基因疫苗的構(gòu)建及免疫學(xué)特性 5800字

基因疫苗的構(gòu)建及免疫學(xué)特性5800字【摘要】目的：構(gòu)建HSP65蛋白的亞單位疫苗和基因疫苗，并與BCG相比擬，評價這兩種疫苗在小鼠體內(nèi)的免疫學(xué)特性.辦法:從結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中擴增出hsp65基因，連接進入pMD18《T載體中，測序后，利用不同酶切位點將完整的hsp65基因分別克隆到pProEXHTb原核敘述載體和pcDNA3.1(-)真核敘述載體，前者在大腸桿菌中誘導(dǎo)敘述，經(jīng)SDS《PAGE和WesternBlot分析后，用Ni《NTA親和層析柱進行純化；后者通過陽離子聚合物瞬轉(zhuǎn)P815細胞，用間接免疫熒光檢測細胞內(nèi)HSP65蛋白的敘述.用上述原核敘述蛋白和真核質(zhì)?！卜謩e為亞單位疫苗和基因疫苗〕免疫BALB/c小鼠，ELISA測定特異性抗體的滴度，MTT測定脾淋巴細胞特異性增殖指數(shù).結(jié)果：獲得的結(jié)核分枝桿菌hsp65基因序列與GenBank頒布的完全一致；WesternBlot結(jié)果顯示，在Mr約65000處有與鼠抗HSP65mAb和臨床結(jié)核患者血清的特異性結(jié)合帶；免疫熒光結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的P815細胞的敘述蛋白與HSP65mAb有特異性結(jié)合.兩種疫苗免疫小鼠體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗體，經(jīng)蛋白刺激后可引起脾淋巴細胞特異性增殖.結(jié)論：所構(gòu)建的兩種疫苗能引起免疫動物的特異性體液和細胞免疫反饋，應(yīng)進一步研究其抵制結(jié)核分支桿菌感染的愛護力機制，以用于結(jié)核病的防治研究.

【關(guān)鍵詞】結(jié)核分枝桿菌；熱休克蛋白質(zhì)類；亞單位疫苗；基因疫苗

0引言

結(jié)核病〔Tuberculosis，TB〕是由結(jié)核分枝桿菌〔MTB)引起，經(jīng)呼吸道傳播的慢性傳染病.卡介苗(BCG)接種是預(yù)防TB的主要伎倆，但其預(yù)防效果不穩(wěn)［1］.熱休克蛋白65(HSP65)是熱休克蛋白60家族成員之一，由groEL2基因編碼,是一種高度保守的蛋白質(zhì)［2］.在結(jié)核桿菌感染過程中，HSP65是機體反抗其入侵的重要的免疫愛護性抗原之一，該蛋白具有很強的免疫原性［3］，Yang等［4］發(fā)現(xiàn)在MTB感染小鼠化學(xué)治療后接種HSP65DNA，能夠去除剩余細菌，提示HSP65抗原不僅可作為預(yù)防性疫苗的候選組分，也可作為治療性疫苗的候選組分.我們運用分子生物學(xué)技術(shù)分別構(gòu)建了MTBHSP65蛋白亞單位疫苗和DNA疫苗，并在小鼠模型上對這兩種疫苗免疫學(xué)特性進行研究，為TB新型疫苗的研究提供了一定的理論和物質(zhì)根底.

1材料和辦法

1.1材料E.coliDH5a由本實驗動物中心保留，MTBH37Rv株由陜西省結(jié)核病防治研究所王瑞副主任技師惠贈.克隆載體pMD18《T質(zhì)粒購自TaKaRa公司，原核敘述質(zhì)粒載體pProEXHTb和真核敘述載體pcDNA3.1(-)質(zhì)粒均購自Promega公司.LATaqDNA聚合酶，T4DNA連接酶，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ，EcoRⅤ，HindIII及DNA標記物DL2000購自大連TaKaRa公司.質(zhì)粒抽提試劑盒購自BBI公司，辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)標記的羊抗鼠IgG和羊抗人IgG購自武漢博士德公司，鼠抗MTBHSP65mAb購自北京博菲康公司.純化的HSP65蛋白由本實驗室制備，含有Ni+鰲合劑的Ni《NTA純化試劑盒購自Invitrogen公司.

1.2辦法

1.2.1目的基因的擴增與克?、倌康幕虻臄U增：按參考文獻［5］的辦法獲得結(jié)核分枝桿菌毒株H37Rv的DNA，以此為模板，參照GenBank發(fā)表的hsp65基因序列設(shè)計引物.上游片段引物：P1:AATGAATTCGATATCATGGCCAAGACAAT〔含EcoRI,EcoRV酶切位點〕；P2:GCAAGCTTATCGATTCAGAAATC(含HindIII酶切位點)，PCR循環(huán)參數(shù)為:94℃預(yù)變性3min，94℃45s，60℃45s，72℃50s，共30個循環(huán)，再72℃延伸5min.②目的基因的克隆與測序：T4連接酶將PCR產(chǎn)物與pMD18《T質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，隨機挑選4個菌落，分別接種于5mL含100mg/L氨芐青霉素(ampicillin，amp)的Luria《Bertani(LB)培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)過夜.提取質(zhì)粒DNA，用EcoRⅠ和HindIII對片段進行酶切鑒定.將篩選出的陽性克隆雙向測序(由北京奧科生物技術(shù)有限公司完成測序)，記作pMD《HSP65.

1.2.2原核敘述載體的構(gòu)建及目的基因的敘述、純化①原核敘述載體的構(gòu)建及敘述：pMD《HSP65用EcoRⅠ和HindIII雙酶切獲得hsp65片段，將其與同樣酶切的敘述質(zhì)粒載體pProEXHTb質(zhì)粒連接，記作pPro《HSP65，再轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞.挑選陽性克隆接種于5mL含Amp的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)18h，分別取50μL加到5mL含Amp的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)2～3h，0.5mmol/LIPTG5μL誘導(dǎo)4h，收菌進行120g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS《PAGE)分析.②HSP65敘述產(chǎn)物WesternBlot鑒定:上述敘述產(chǎn)物進行120g/LSDS《PAGE后，100V恒壓電轉(zhuǎn)1h，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，10g/L牛血清白蛋白封閉過夜，TBST洗3次，與鼠抗MTBHSP65mAb/臨床結(jié)核患者血清〔陜西省結(jié)核病醫(yī)院提供〕結(jié)合1h，TBST洗3次，加HRP標記的羊抗鼠IgG/羊抗人IgG結(jié)合1h，TBST洗3次，TBS洗1次，以O(shè)PD顯色液顯色并察看結(jié)果.③親和色譜法純化目的蛋白：采用Invitrogen的Ni《NTA純化試劑盒純化目的蛋白，按照變性條件(denaturingcondition)辦法進行親和色譜純化，收集洗脫液.進行120g/LSDS《PAGE分析，殘余洗脫液經(jīng)透析、復(fù)性、定量后于-20℃凍存?zhèn)溆?

1.2.3真核敘述載體的構(gòu)建及敘述產(chǎn)物的鑒定①真核敘述載體的構(gòu)建：pMD《HSP65用EcoRⅤ和HindIII雙酶切獲得hsp65片段，將其與同樣酶切的真核敘述質(zhì)粒載體pcDNA3.1(-)質(zhì)粒連接，記作pcDNA《HSP65.②轉(zhuǎn)染P815(小鼠肥大細胞瘤細胞)細胞：P815細胞常規(guī)培養(yǎng)于100mL/LFCSRPMI《1640完全培養(yǎng)液中.收集對數(shù)生長期的P815細胞，將2×105細胞接種于24孔板，細胞數(shù)量達孔底80%～90%時進行轉(zhuǎn)染.轉(zhuǎn)染前用不含抗生素的100mL/LFCS1640培養(yǎng)液0.5mL培養(yǎng)細胞.將1g/LpcDNA《HSP65質(zhì)粒2μL和梭華《Sofast1.5μL混勻后遲緩參加到細胞中，6h后加100mL/LFCS1640培養(yǎng)液0.5mL于各轉(zhuǎn)染細胞孔，次日換液.48h后收集細胞，同時設(shè)正常細胞對照.③轉(zhuǎn)染P815細胞敘述產(chǎn)物的間接免疫熒光鑒定：將轉(zhuǎn)染的pcDNA《HSP65質(zhì)粒的P815細胞爬片,用HSP65mAb作為一抗,間接免疫熒光法檢測P815細胞中HSP65蛋白的敘述.

1.2.4免疫①免疫動物：6～8wk齡雄性BALB/c小鼠40只，隨機分成4組，即HSP65亞單位疫苗組、HSP65基因疫苗組、BCG免疫〔陽性對照〕組和生理鹽水注射〔陰性對照〕組，每組10只.亞單位疫苗組用轉(zhuǎn)膜條帶〔50μg/膜〕免疫，每片膜免疫一只小鼠〔包埋于小鼠腹股溝處皮下〕共免疫3次，每次間隔2wk；基因疫苗組，免疫前在小鼠后大腿每側(cè)各肌肉注射2.5g/L布比卡因50μL做預(yù)處理，24h后在相同部位用DNA肌肉注射，每側(cè)50μL，每只共計100μg質(zhì)粒/次.每隔2wk在相同部位注射相同劑量，共免疫3次.陽性對照組和陰性對照組分別用BCG〔0.2mg/只〕和生理鹽水〔0.1mL/只〕進行皮下注射.每隔2wk收集各組小鼠血清，測定相應(yīng)抗體.免疫結(jié)束后2wk脫頸處死小鼠，別離脾淋巴細胞，測定其淋巴細胞增殖指數(shù).②免疫小鼠血清中抗體的檢測：在免疫的第2，4，6，8周，各組小鼠剪尾取血，別離血清，用本室純化的HSP65蛋白包被平板，羊抗鼠IgG《HRP作為二抗，ELISA檢測血清中相應(yīng)抗體.③特異性淋巴細胞增殖實驗：參照文獻［6］利用密度梯度離心法別離免疫鼠脾淋巴細胞，用RPMI《1640完全培養(yǎng)液將別離的各組淋巴細胞密度調(diào)整至5×108/L，在96孔板中培養(yǎng)，200μL/孔.實驗孔每孔參加50μLHSP65蛋白〔15mg/L溶于PBS〕刺激，所有對照孔均不加蛋白刺激，調(diào)零孔不加脾淋巴細胞，各孔均做兩個復(fù)孔.37℃，50mL/LCO2孵箱培養(yǎng)72h后，加5g/LMTT，20μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)，棄上清，加DMSO150μL/孔，振蕩10min，測定A490nm值.結(jié)果用刺激指數(shù)SI=A實驗組/A對照組表示.

統(tǒng)計學(xué)處理：實驗數(shù)據(jù)以x±s表示(n=10),統(tǒng)計分析采用單因素方差分析,兩兩比擬采用LSD《t檢驗,P2結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒pMD《HSP65的鑒定重組質(zhì)粒雙酶切后經(jīng)瓊脂糖電泳檢測到大小為1620bp的片段〔圖1〕.

M:核酸makerDL2000；1:重組質(zhì)粒pMD《HSP65被EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切.

圖1重組質(zhì)粒pMD《HSP65雙酶切鑒定〔略〕

2.2原核敘述重組質(zhì)粒和真核敘述重組質(zhì)粒的鑒定分別經(jīng)EcoRⅠ，HindIII和EcoRⅤ，HindⅢ雙酶切后瓊脂糖電泳，得到大小為1620bp的片段〔圖2〕.

2.3原核敘述產(chǎn)物及純化蛋白SDS《PAGE鑒定取重組菌誘導(dǎo)前后的敘述產(chǎn)物進行SDS《PAGE，誘導(dǎo)的重組菌和純化蛋白約在65000處均有一蛋白帶，同預(yù)計的大小相吻合，而空載體菌和未誘導(dǎo)菌無此條帶，親和色譜法純化得到的目的蛋白經(jīng)SDS《PAGE可見同樣大小的蛋白帶〔圖3〕.

2.4原核敘述產(chǎn)物的WesternBlot鑒定在Mr約為65000處有一條敘述帶，說明HSP65敘述產(chǎn)物包含了與鼠抗MTBHSP65mAb及結(jié)核患者血清結(jié)合的表位〔圖4〕.

M:核酸makerDL2000；1:pPro《HSP65被EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切;2:pcDNA《HSP65被EcoRⅤ和HindⅢ雙酶切.

圖2原核敘述重組質(zhì)粒和真核敘述重組質(zhì)粒酶切鑒定〔略〕

M:蛋白marker；1,5:DH5α中未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒pPro《HSP65的敘述產(chǎn)物；2～4:DH5α中誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒pPro《HSP65的敘述產(chǎn)物；6:DH5α中誘導(dǎo)的空質(zhì)粒pProEXHTb的敘述產(chǎn)物；7:重組質(zhì)粒pPro《HSP65敘述產(chǎn)物的純化蛋白.

圖3敘述產(chǎn)物及純化蛋白的SDS《PAGE分析〔略〕

1:敘述產(chǎn)物與鼠抗MTBHSP65mAb的結(jié)合帶；2:空質(zhì)粒陰性對照；3:正常人血清陰性對照；4:敘述產(chǎn)物與結(jié)核患者血清的結(jié)合帶.

圖4敘述產(chǎn)物的WesternBlot鑒定〔略〕

2.5真核敘述產(chǎn)物間接免疫熒光鑒定轉(zhuǎn)染細胞在經(jīng)過間接免疫熒光染色后,陽性細胞著染有較強的熒光,敘述蛋白定位于細胞膜上,而對照組細胞未見熒光著染〔圖5〕.

2.6免疫小鼠特異性抗體的水平在一定免疫時間內(nèi)，免疫小鼠的抗體水平隨免疫時間的延長而持續(xù)增高.蛋白免疫組抗體效價最高為1∶16000，高于DNA免疫組〔1∶8000，PA：實驗組；B：對照組.

圖5間接免疫熒光測定融合蛋白在P815細胞中的敘述×400〔略〕

圖6免疫小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的特異性抗體的水平〔n=10〕〔略〕

2.7免疫小鼠特異性脾淋巴細胞增殖結(jié)果亞單位疫苗組小鼠脾淋巴細胞經(jīng)HSP6蛋白刺激后，特異性淋巴細胞增殖明顯，其平均刺激指數(shù)為2.58±0.12，高于基因疫苗組小鼠脾淋巴細胞的增殖指數(shù)1.79±0.09〔P3討論

HSP65蛋白是目前確認的MTB蛋白中能誘發(fā)愛護性免疫的一類蛋白，且具有較強的細胞免疫活性.亞單位疫苗免疫效果與疫苗接種劑量、時間、接種方式以及佐劑的應(yīng)用等有關(guān)［7］.亞單位疫苗必須配以合適的佐劑，屢次接種才能到達理想的免疫效果.在本研究中，采取將可溶性抗原轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC膜)上，以皮下包埋的方式進行免疫.NC膜不僅是抗原載體，使抗原逐漸被宿主辨認，植入小鼠皮下還可以在部分起到佐劑的作用［8］，經(jīng)本實驗實際應(yīng)用，證明是平安而可靠的免疫辦法.MTB基因疫苗的研究是TB新型疫苗開展的優(yōu)先領(lǐng)域［9］,這是因為基因疫苗可刺激機體產(chǎn)生持久的體液和細胞免疫應(yīng)答,特別是可刺激產(chǎn)生CD8+CTL反饋,這正是防治TB所需的愛護性免疫反饋.

我們成功構(gòu)建了HSP65蛋白的原核敘述重組質(zhì)粒和真核敘述重組質(zhì)粒.WesternBlot結(jié)果顯示原核敘述的蛋白能與鼠抗MTBHSP65mAb和臨床結(jié)核患者血清結(jié)合，說明其具有生物活性，同時提示了HSP65在結(jié)核病診斷研究中有著良好的應(yīng)用前景.為了確定兩種疫苗的免疫學(xué)活性，我們將上述兩種疫苗免疫動物，并與BC