月28日劑量設(shè)置：陰性對照組/溶劑對照組；受試物至少三個劑量組；陽性對照組；試驗(yàn)方法給藥－臨床擬用途徑；預(yù)試驗(yàn)中測定時相點(diǎn)，確定正式試驗(yàn)的采樣時間；收集骨髓細(xì)胞，離心，涂片，干燥，固定，染色嚙齒動物微核試驗(yàn)第二十五頁，共六十五頁，2022年，8月28日讀片：嗜多染紅細(xì)胞呈灰藍(lán)色，成熟紅細(xì)胞呈淡桔紅色。微核大多數(shù)呈單個圓形，邊緣光滑整齊，嗜色性與核質(zhì)相一致，呈紫紅色或藍(lán)紫色。計數(shù)PCE/NCE（嗜多染紅細(xì)胞/成熟紅細(xì)胞）的比例－反映毒性計數(shù)含微核PCE的細(xì)胞百分率；嚙齒動物微核試驗(yàn)第二十六頁，共六十五頁，2022年，8月28日第3部分遺傳毒性、致癌性和生殖毒性試驗(yàn)嚙齒動物骨髓中期分析（哺乳動物骨髓染色體畸變試驗(yàn)）本試驗(yàn)是一項致突變性試驗(yàn)，檢測整體動物骨髓細(xì)胞染色體畸變，以評價受試物致突變的可能性。使哺乳動物（如大鼠或小鼠）經(jīng)口或其它適宜途徑染毒，動物處死前用細(xì)胞分裂中期阻斷劑處理，處死后制備骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本，分析染色體畸變。第二十七頁，共六十五頁，2022年，8月28日第3部分遺傳毒性、致癌性和生殖毒性試驗(yàn)哺乳動物肝細(xì)胞程序外DNA合成試驗(yàn)正常情況下，于細(xì)胞有絲分裂周期中，僅S期是DNA合成期。當(dāng)DNA受損傷時，損傷修復(fù)的DNA合成主要在其它細(xì)胞周期，稱程序外DNA合成，即UDS，因此發(fā)現(xiàn)UDS增高，即表明DNA發(fā)生過損。

在體外培養(yǎng)細(xì)胞中，用UDS的測量來顯示DNA修復(fù)合成的主要關(guān)鍵在于如何鑒別很高水平的半保留DNA復(fù)制和水平較低（充其量只有半保留DNA復(fù)制的5％）的UDS

。這可以用同步培養(yǎng)將細(xì)胞阻斷于G1期并用藥物（常用羥基脲）抑制殘留的半保留DNA復(fù)制后顯示。同步培養(yǎng)可用缺乏必需氨基酸精氨酸的培養(yǎng)基使DNA合成的始動受阻而使細(xì)胞同步于G1期。

在這些半保留DNA合成明顯抑制和阻斷了的細(xì)胞中，UDS即可用3H-胸腺嘧啶核苷的摻入增加顯示。它可用放射自顯影或液體閃爍計數(shù)法進(jìn)行測量。第二十八頁，共六十五頁，2022年，8月28日第3部分遺傳毒性、致癌性和生殖毒性試驗(yàn)致癌性：該試驗(yàn)是在試驗(yàn)動物的整個壽命期內(nèi)，一次或多次將器械、材料和/或其浸提液作用于試驗(yàn)動物，測定其潛在的致腫瘤性。在單項實(shí)驗(yàn)研究中，該試驗(yàn)還可檢驗(yàn)慢性毒性和致腫瘤性。只有在從其他方面獲取到提示性資料時才進(jìn)行致癌性試驗(yàn)，試驗(yàn)建議與接觸途徑和作用時間相適應(yīng)。方法選擇：OECD451致癌性研究OECD453慢性毒性、致癌性綜合研究第二十九頁，共六十五頁，2022年，8月28日第3部分遺傳毒性、致癌性和生殖毒性試驗(yàn)生殖與發(fā)育毒性：該試驗(yàn)評價器械、材料和/或其浸提液對生殖功能、胚胎發(fā)育（致畸性），以及對胎兒和嬰兒早期發(fā)育的潛在影響。只有在器械有可能影響應(yīng)用對象的生殖功能是才進(jìn)行生殖/發(fā)育毒性試驗(yàn)或生物測定。第三十頁，共六十五頁，2022年，8月28日生殖與發(fā)育毒性生殖毒性試驗(yàn)中，為方便實(shí)驗(yàn)一般可將一個完整生命周期過程分成以下幾個階段如下圖所示：各段試驗(yàn)研究階段如下：生育力與早期胚胎發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)（I段）：A-B胚胎—胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)（II段）：C-D圍產(chǎn)期毒性試驗(yàn)（III段）：C-F第三十一頁，共六十五頁，2022年，8月28日生殖與發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)動物：

首選嚙齒類動物為大鼠。在胚胎-胎仔發(fā)育毒性研究中，一般還需要采用第二種哺乳動物，家兔為優(yōu)先選用的非嚙齒類動物。劑量選擇：至少應(yīng)設(shè)三個劑量組，必要時可增加劑量組。

高劑量：應(yīng)出現(xiàn)一些輕微的母體毒性反應(yīng)，或?yàn)樽畲蠼o藥量/最大耐受量。

低劑量：應(yīng)為生殖毒性方面的“未觀察到不良反應(yīng)的劑量（NOAEL）”。給藥途徑：應(yīng)與臨床擬用途徑一致（不用腹腔注射途徑，因腹腔注射會對胎兒及子宮產(chǎn)生直接影響）。對照組：

應(yīng)設(shè)賦形劑對照組。當(dāng)賦形劑可能產(chǎn)生作用或影響受試物的作用時，應(yīng)另設(shè)空白對照組。第三十二頁，共六十五頁，2022年，8月28日生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)（I段）第三十三頁，共六十五頁，2022年，8月28日胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)（II段）第三十四頁，共六十五頁，2022年，8月28日圍產(chǎn)期毒性試驗(yàn)（III段）第三十五頁，共六十五頁，2022年，8月28日第4部分與血液相互作用試驗(yàn)選擇該試驗(yàn)評價血液接觸器械、材料或一相應(yīng)的模型或系統(tǒng)對血液或血液成分的作用。特殊的血液相容性試驗(yàn)，還可設(shè)計成模擬臨床應(yīng)用時器械或材料的形狀、接觸條件和血流動態(tài)。溶血試驗(yàn)采用體外法測定由器械、材料和/或其浸提液導(dǎo)致的紅細(xì)胞溶解和血紅蛋白釋放的程度。第三十六頁，共六十五頁，2022年，8月28日第4部分與血液相互作用試驗(yàn)選擇第三十七頁，共六十五頁，2022年，8月28日第4部分與血液相互作用試驗(yàn)選擇第三十八頁，共六十五頁，2022年，8月28日與血液相互作用試驗(yàn)選擇第三十九頁，共六十五頁，2022年，8月28日與血液相互作用試驗(yàn)選擇第四十頁，共六十五頁，2022年，8月28日第四十一頁，共六十五頁，2022年，8月28日第4部分與血液相互作用試驗(yàn)選擇第四十二頁，共六十五頁，2022年，8月28日溶血試驗(yàn)?zāi)壳皣H上明確的、公認(rèn)的用于評價醫(yī)療器械或醫(yī)療器械材料的溶血性能的方法主要有三種：NIH（NationalInstitutesofHealth，國家健康機(jī)構(gòu)）法ASTM（AmericanSocietyforTestingandMaterials，美國材料與試驗(yàn)協(xié)會）F756-2008（適用于專項檢驗(yàn)材料溶血性能（化學(xué)因素導(dǎo)致的溶血），不適宜用于整體醫(yī)療器械）MHLW（日本勞動健康福利局）的溶血方法注意：醫(yī)療器械不宜使用高度稀釋的紅細(xì)胞懸液來檢測溶血性能，為使溶血性能標(biāo)準(zhǔn)化，還必須考慮到血細(xì)胞比容和其他因素。第四十三頁，共六十五頁，2022年，8月28日三種溶血試驗(yàn)方法比較NIHASTMMHLW測定原理測定與試驗(yàn)樣品或其浸提液接觸的血液上清液的吸光度值，同時測定陰性和陽性對照吸光度值，將試驗(yàn)樣品的溶血率標(biāo)準(zhǔn)化測定與試驗(yàn)樣品或其浸提液接觸的血液上清液中游離血紅蛋白的含量與總的血紅蛋白含量比較，計算溶血率，判斷溶血的程度測定與試驗(yàn)樣品浸提液接觸的血液上清液的吸光度值，同時測定陰性和陽性對照吸光度值，將試驗(yàn)樣品的溶血率標(biāo)準(zhǔn)化測定方法分光光度計法分光光度計法分光光度計法測定條件545nm540nm540nm陽性對照

0.1%碳酸鈉注射用水注射用水陰性對照生理鹽水不含鈣鎂離子的PBS溶液生理鹽水試驗(yàn)用試劑/血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和氰化正鐵血紅蛋白試劑Drabkin’sReagent第四十四頁，共六十五頁，2022年，8月28日NIHASTMMHLW血源新西蘭白兔，兔血8ml新西蘭白兔，3只兔子分別抽取5ml血液混合至少2只兔子各10ml，對兔子有一定的要求日本白兔或新西蘭白兔，12到15周齡，體重2.5kg以上且至少13天內(nèi)未取血，采血前7天內(nèi)一般狀況良好。抗凝劑草酸鉀檸檬酸鹽/血液處理1.將兔血8ml加入到10ml生理鹽水中，輕輕上下?lián)u晃至少10次。2.將稀釋的兔血0.2ml加入到放置于室溫的10ml0.1%的碳酸鈉中，混合均勻。3.545nm，用生理鹽水調(diào)0，測定碳酸鈉和兔血混合物的吸光度。如果透過率在10~10.5%(吸光度是0.98~1.00)之間稀釋的兔血可用。1.將人血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用氰化正鐵血紅蛋白試劑系列稀釋，540nm測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.測定血漿血紅蛋白濃度(PFH)：必需<2mg/ml3.測定全血血紅蛋白(WB)4.用CMF-PBS將WB調(diào)整為10±1mg/ml，測定稀釋的全血血紅蛋白濃度5.計算每管中總的血紅蛋白含量1.將所取血液放入錐形瓶(內(nèi)含玻璃或塑料珠子)室溫下輕輕搖勻3~5min。2.將去纖維蛋白血液過濾至一新離心管內(nèi)3.每個離心管內(nèi)加入10ml生理鹽水和0.2ml去纖維蛋白原兔血，顛倒混勻一次。4.750g室溫離心5min。5.取上清液測576nm吸光度6.去纖維蛋白原血吸光度必須小于0.010第四十五頁，共六十五頁，2022年，8月28日NIHASTMMHLW與樣品接觸方式直接接觸法和間接接觸法直接接觸法和間接接觸法間接接觸法浸提比例直接接觸法按5g樣品加10ml生理鹽水和0.2ml血液的比例制備樣品。非常小、輕的樣品如纖維或細(xì)線按0.5g/10ml的比例按42cm2（樣品

≤0.50

mm）或21cm2（樣品厚度＞0.50mm）或1.4g（樣品厚度＞1.0mm或樣品形狀不規(guī)則）樣品加7mlCMF-PBS和1.0ml血液的比例制備樣品。/間接接觸法參考ISO10993.12[5]，根據(jù)試驗(yàn)樣品的特點(diǎn)選擇合適的方法制備浸提液浸提溫度和時間1.37?C

(±

2?C)水浴中孵育30-40min。2.按0.2ml血液/10ml生理鹽水的浸提比例，在每個試管中加入稀釋的兔血3.

37?C

(±2?C)水浴中孵育60±1min1.0ml稀釋的全血與7.0mlCMF-PBS混合加入到各組，37±2?C孵育至少3h各管內(nèi)加入10mL浸提液，0.2mL去纖維蛋白血，7?C±1?C

孵箱內(nèi)孵育1、2、3和4h。結(jié)果測定將樣本和對照溶液移入新的離心管中，500g離心5min。用生理鹽水調(diào)0，540nm測定每個樣本的吸光度值。陽性對照的吸光度值應(yīng)0.850，陰性對照的吸光度值應(yīng)<0.100，否則應(yīng)重新試驗(yàn)。孵育后將浸提液700-800g離心15min，1ml上清液加入到1ml試劑中，室溫放置5min后540nm測定吸光度，計算每個樣本的上清液血紅蛋白濃度室溫下750xg離心5min。在4.5mLDrabkin’sReagent加入0.5mL上清液?；旌弦菏覝叵路跤?0min。用分光光度計測540nm處吸光度。第四十六頁，共六十五頁，2022年，8月28日NIHASTMMHLW結(jié)果計算直接接觸法%溶血率=(T–N)/(P–N)×100T=被測樣品的平均吸光度N=陰性對照組平均吸光度P=陽性對照組平均吸光度空白修正的%溶血率=(AS–AB)/(0.884×AT–AB)×100AS=被測樣品的吸光度AB=空白管的吸光度AT=稀釋的全血吸光度%溶血率=(T–N)/(P–N)×100T=被測樣品的平均吸光度N=陰性對照組平均吸光度P=陽性對照組平均吸光度間接接觸法%溶血率={(Ti–Bi)–(NSa–BSa)}/{(PNaCo–BNaCo)–(NSa–BSa)}×100Ti=與血液接觸樣品的吸光度Bi=不與血液接觸樣品的吸光度NSa=與血液接觸陰性對照的吸光度BSa=不與血液接觸陰性對照的吸光度PNaCo=與血液接觸陽性對照的吸光度BNaCo=不與血液接觸陽性對照的吸光度空白修正的%溶血率=(AS–AB)/(0.884×AT–AB)×100AS=被測樣品的吸光度AB=空白管的吸光度AT=稀釋的全血吸光度%溶血率=(T–N)/(P–N)×100T=被測樣品的平均吸光度N=陰性對照組平均吸光度P=陽性對照組平均吸光度結(jié)果判定（%溶血率≤5非溶血0–2非溶血≤2非溶血3~5應(yīng)用不同的兔血進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果在此試驗(yàn)范圍內(nèi)，則表明該樣品具有顯著的低溶血活性2–5輕度溶血2-10輕度溶血>5溶血>5溶血10-20中度溶血20-40顯著溶血>40嚴(yán)重溶血第四十七頁，共六十五頁，2022年，8月28日第5部分體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，測定由器械、材料和/或其浸提液造成的細(xì)胞溶解（細(xì)胞死亡），以及對細(xì)胞生長的抑制和對細(xì)胞的其他影響。優(yōu)點(diǎn)：周期短、操作容易、再現(xiàn)性良好、可進(jìn)行定量評定、對毒性物質(zhì)敏感度高與價格便宜等樣品制備方法：

1）浸提液試驗(yàn)

2）直接接觸試驗(yàn)

3）間接接觸試驗(yàn)（包括瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、濾膜擴(kuò)散試驗(yàn)）第四十八頁，共六十五頁，2022年，8月28日第5部分體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)評價方法：a)按形態(tài)學(xué)方法評價細(xì)胞破壞（如顯微鏡檢查、化學(xué)染色等）b)細(xì)胞損傷的測定（流式細(xì)胞術(shù)等）c)細(xì)胞生長的測定（MTT法，流式細(xì)胞術(shù)等）d)細(xì)胞代謝特征的測定（生化分析、酶活力測定等）第四十九頁，共六十五頁，2022年，8月28日MTT法MTT法又稱MTT比色法，是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法，該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)，但由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測，這不僅使工作量增加，也會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲瓚的有機(jī)溶劑對實(shí)驗(yàn)者也有損害。第五十頁，共六十五頁，2022年，8月28日MTT法一、檢測原理MTT（商品名：噻唑藍(lán)），是一種黃顏色的染料。活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm（或570nm）波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)成正比。二、試劑材料準(zhǔn)備與實(shí)驗(yàn)儀器1、對數(shù)生長期細(xì)胞2、5mg.mL-1MTT溶液：稱取MTT0.5克，溶于100ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中（60℃水浴助溶），用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，放4℃避光保存即可，在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。（PBS配方：NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g，調(diào)pH7.4，定容1L）3、DMSO4、96孔板5、酶聯(lián)免疫檢測儀6、細(xì)胞培養(yǎng)箱第五十一頁，共六十五頁，2022年，8月28日MTT法三、MTT法實(shí)驗(yàn)步驟1、貼壁細(xì)胞（1）收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100μl,鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度至103-104cell/孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。（2）5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物，原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥，一般5-7個梯度，每孔100μl，設(shè)3-5個復(fù)孔，建議設(shè)5個，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況。（3）5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。（4）每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。（5）終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。（6）每孔加入150μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。（7）同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、DMSO），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、DMSO）第五十二頁，共六十五頁，2022年，8月28日MTT法2、懸浮細(xì)胞（1）收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1×106/ml，按次序A.補(bǔ)足的1640（無血清）培養(yǎng)基40μl；B.加ActinomycinD10μl用培養(yǎng)液C.需檢測物10μl；D.細(xì)胞懸液50μl（即5×104cell/孔），共100μl加入到96孔板邊緣孔用無菌水填充）；每板設(shè)對照（加100μL1640）。（2）置37℃，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。（3）每孔加入10μlMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。（懸浮細(xì)胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4h后可跳過步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值）（4）離心（1000轉(zhuǎn)10min），小心吸掉上清，每孔加入100μlDMSO，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值。（5）同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、DMSO），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、DMSO），每組設(shè)定3復(fù)孔。第五十三頁，共六十五頁，2022年，8月28日MTT法五、計算抑制率[(對照-本底)-(給藥-本底)]/(對照-本底)*100%.第五十四頁，共六十五頁，2022年，8月28日第6部分植入后局部反應(yīng)試驗(yàn)該試驗(yàn)是用外科手術(shù)法，將材料或最終產(chǎn)品的樣品植入或放入預(yù)定的植入部位或組織內(nèi)，在肉眼觀察和顯微鏡檢查下，評價對活體組織的局部病理作用。對一種材料來說，如還評價全身作用，該試驗(yàn)等效于亞慢性毒性試驗(yàn)。適用于評價亞慢性反應(yīng)（短期，12周以內(nèi)），或慢性反應(yīng)（長期，12周以上）。實(shí)驗(yàn)動物：皮下組織和肌肉內(nèi)的短期試驗(yàn)：一般可選小鼠、大鼠、豚鼠和家兔皮下組織、肌肉和骨內(nèi)的長期試驗(yàn)：一般可選大鼠、豚鼠、家兔、狗、綿羊、山羊、豬或其他壽命較長的動物中的一種。評價方法：肉眼觀察評價及組織學(xué)評價第五十五頁，共六十五頁，2022年，8月28日第10部分刺激與遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)致敏：采用一種適宜的模型測定器械、材料和/或其浸提液潛在的接觸致敏性。該試驗(yàn)較為實(shí)用。因?yàn)榧词故巧倭康目蔀r濾物的使用或接觸也能引起變應(yīng)性或致敏性反應(yīng)。刺激性：采用一種適宜的模型，在相應(yīng)部位或在皮膚、眼、粘膜等植入組織上測定器械、材料和/或其浸提液潛在的刺激作用。要測定器械、材料及其潛在可瀝濾物的刺激作用，試驗(yàn)的進(jìn)行建議與使用或接觸的途徑和持續(xù)時間相適應(yīng)。皮內(nèi)反應(yīng)：評價組織對器械浸提液的局部反應(yīng)。該試驗(yàn)適用于不適宜做表皮或粘膜刺激試驗(yàn)的情況（如連向血路的器械），還適用于疏水性浸提物。第五十六頁，共六十五頁，2022年，8月28日第10部分刺激與遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)刺激試驗(yàn)體外皮膚刺激試驗(yàn)：大鼠皮膚經(jīng)皮電阻抗試驗(yàn)（TER）和EPISKIN試驗(yàn)（化學(xué)物皮膚腐蝕性的替代試驗(yàn)）體內(nèi)皮膚刺激試驗(yàn)：影響因素：a)器械用于斑貼試驗(yàn)時的特性b)試驗(yàn)材料的劑量c)試驗(yàn)材料的應(yīng)用方法d)封閉的程度e)接觸部位f)接觸時間和天數(shù)g)評價試驗(yàn)所采用的技術(shù)注意：試驗(yàn)材料的pH值如小于等于2或大于等于11.5，應(yīng)認(rèn)為是一種刺激物，不必進(jìn)一步試驗(yàn)第五十七頁，共六十五頁，2022年，8月28日第10部分刺激與遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)第五十八頁，共六十五頁，2022年，8月28日第10部分刺激與遲發(fā)型