西南生物-課件蛋白質(zhì)化學(xué)

第一章蛋白質(zhì)化學(xué)

蛋白質(zhì)的生物學(xué)意義

蛋白質(zhì)的元素組成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位－氨基酸肽蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)的分類蛋白質(zhì)是由許多不同的α-氨基酸按一定的序列通過酰胺鍵（肽鍵）縮合而成的，具有較穩(wěn)定的構(gòu)象并具有一定生物功能的大分子。蛋白質(zhì)的生物學(xué)意義1.生物體的組成成分2.酶：參與代謝反應(yīng)的各種酶3.運輸：血紅蛋白、載脂蛋白、運鐵蛋白4.運動：肌動蛋白、肌球蛋白5.抗體：免疫性球蛋白6.儲存和營養(yǎng)功能：7.遺傳信息的控制8.細(xì)胞膜的通透性：膜蛋白9.高等動物的記憶、識別機(jī)構(gòu)：受體10.其他生物學(xué)功能：毒蛋白,激素調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)物質(zhì)膠原蛋白

血紅蛋白運輸功能運動物質(zhì)免疫球蛋白-IgG免疫保護(hù)貯存功能組蛋白基因表達(dá)調(diào)控胰島素激素調(diào)節(jié)

（一）、蛋白質(zhì)的化學(xué)組成碳50%

氫7%

氧23%

氮16%

硫0-3%

其它微量（金屬元素：Fe，P，Zn，Cu，I等，蛋白質(zhì)的輔助成份或修飾成分）蛋白質(zhì)的元素組成

在這些化學(xué)元素中，氮的含量在不同蛋白質(zhì)中很穩(wěn)定，所以可以根據(jù)氮元素的含量測定蛋白質(zhì)的含量，蛋白質(zhì)的平均含N量平均為16%——凱氏（Kjadehl）定氮法的理論基礎(chǔ)：

這是蛋白質(zhì)定量分析的理論基礎(chǔ)，經(jīng)典的蛋白質(zhì)含量測定方法就是先測定蛋白質(zhì)氮的含量，再根據(jù)上述公式計算蛋白質(zhì)的含量。蛋白質(zhì)含量＝蛋白質(zhì)氮X6.25蛋白質(zhì)的氨基酸組成一、蛋白質(zhì)水解特性蛋白質(zhì)的基本單位為氨基酸，其徹底氨基酸水解后的產(chǎn)物為氨基酸。水解方法主要有三種：

1.酸水解優(yōu)點：水解徹底，不引起消旋作用；缺點：引起部分氨基酸被破壞：色氨酸完全破壞絲氨酸和蘇氨酸（羥基氨基酸）部分破壞天冬氨酸和谷氨酰氨（酰氨氨基酸）酰氨基被水解2.堿水解，優(yōu)點：可使蛋白質(zhì)完全水解，色氨酸穩(wěn)定缺點：產(chǎn)生消旋，部分氨基酸破壞：精氨酸被脫氨生成鳥氨酸。酸水解和堿水解可以互補3.酶水解：優(yōu)點：不產(chǎn)生消旋，也不破壞氨基酸缺點：只用一種酶時水解不完全，需要幾種酶協(xié)同作用才能徹底水解。

氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位。從細(xì)菌到人類，所有蛋白質(zhì)都由20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸（20standardaminoacids)組成。（一）氨基酸的結(jié)構(gòu)通式：19種氨基酸均為α

-氨基酸（具有一級氨基（-NH3+）和羧基（-COOH）結(jié)合到α碳原子（Cα），同時結(jié)合到（Cα）上的是H原子和各種側(cè)鏈（R）)；Pro具有二級氨基（α-亞氨基酸）二、蛋白質(zhì)的基本單位－氨基酸氨基酸（Aminoacid）的結(jié)構(gòu)CH氨H2N酸COOHR不變部分可變部分Cα是不對稱C（除Gly），則：具有兩種立體異構(gòu)體構(gòu)型

[D-型和L-型]2.具有旋光性

[左旋（-）或右旋（+）]3.標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的結(jié)構(gòu)式不帶電形式

H2NCαHCOOHR兩性離子形式+H3NCαHCOO-RD型與L型L-型氨基酸

與D-型氨基酸L-aminoacidD-aminoacid氨基酸的旋光性

除甘氨酸外，氨基酸均含有一個手性-碳原子，因此都具有旋光性。比旋光度是氨基酸的重要物理常數(shù)之一，是鑒別各種氨基酸的重要依據(jù)

I非極性氨基酸

丙氨酸 AlaCOOHCH3CHNH2

CHCHCOOHNH2

CH3CH3

纈氨酸 ValCOOHCH2CHNH2

CH3CH3CH亮氨酸 Leu異亮氨酸 IleCOOHCHNH2

CHCH3CH2CH3I非極性氨基酸

脯氨酸 ProCOOHCHNHCH2CH2CH2

苯丙氨酸 PheCOOHCHNH2

CH2COOHCH2CHNH2

色氨酸 TrpN

H

甲硫氨酸 MetCOOHCHNH2

CH2CH2SCH3II非解離的極性氨基酸

甘氨酸 GlyCOOHCHNH2HCHCOOHCHNH2

蘇氨酸 ThrCH3HO

絲氨酸 SerCOOHCHNH2

CH2HO半胱氨酸

CysCOOHCHNH2

CH2HSII非解離的極性氨基酸

酪氨酸 TyrCOOHCHNH2CH2HO

天冬酰胺 AsnCOOHCHNH2

CH2COH2NCOOHCHNH2

谷氨酰胺 GlnCH2COH2NCH2III酸性氨基酸

天冬氨酸 AspCOOHCHNH2

CH2COHOCOOHCHNH2

谷氨酸 GluCH2COHOCH2IV堿性氨基酸(CH2)4

賴氨酸 LysCOOHCHNH2H2N

精氨酸 ArgCOOHCHNH2

(CH2)3NHCNHH2NCOOHCHNH2

組氨酸 HisCH2NHN氨基酸的分類

目前，在生物體內(nèi)共發(fā)現(xiàn)氨基酸有300多種，其中基本的（蛋白質(zhì)合成）20種（均為L-型氨基酸）不常見氨基酸：少數(shù)不常見（蛋白質(zhì)中被修飾）的氨基酸：如：4-羥脯氨基酸；4-羥賴氨酸；6-N-甲基賴氨酸；鎖鏈素，等非蛋白質(zhì)氨基酸：大多數(shù)（包含D-型氨基酸，β，γ，δ—氨基酸等。有的作為其它大分子合成的結(jié)構(gòu)單元，如細(xì)菌細(xì)胞壁成分中的D-谷氨酸和D-丙氨酸，抗生素中的短桿菌素中的D-苯丙氨酸，有的作為代謝中間產(chǎn)物，如鳥氨酸，瓜氨酸。大多數(shù)的功能還不清楚）。幾種重要的不常見氨基酸

在少數(shù)蛋白質(zhì)中分離出一些不常見的氨基酸，通常稱為不常見蛋白質(zhì)氨基酸。這些氨基酸都是由相應(yīng)的基本氨基酸衍生而來的。（二）20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的分類根據(jù)R的化學(xué)結(jié)構(gòu)（1）脂肪族氨基酸：

1）疏水性：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、

Cys；

2）極性：Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln、

Ser、Thr（2）芳香族氨基酸：Phe、Tyr（3）雜環(huán)氨基酸：Trp、His（4）雜環(huán)亞氨基酸：Pro根據(jù)R的極性（1）極性氨基酸：

1）不帶電：Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys；

2）帶正電：His、Lys、Arg；

3）帶負(fù)電：Asp、Glu（2）非極性氨基酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、

Met、Pro、Trp3.根據(jù)氨基酸的酸堿性：

1、中性AA（有極性與非極性15種）

2、酸性AA（2種）：Asp、Glu3、堿性AA（3種）：His、Lys、Arg

必須氨基酸：人類和動物自身不能合成而必須由食物供給才能維持正常發(fā)育和健康的氨基酸。主要有以下八種：

甲硫(Met)、苯丙(Phe)、賴（Lys)、蘇(Thr)、色(Trp)、纈(Val)、亮(Leu)、異亮(Ile)

半必須氨基酸：精氨酸（Arg)、組氨酸（His)

非必須氨基酸：其他人體和動物自身合成的氨基酸。4.必須氨基酸和非必須氨基酸氨基酸的重要理化性質(zhì)一般物理性質(zhì)(1)溶解性：各種氨基酸在水中的溶解度差別很大，并能溶解于稀酸或稀堿中，但不能溶解于有機(jī)溶劑。通常酒精能把氨基酸從其溶液中沉淀析出。(2)熔點：氨基酸的熔點極高，一般在200℃以上。(3)味感：其味隨不同氨基酸有所不同，有的無味、有的為甜、有的味苦，谷氨酸的單鈉鹽有鮮味，是味精的主要成分。氨基酸的光吸收性質(zhì)構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，但在遠(yuǎn)紫外區(qū)(<220nm)均有光吸收。在近紫外區(qū)(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。

組成天然蛋白質(zhì)分子的20種氨基酸中，只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸對紫外光有光吸收。其吸收峰在280nm左右，以色氨酸吸收最強(qiáng)。可利用此性質(zhì)采用紫外分分光度法測定蛋白質(zhì)的含量。酪氨酸的max＝275nm，275=1.4x103;苯丙氨酸的max＝257nm，257=2.0x102;色氨酸的max＝280nm，280=5.6x103;兩性解離和等電點氨基酸在水溶液中或在晶體狀態(tài)時都以離子形式存在，在同一個氨基酸分子上帶有能放出質(zhì)子的—NH3+正離子和能接受質(zhì)子的—COO-負(fù)離子，為兩性電解質(zhì)。既是質(zhì)子供體，又是質(zhì)子受體調(diào)節(jié)氨基酸溶液的pH，使氨基酸分子上的—+NH3基和—COO-基的解離程度完全相等時，即所帶凈電荷為零，此時氨基酸所處溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點（pI）。H3N—CH—COOHR+在酸性溶液中的氨基酸（pH＜pI）H3N—CH—COO-R+在晶體狀態(tài)或水溶液中的氨基酸（pH=pI）H2N—CH—COO-R在堿性溶液中的氨基酸（pH＞pI）（當(dāng)氨基酸相互連接成蛋白質(zhì)時，只有其側(cè)鏈基團(tuán)和末端的α-氨基，α-羧基是可以離子化的。中性及酸性氨基酸pI=pK1+pK22堿性氨基酸(CH2)4COOHCH—NH3+(CH2)4NH3+COO?CH—NH3+(CH2)4NH3+COO?CH—NH2NH3+COO?CH—NH2(CH2)4NH2K’1OH?H+H+K’2OH?H+K’3OH?pI=pK2+pK32兩性離子Lys++Lys+Lys±Lys?氨基酸等電點的確定：1）酸堿滴定（滴定曲線）2）根據(jù)pK值（該基團(tuán)在此pH一半解離）計算：等電點等于兩性離子兩側(cè)pK值的算術(shù)平均數(shù)。pI=————pK1+pK22or（pI=————）pK2+pK3220種氨基酸的解離常熟以及等電點在課本的表中可以查出甘氨酸滴定曲線二十種氨基酸的pK，及等電點：

等電點的作用氨基酸在等電點時溶解度最低，可通過沉淀法分離氨基酸。例如：發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸中，調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH＝pI=3.22,則谷氨酸沉淀。★根據(jù)各氨基酸等電點的不同，在同一pH條件下所代電荷的差異可通過電泳和離子交換法分離氨基酸。例如：分離甘氨酸（5.96）、谷氨酸（3.22）、賴氨酸（9.74）和精氨酸（10.76）的混合物。采用電泳法分離：調(diào)節(jié)混合物溶液的pH＝6，根據(jù)4種氨基酸的pI判斷。

甘氨酸：PH=PI

靜電荷為零不移動谷氨酸：PH>PI

帶負(fù)電移向陽極賴氨酸：PH<PI

帶正電移向陰極精氨酸：PH<PI

帶正電移向陰極-+-+精賴甘谷O★經(jīng)驗判斷式

?PH－PI=0

不移動不帶電?PH－PI>0

向正極移動帶負(fù)電?PH－PI<0

向負(fù)極移動帶正電同極移動速度取決于PH－PI絕對值的大小。3.氨基酸的重要化學(xué)反應(yīng)α－氨基的反應(yīng)α－羧基的反應(yīng)α－氨基和α－羧基共同參加的反應(yīng)R－基團(tuán)的反應(yīng)α－氨基的反應(yīng)1.與亞硝酸的反應(yīng)：2.與甲醛反應(yīng)：檢測蛋白質(zhì)的水解程度3.與亞硝酸的反應(yīng)：保護(hù)氨基氨基酸與2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反應(yīng)

（sanger反應(yīng)）DNFB（dinitrofiuorobenzene）DNP-AA(黃色)++HF弱堿中氨基酸肽鏈N末端氨基酸分析（sanger反應(yīng)）氨基酸與苯異硫氰酯（PITC）的反應(yīng)

（Edman反應(yīng)）PITC（phenylisothiocyanate）+苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物(PTH-AA)（phenylisothiohydantion-AA）弱鹼中(400

C)(硝基甲烷400C)H+肽鏈N末端氨基酸分析及序列測定（Edman反應(yīng)）2.由α-羧基參加的反應(yīng)

脫羧反應(yīng)

成酯反應(yīng)

成鹽反應(yīng):（3）由R基參加的反應(yīng)-SH的氧化還原反應(yīng)：半胱氨酸胱氨酸在酸性條件下，氨基酸與茚三酮共熱，生成紫色化合物Pro的茚三酮反應(yīng)呈黃色⑷由α－氨基和羧基共同參加的反應(yīng)氨基酸與茚三酮具體反應(yīng)OOOHOHOHHOO+NH3CO2RCHO+RCH—COOHNH2加熱（弱酸）水合茚三酮（無色）還原性茚三酮OOOHOHOOHOH++2NH3OONH4+NOO水合茚三酮還原性茚三酮3H2O紫色化合物(570nm有最大吸收，用于蛋白質(zhì)定量定性分析)成肽反應(yīng)（肽）lH2N－CH－COR1OH+HN－CH－COOHR2HH2N－CH－CO－NH－CH－COOHR1R2肽鍵NH2－C－C－N－C－C－N－C－C…N－C－COOH?llllllllll??HHHHHHHR1R2R4R3OOO主鏈側(cè)鏈N端C端肽鍵殘基肽－是由兩個以上的氨基酸通過肽鍵連接起來的化合物。肽鍵－一個氨基酸的氨基和另一個氨基酸的羥基脫水縮合形成的化學(xué)鍵。四、肽－肽的定義一個多肽或蛋白質(zhì)氨基酸排列順序的閱讀方向：從N－末端向C－末端。命名時從從N－末端氨基酸開始，在每一個氨基酸名稱后加酰字，最后一個為酸。N－末端C－末端肽鏈的結(jié)構(gòu)肽鍵

1、中文表示法：

從肽鏈的N端開始，對氨基酸殘基逐一命名，殘基稱氨酰

肽的表示法2、三字母表示法：

aa1-aa2-aa3-aa4-……aa1.aa2.aa3.aa4.……

3、單字母表示法：

ABCD……肽的重要性

酸堿性質(zhì)、重要化學(xué)反應(yīng)類似于氨基酸的性質(zhì)，也有其獨特的顏色反應(yīng)2個氨基酸形成的肽稱作二肽,3個氨基酸形成的肽稱作三肽；……

余類推。

寡肽（oligopeptide）：aa<10個多肽（polypeptide）：aa>10個天然存在的重要多肽在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位。但是，也有許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在。這類多肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽。如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。肽的顏色反應(yīng)多肽可與多種化合物作用，產(chǎn)生不同的顏色反應(yīng)。這些顯色反應(yīng)，可用于多肽的定性或定量鑒定。如黃色反應(yīng)，是由硝酸與氨基酸的苯基（酪氨酸和苯丙氨酸）反應(yīng)生成二硝基苯衍生物而顯黃色。多肽的雙縮脲反應(yīng)是多肽特有的顏色反應(yīng);雙縮脲是兩分子的尿素經(jīng)加熱失去一分子NH3而得到的產(chǎn)物。雙縮脲能夠與堿性硫酸銅作用，產(chǎn)生蘭色的銅-雙縮脲絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。含有兩個以上肽鍵的多肽，具有與雙縮脲相似的結(jié)構(gòu)特點，也能發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，生成紫紅色或藍(lán)紫色絡(luò)合物。這是多肽定量測定的重要反應(yīng)。（一）谷光甘肽（GSH）H2N-CHCH2CH2CO—COOHγ-GluNHCHCO—CH2SHCysNHCH2COOHGly2GSHGSSG（二）催產(chǎn)素和升壓素

均為9肽，第3位和第9位氨基酸不同。催產(chǎn)素使子宮和乳腺平滑肌收縮，具有催產(chǎn)和促使乳腺排乳作用。升壓素促進(jìn)血管平滑肌收縮，升高血壓，減少排尿。

谷胱甘肽在體內(nèi)參與氧化還原過程，作為某些氧化還原酶的輔助因子，或保護(hù)巰基酶，或防止過氧化物積累。（三）促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）39肽，活性部位為第4~10位的7肽片段：

Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly。（四）腦肽腦啡肽具有強(qiáng)烈的鎮(zhèn)痛作用（強(qiáng)于嗎啡），不上癮。Met-腦啡肽Tyr-Gly-Gly-Phe-MetLeu-腦啡肽Tyr-Gly-Gly-Phe-Leuβ-內(nèi)啡肽（31肽）具有較強(qiáng)的嗎啡樣活性與鎮(zhèn)痛作用。五、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)

1.蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次劃分

2.維持蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的次級鍵

3.蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)（初級結(jié)構(gòu)）

4.蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)

5.蛋白質(zhì)的超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域

6.蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)高級結(jié)構(gòu)

7.維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的作用力

8.蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的主要層次一級結(jié)構(gòu)primarystructure二級結(jié)構(gòu)secondarystructure超二級結(jié)構(gòu)supersecondarystructure結(jié)構(gòu)域structuredoman三級結(jié)構(gòu)tertiarystructure四級結(jié)構(gòu)quariernarystructureαβαβ三級結(jié)構(gòu)木瓜蛋白酶（組織蛋白酶）非共價鍵(次級鍵)1.氫鍵：氫鍵(hydrogenbond)的形成常見于連接在一電負(fù)性很強(qiáng)的原子上的氫原子，與另一電負(fù)性很強(qiáng)的原子之間。氫鍵在維系蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定上起著重要的作用。氫鍵的鍵能較低(~12kJ/mol)，因而易被破壞。蛋白質(zhì)分子中氫鍵的形成2.疏水鍵非極性物質(zhì)在含水的極性環(huán)境中存在時，會產(chǎn)生一種相互聚集的力，這種力稱為疏水鍵或疏水作用力。蛋白質(zhì)分子中的許多氨基酸殘基側(cè)鏈也是非極性的，這些非極性的基團(tuán)在水中也可相互聚集，形成疏水鍵，如Leu，Ile，Val，Phe，Ala等的側(cè)鏈基團(tuán)。3.離子鍵（鹽鍵）離子鍵(saltbond)是由帶正電荷基團(tuán)與帶負(fù)電荷基團(tuán)之間相互吸引而形成的化學(xué)鍵。在近中性環(huán)境中，蛋白質(zhì)分子中的酸性氨基酸殘基側(cè)鏈電離后帶負(fù)電荷，而堿性氨基酸殘基側(cè)鏈電離后帶正電荷，二者之間可形成離子鍵。蛋白質(zhì)分子中離子鍵的形成4．范德華氏（vanderWaals)引力原子之間存在的相互作用力。蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)多肽鏈中通過肽鍵連接起來的氨基酸的排列順序，即多肽鏈的線狀結(jié)構(gòu)，包括二硫鍵的位置。維系蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的主要化學(xué)鍵為肽鍵。蛋白質(zhì)是由一條或多條多肽(polypeptide)鏈以特殊方式結(jié)合而成的生物大分子。蛋白質(zhì)與多肽并無嚴(yán)格的界線，通常是將分子量在6000道爾頓以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。1954年英國生化學(xué)家Sanger報道了胰島素的一級結(jié)構(gòu)，是世界上第一例確定一級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。Sanger由此1958年獲Nobel化學(xué)獎。1965年我國科學(xué)家完成了結(jié)晶牛胰島素的合成，是世界上第一例人工合成蛋白質(zhì)。3蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)(Primarystructure)包括組成蛋白質(zhì)的多肽鏈數(shù)目.多肽鏈的氨基酸順序，以及多肽鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的數(shù)目和位置。其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎(chǔ),內(nèi)寓著決定蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)和生物功能的信息。胰島素（Insulin）由51個氨基酸殘基組成，分為A、B兩條鏈。A鏈21個氨基酸殘基，B鏈30個氨基酸殘基。A、B兩條鏈之間通過兩個二硫鍵聯(lián)結(jié)在一起，A鏈另有一個鏈內(nèi)二硫鍵。

一級結(jié)構(gòu)測定基本戰(zhàn)略：片段重疊法＋氨基酸順序直測法

要點：a.測定蛋白質(zhì)的分子量及其氨基酸組分

b.

測定肽鍵的N－末端和C－末端

c.

應(yīng)用兩種或兩種以上的肽鍵內(nèi)切酶分別在多肽鍵的專一位點上斷裂肽鍵；也可用溴化氰法專一性地斷裂甲硫氨酸位點，從而得到一系列大小不等的肽段。

d.

分離提純所產(chǎn)生的肽段，并分別測定它們的氨基酸順序

e.

將這些肽段的順序進(jìn)行跨切口重疊，進(jìn)行比較分析，推斷出蛋白質(zhì)分子的全部氨基酸序列。將肽段順序進(jìn)行疊聯(lián)以確定完整的順序

將肽段分離并測出順序?qū)Ｒ恍粤呀饽┒税被釡y定二硫鍵拆開純蛋白質(zhì)

肽鏈末端分析

C－末端分析肼解法羧肽酶法

N－末端分析(P77)Sanger法——DNP－AAEdman或PTH法——PTH－AADNS法——DNS－AA氨肽酶法H2N-AA1-AA2-AA3AAn-COOH+

NH2.NH2H2N-AAn-NH.NH2＋H2N-AA-COOH

肽鏈的部分水解酸解酶解溴化氰裂解

幾種常用蛋白水解酶的專一性

胰凝乳蛋白酶：Lys＝苯丙、色、酪、亮等疏水氨基酸

溴化氰裂解：H2N-AA-AA-Met-AA-AA-AA-Met-AA-AA-COOHH2N-AA-AA-Met-COOH

胰蛋白酶：專一性很強(qiáng)H2N-AA-AA-Lys(Arg)-AA-AAAA-COOH

胃蛋白酶：作用位點與胰凝乳蛋白酶相似。差異：要求作用位點兩側(cè)均為疏水氨基酸

例：某肽由16個氨基酸組成，根據(jù)以下資料推斷其氨基酸排列順序所得資料：

N-末端

H

C-末端

S第一套肽段

TOUSPSEOVERLAHOW第二套肽段

SEOWTOUVERLAPSHO片段重疊：

N-末端HSC-末端末端肽段HOWAPS

第一套肽段HOWTOUSEOVERLAPS

第二套肽段HOWTOUSEOVERLAPS

全序列HOWTOUSEOVERLAPS分離純化蛋白質(zhì)酶切部分水解后分離短肽對短肽進(jìn)行測序構(gòu)建cDNA文庫根據(jù)序列設(shè)計探針篩選cDNA文庫根據(jù)cDNA序列推測蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)根據(jù)核苷酸推定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)：現(xiàn)常用的方法。蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)（構(gòu)象、高級結(jié)構(gòu)）（1）構(gòu)型與構(gòu)象構(gòu)型—指不對稱碳原子上相連的各原子或取代基團(tuán)的空間排步方式。構(gòu)型變化：破壞共價鍵，與次級鍵無關(guān)L-aminoacidD-aminoacid構(gòu)象—指在一個分子結(jié)構(gòu)中一切原子沿共價鍵（單鍵）旋轉(zhuǎn)時而產(chǎn)生的不同的空間排列。構(gòu)象變化：破壞次級鍵，與共價鍵無關(guān)。

蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的立體化學(xué)原則

LinusPauling和RobertCorey于20世紀(jì)40年代末至50年代初，應(yīng)用X—射線衍射法技術(shù)對α—角蛋白等研究結(jié)果，提出了蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的立體化學(xué)原則：肽鏈空間構(gòu)象的基本結(jié)構(gòu)單位為肽平面或肽單位。所謂的肽平面（酰胺平面）是指肽鏈中從一個Cα原子到另一個Cα原子之間的結(jié)構(gòu)，共包含6個原子（Cα、C、O、N、H、Cα），它們在空間共處于同一個平面。可將肽鏈的主鏈看成是由被Ca原子隔開的許多平面組成的。二級結(jié)構(gòu)—指多肽鏈本身通過氫鍵盤繞折疊而成的構(gòu)象，它不涉及與其它肽段的相互關(guān)系和側(cè)鏈的構(gòu)象。其實質(zhì)就是多肽鏈在空間的排列方式。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要類型：α—螺旋（α—helix)β—折疊（β—pheatedsheet)β—轉(zhuǎn)角（β—turn)無規(guī)則卷曲（nonregularcoil)4.蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)（1）α-螺旋（α-helix）Pauling和Corey于1965年提出。1）卷曲的棒狀結(jié)構(gòu)。2）主鏈呈右手螺旋盤繞上升3）每一個螺旋中含3.6個氨基酸殘基，13個原子4）螺旋一圈沿中軸上升的距離（螺距）0.54nm，每個氨基酸殘基上升0.15nm，沿中軸旋轉(zhuǎn)100°5）螺旋內(nèi)形成鏈內(nèi)氫鍵，氫鍵的取向幾乎與中軸平行，鏈內(nèi)氫鍵是維持α-螺旋的作用力。影響—螺旋穩(wěn)定的因素：酸性或堿性氨基酸集中的區(qū)域，由于同電荷相斥，不利于α－螺旋形成；較大的R(如苯丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸)集中的區(qū)域，也妨礙

α－螺旋形成；脯氨酸因其α－碳原子位于五元環(huán)上，不易扭轉(zhuǎn)，加之它是亞氨基酸，不易形成氫鍵，故不易形成上述α－螺旋；甘氨酸的R基為H，空間占位很小，也會影響該處螺旋的穩(wěn)定。

a-螺旋在許多蛋白中存在，如α—角蛋白、血紅蛋白、肌紅蛋白等，主要由a-螺旋結(jié)構(gòu)組成。β-折疊（

β-pleatedsheets）β-折疊結(jié)構(gòu)-一種肽鏈幾乎完全伸展的結(jié)構(gòu)，由一條肽鏈的不同肽段間或肽鏈與肽鏈間通過氫鍵形成的一種鋸齒狀片層結(jié)構(gòu)，由氫鍵維持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，氫鍵與鏈的長軸近似垂直。構(gòu)要點如下：（1）、多肽鏈呈鋸齒狀（或扇面狀）排列成比較伸展的結(jié)構(gòu)；（2）、相鄰兩個氨基酸殘基的軸心距離為0.35nm，側(cè)鏈R基團(tuán)交替地分布在片層平面的上下方，片層間有氫鍵相連；（3）、有平行式和反平行式兩種，平行式的折疊其Φ=–119。，

Ψ=+113。。反平行折疊其Φ=–139。，Ψ=+135。。這種片層在絲心蛋白里大量存在。

結(jié)構(gòu)如圖N端C端N端C端C端C端C端C端N端N端N端N端C端毛發(fā)的結(jié)構(gòu)

一根毛發(fā)周圍是一層鱗狀細(xì)胞(scaIecell)，中間為皮層細(xì)胞(corticalcelI)。皮層細(xì)胞橫截面直徑約為20m。在這些細(xì)胞中，大纖維沿軸向排列。所以一根毛發(fā)具有高度有序的結(jié)構(gòu)。大原纖維微纖維二聚物原細(xì)絲角蛋白分子中的二硫鍵卷發(fā)(燙發(fā))的生物化學(xué)基礎(chǔ)永久性卷發(fā)(燙發(fā))是一項生物化學(xué)工程(biochemicalengineering),—角蛋白在濕熱條件下可以伸展轉(zhuǎn)變?yōu)椤獦?gòu)象，但在冷卻干燥時又可自發(fā)地恢復(fù)原狀。這是因為—角蛋白的側(cè)鏈R基一般都比較大，不適于處在—構(gòu)象狀態(tài)，此外—角蛋白中的螺旋多肽鏈間有著很多的二硫鍵交聯(lián)，這些交聯(lián)鍵也是當(dāng)外力解除后使肽鏈恢復(fù)原狀(—螺旋構(gòu)象)的重要力量。燙發(fā)的生物化學(xué)過程還原做卷氧化

蠶絲的主要成分是絲心蛋白，而絲心蛋白的主要二級結(jié)構(gòu)是反平行排列的-折疊。絲心蛋白的一級結(jié)構(gòu)含有長的重復(fù)序列片段，-Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala-。Gly側(cè)鏈氫位于折疊平面的一側(cè)，而Ala和Ser的甲基側(cè)鏈和羥甲基側(cè)鏈位于折疊平面的另一側(cè)，堆積的折疊片靠側(cè)鏈之間的vanderWaals力結(jié)合在一起。絲心蛋白絲心蛋白絲心蛋白堆積的β－折疊片結(jié)構(gòu)交替層中的b-折疊中的丙氨酸（絲氨酸）和甘氨酸三位結(jié)構(gòu)β-轉(zhuǎn)角（-回折或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，存在于球狀蛋白中）又稱β-彎曲，β-回折或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。指蛋白質(zhì)的多肽鏈在形成空間構(gòu)象時經(jīng)常會出現(xiàn)180。的回折，回折處的結(jié)構(gòu)就稱為β-轉(zhuǎn)角。一般由四個連續(xù)的氨基酸組成，第一個氨基酸的羧基與第四個氨基酸的氨基形成氫鍵。主要存在于球狀蛋白分子中。結(jié)構(gòu)如圖所示

無規(guī)則卷曲

沒有一定規(guī)律的松散肽鏈結(jié)構(gòu)，但仍是緊密有序的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，通過主鏈間及主鏈與側(cè)鏈間氫鍵維持其構(gòu)象．不同的蛋白質(zhì)，自由回轉(zhuǎn)的數(shù)量和形式各不相同．分兩類：①緊密環(huán)②連接條帶β-折迭β-轉(zhuǎn)角無規(guī)卷曲RNase的分子結(jié)構(gòu)α-螺旋5.超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域M.Rossmann于1973年提出來的超二級結(jié)構(gòu)（Super-secondarystructure）的概念：在許多蛋白質(zhì)中，由兩個或三個具有二級結(jié)構(gòu)的肽段在空間上相互靠近，形成有規(guī)則的、在空間上能辨認(rèn)的二級結(jié)構(gòu)組合體的特殊空間構(gòu)象被稱為模序或超二級結(jié)構(gòu)。它們可以作為三級結(jié)構(gòu)的“建筑塊”或結(jié)構(gòu)域的組成單位，是蛋白質(zhì)發(fā)揮特定功能的基礎(chǔ)?；窘M合方式：αα、ββ、βαβαβ等βαβααβββ超二級結(jié)構(gòu)的主要類型βαβ在蛋白質(zhì)中(Rossmann折疊)結(jié)構(gòu)域（structuredomain）或域結(jié)構(gòu)

域結(jié)構(gòu)是在較大的蛋白質(zhì)分子中所形成的兩個或多個在空間上可明顯區(qū)別的局部區(qū)域。在二級結(jié)構(gòu)或超二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，多肽進(jìn)一步卷曲折疊成幾個相對獨立、近似球形的三維實體，再由兩個或兩個以上這樣的三維實體締合成三級結(jié)構(gòu)，這種相對獨立的三維實體稱為結(jié)構(gòu)域。卵溶菌酶的三級結(jié)構(gòu)中的兩個結(jié)構(gòu)域-螺旋-轉(zhuǎn)角-折疊二硫鍵結(jié)構(gòu)域1結(jié)構(gòu)域2單結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)及三級結(jié)構(gòu)不相似的結(jié)構(gòu)域木瓜蛋白酶結(jié)構(gòu)域ⅠⅡ相似的結(jié)構(gòu)域硫氰酶結(jié)構(gòu)域1、2域結(jié)構(gòu)（domain，結(jié)構(gòu)域）：結(jié)構(gòu)域與分子整體以共價鍵相連具有相對獨立的空間構(gòu)象和生物學(xué)功能同一蛋白質(zhì)中的結(jié)構(gòu)域可以相同或不同，不同蛋白質(zhì)中的結(jié)構(gòu)域也可能相同或不同

形成意義：

動力學(xué)上更為合理

蛋白質(zhì)（酶）活性部位往往位于結(jié)構(gòu)域之間，使其更具柔性蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)

三級結(jié)構(gòu)—指多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)、超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)上，主鏈構(gòu)象和側(cè)鏈構(gòu)象相互作用，進(jìn)一步盤繞折疊形成的特定的空間構(gòu)象。其實質(zhì)就是一條多肽鏈中所有原子在三維空間的整體排布，是包括主、側(cè)鏈在內(nèi)的空間排列。大多數(shù)蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)為球狀或近似球狀。在三級結(jié)構(gòu)中，大多數(shù)的親水的R側(cè)基分布于球形結(jié)構(gòu)的表面，而疏水的R側(cè)基分布于球形結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，形成疏水的核心。肌紅蛋白三級結(jié)構(gòu)N

His12CHis119Lys41核糖核酸酶三級結(jié)構(gòu)示意圖

三級結(jié)構(gòu)形成后，生物學(xué)活性必需基團(tuán)靠近，形成活性中心或部位，即蛋白質(zhì)分子表面形成了某些發(fā)揮生物學(xué)功能的特定區(qū)域。次級鍵：氫鍵、離子鍵（鹽鍵）、疏水的相互作用（疏水）、范德華力、配位鍵共價鍵：二硫鍵、酯鍵維系蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的作用力（化學(xué)鍵）疏水作用力—

是疏水基團(tuán)（非極性側(cè)鏈）在極性溶劑中（水中）為避開水相而彼此靠近形成一種作用力。三級結(jié)構(gòu)小結(jié)：長度縮短：球形、橢球形、桿狀等。多數(shù)同時含有α－螺旋和β－折疊結(jié)構(gòu)氨基酸位置由側(cè)鏈極性決定：非極性（內(nèi)）、極性（表面，少數(shù)內(nèi)）、帶電（表面）主要以次級鍵維系功能區(qū)：表面或特定部位四級結(jié)構(gòu)—二個或二個以上具有獨立的三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈（亞基），彼此借次級鍵相連，形成一定的空間結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)血紅蛋白結(jié)構(gòu)如圖所示什么是亞基？

亞基——蛋白質(zhì)分子中的最小共價單位。一般由一條肽鏈組成，具有獨立的一、二、三級結(jié)構(gòu)，也有由幾條肽鏈組成（肽鏈間由二硫鍵連接），亞基與亞基間以非共價鍵（主要是疏水作用力）連接,亞基單獨存在時一般無生物活性，亞基可以相同也可以不同。球狀蛋白三維結(jié)構(gòu)的特征1.球狀蛋白分子含有多種二級結(jié)構(gòu)元件2.球狀蛋白具有明顯的折疊層次3.球狀蛋白分子為緊密的球狀或橢球狀實體4.球狀蛋白的大部分疏水側(cè)鏈埋藏在分子內(nèi)部，親水側(cè)鏈暴露在分子的表面5.球狀分子的表面有溝穴（功能區(qū)）。

維系四級結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵：次級鍵（氫鍵、離子鍵、疏水作用力、范德華力）。維系蛋白質(zhì)各級結(jié)構(gòu)及主要化學(xué)鍵共價鍵次級鍵化學(xué)鍵

肽鍵一級結(jié)構(gòu)氫鍵二硫鍵二、三、四級結(jié)構(gòu)疏水鍵鹽鍵范德華力三、四級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)

一級結(jié)構(gòu)→二級結(jié)構(gòu)→超二級結(jié)構(gòu)→結(jié)構(gòu)域→三級結(jié)構(gòu)→亞基→四級結(jié)構(gòu)作用力

破壞因子氫鍵：α-螺旋，β-折疊尿素，鹽酸胍疏水作用：形成球蛋白的核心去垢劑，有機(jī)溶劑VanderWaals力：穩(wěn)定緊密堆積的集團(tuán)和原子離子鍵：穩(wěn)定α-螺旋，三、四級結(jié)構(gòu)酸、堿二硫鍵：穩(wěn)定三級結(jié)構(gòu)還原劑配位鍵：與金屬離子的結(jié)合螯合劑

EDTA

維持蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的作用力及破壞因子H2NC(:NH)NH2HCl蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與高級結(jié)構(gòu)的關(guān)系⒈一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)

RNase是由124氨基酸殘基組成的單肽鏈，分子中

8個Cys的-SH構(gòu)成4對二硫鍵，形成具有一定空間構(gòu)象的蛋白質(zhì)分子。一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能二、蛋白質(zhì)高級構(gòu)象與功能

蛋白質(zhì)復(fù)雜的組成和結(jié)構(gòu)是其多種多樣生物學(xué)功能的基礎(chǔ)；而蛋白質(zhì)獨特的性質(zhì)和功能則是其結(jié)構(gòu)的反映。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)包含了其分子的所有信息，并決定其高級結(jié)構(gòu)，高級結(jié)構(gòu)和其功能密切相關(guān)。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（一）蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系1.蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的種屬差異和同源性實例：胰島素、細(xì)胞色素C2、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的變異與分子病實例：血紅蛋白質(zhì)異常病變鐮刀型貧血病

3、蛋白質(zhì)前體的激活與一級結(jié)構(gòu)

實例：胰島素原的激活一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)，也決定蛋白質(zhì)的功能一級結(jié)構(gòu)相似，高級結(jié)構(gòu)相似，功能相同。保守序列決定空間結(jié)構(gòu)。一級結(jié)構(gòu)改變，高級結(jié)構(gòu)改變功能改變

高級構(gòu)象決定蛋白質(zhì)的功能

1、蛋白質(zhì)高級構(gòu)象破壞，功能喪失

實例：核糖核酸酶的變性與復(fù)性2、蛋白質(zhì)在表現(xiàn)生物功能時，構(gòu)象發(fā)生一定變化（變構(gòu)效應(yīng)）

實例：血紅蛋白的變構(gòu)效應(yīng)和輸氧功能蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系：結(jié)構(gòu)決定功能同功能蛋白質(zhì)的種屬特異性與一級結(jié)構(gòu)的關(guān)系胰島素一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系胰島素的來源和功能：A鏈21個氨基酸B鏈30個氨基酸結(jié)構(gòu)特點：兩條鏈：共51個氨基酸三對二硫鍵：鏈間兩個，鏈內(nèi)一個。并在此基礎(chǔ)上形成定的空間構(gòu)象細(xì)胞色素C與分子進(jìn)化細(xì)胞色素C的存在：細(xì)胞色素C廣泛存在與一切需要氧生物細(xì)胞的線粒體中，是一種包含一個血紅素的單鏈蛋白質(zhì)功能：在呼吸鏈中起傳遞電子的作用結(jié)構(gòu)特點：都是由一條肽鏈組成，含有鐵卟啉環(huán)絕大多數(shù)含有104個氨基酸，三級結(jié)構(gòu)相似。與功能密切相關(guān)的35個氨基酸和14，17位半胱氨酸，18位組氨酸，

48位酪氨酸，59位色氨酸，80位甲硫氨酸的位置始終不變60個物種中，有27個位置上的氨基酸殘基完全不變，是維持其構(gòu)象中發(fā)揮特有功能所必要的部位，屬于不變殘基.可變殘基可能隨著進(jìn)化而變異，而且不同種屬的細(xì)胞色素C氨基酸差異數(shù)與種屬之間的親緣關(guān)系相關(guān)。親緣關(guān)系相近者，氨基酸差異少，反之則多（進(jìn)化樹）.不同生物與人的Cytc的AA差異數(shù)目生物與人不同的AA數(shù)目黑猩猩0恒河猴1兔9袋鼠10牛、豬、羊、狗11馬12雞、火雞13響尾蛇14海龜15金槍魚21角餃23小蠅25蛾31小麥35粗早鏈孢霉43酵母44

不同生物來源的細(xì)胞色素c中不變的AA殘基

14106100134323029271817675952514845413887848280706891GlyGlyPheCysGlyGlyGlyArgLysGlyCysLysPheHisProLeuGlyArgTyrAlaAsnTrpTyr707580LysLysLysProProTyrIleGlyThrMetAsnLeu血紅素細(xì)胞色素c分子的空間結(jié)構(gòu)不變的AA殘基

35個不變的AA殘基，是CytC的生物功能所不可缺少的。其中有的可能參加維持分子構(gòu)象；有的可能參與電子傳遞；有的可能參與“識別”并結(jié)合細(xì)胞色素還原酶和氧化酶。蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)改變與分子病

分子病——由于基因結(jié)構(gòu)改變，蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中的關(guān)鍵氨基酸發(fā)生改變，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能障礙，出現(xiàn)相應(yīng)臨床癥狀的遺傳病。例:鐮形細(xì)胞貧血癥：蛋白質(zhì)上一個氨基酸改變所引起的嚴(yán)重疾病。-鏈N端氨基酸排列順序12345678

Hb-A（正常人）Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys…Hb-S（患者）Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys…鐮刀型貧血癥，它是由于血紅蛋白的β-亞基上的氨基酸發(fā)生了變化，導(dǎo)致血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的改變，其運輸氧氣的能力大大地降低，并且紅細(xì)胞呈鐮刀狀。Hb-A）第6位殘基是極性谷氨酸殘基，Hb-S）中換成了非極性的纈氨酸殘基使血紅蛋白細(xì)胞收縮成鐮刀形，輸氧能力下降，易發(fā)生溶血這說明了蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的高度統(tǒng)一性血紅蛋白S線性締合的分子基礎(chǔ)6條脫氧HbS纖維狀纏繞成長管狀結(jié)構(gòu)脫氧HbS聚集成纖維狀結(jié)構(gòu)EF-拐彎Val6

血紅蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生相應(yīng)改變，在表面形成互補區(qū)，使蛋白質(zhì)分子之間彼此聚合，促使紅細(xì)胞在低氧壓下變形成鐮形，喪失運輸氧的生物活性。3.前體與活性蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的關(guān)系

由108個氨基酸殘基構(gòu)成的前胰島素原pre-proinsulin），在合成的時候完全沒有活性，當(dāng)切去N-端的24個氨基酸信號肽，形成84個氨基酸的胰島素原（proinsulin），胰島素原也沒活性，在包裝分泌時，A、B鏈之間的33個氨基酸殘基被切除，才形成具有活性的胰島素。蛋白質(zhì)前體（無活性）激活作用活性蛋白質(zhì)核糖核酸酶變性與復(fù)性作用NativeribonucleaseDenativereducedribonucleaseNativeribonuclease8Mureaand-mercapotoethanolDialysis變性復(fù)性蛋白質(zhì)的變構(gòu)現(xiàn)象：蛋白質(zhì)在表現(xiàn)生物功能時，構(gòu)象發(fā)生了一定變化。變構(gòu)現(xiàn)象：當(dāng)某種小分子物質(zhì)（變構(gòu)劑）在不同的生理過程中與蛋白質(zhì)分子某一亞基或某一部位特異結(jié)合引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變從而導(dǎo)致其功能改變的現(xiàn)象。變構(gòu)作用：含亞單位的蛋白質(zhì)由于一個亞單位的構(gòu)象改變而引起其余亞單位和整個分子構(gòu)象和功能發(fā)生改變的作用。

Mb和Hb的輔基—血紅素血紅素(heme)氧合肌紅蛋白中血紅素Fe2+的六個配體d2sp3第5個部位來自蛋白的第93位His血紅蛋白輸氧功能和構(gòu)象變化O2HbHb-O2O2血紅蛋白和肌紅蛋白的氧合曲線活動肌肉毛細(xì)血管中的PO2020406080100肺泡中的PO2MyoglobinHemoglobin血紅蛋白輸氧功能和構(gòu)象變化O2HbHb-O2O2血紅蛋白和肌紅蛋白的氧合曲線活動肌肉毛細(xì)血管中的PO2020406080100肺泡中的PO2MyoglobinHemoglobin氧合過程中血紅素鐵原子的變化氧合過程中鐵原子位移引發(fā)的構(gòu)象改變O2F8Histidine空間排斥FemeFHelixFemeFeF8HistidineO2

Fe2+移動時，拖動HisF8殘基,并進(jìn)而引起螺旋F和拐彎EF和FG的位移。這些移動傳遞到亞基的界面，引發(fā)構(gòu)象的重調(diào)，導(dǎo)致四級結(jié)構(gòu)的改變。（TR）EFFG不結(jié)合氧時，F(xiàn)e突出平面結(jié)合氧時，F(xiàn)e被拉回平面血紅蛋白四級結(jié)構(gòu)的滑動變化

血紅蛋白和肌紅蛋白都能結(jié)合氧，氧都是結(jié)合在分子中的血紅素輔基上。血紅蛋白是個四聚體分子，可以轉(zhuǎn)運氧，其氧合曲線是S形的；肌紅蛋白是個單體，只貯存氧，并且可以使氧在肌肉內(nèi)很容易地擴(kuò)散，其氧合曲線是雙曲線形的。肌紅蛋白和血紅蛋白的生理功能依賴于與輔基可逆地結(jié)合氧，結(jié)合氧的情況可以通過氧結(jié)合曲線看出。2,3BPG是血紅蛋白的別構(gòu)效應(yīng)劑，一分子血紅蛋白只有一分子2,3BPG，位于由四個亞基締合形成的中央孔穴內(nèi)。2,3BPG將兩個鏈交聯(lián)在一起，有助于去氧血紅蛋白的構(gòu)象，促進(jìn)氧的釋放。2,3－BPG的作用

2,3-二磷酸-D-甘油酸（2,3BPG）對血紅蛋白氧合曲線的影響

肺中pO2（海平面）

肺中pO2(高原4500米)組織中pO2氧飽和度

當(dāng)人從海平面上到4500米高原后兩天內(nèi)，

2,3BPG的濃度有原來的5mM增加到8mM，結(jié)果對組織的供氧量又恢復(fù)到接近正常水平（0.38）。如果BPG仍維持5mM水平，對組織的供氧量將減少四分之一，為0.30。

2,3-二磷酸-D-甘油酸（2,3BPG）是紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白的別構(gòu)效應(yīng)劑。

2,3BPG的存在，可使氧與全血中成熟的血紅蛋白結(jié)合的P50大約提高到26torr。換言之，紅細(xì)胞中的2,3BPG實質(zhì)上是降低了脫氧血紅蛋白對氧的親和性。在紅細(xì)胞中，2,3BPG與血紅蛋白的濃度幾乎是等摩爾的。

氧結(jié)合血紅蛋白的另外調(diào)節(jié)作用涉及到二氧化碳和質(zhì)子，二者都是有氧代謝的產(chǎn)物。CO2能降低血紅蛋白對氧的親和性。在紅細(xì)胞內(nèi)碳酸酐酶催化CO2生成一個碳酸（H2CO3），碳酸容易解離形成碳酸氫根離子和一個質(zhì)子：

CO2＋H2O＝H＋＋HCO3－結(jié)果使得細(xì)胞內(nèi)的pH降低。低pH導(dǎo)致血紅蛋白中的幾個基團(tuán)的質(zhì)子化，質(zhì)子化的基團(tuán)可以形成有助于脫氧構(gòu)象穩(wěn)定的離子對。

CO2濃度增加以及相應(yīng)的pH降低使得血紅蛋白的P50升高，這一現(xiàn)象稱之波耳效應(yīng)（Bohreffect），它提高了氧轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的效率。在肺部，CO2水平低，氧很容易被血紅蛋白占有，同時釋放出質(zhì)子；而在代謝的組織中，CO2水平相對來說比較高，pH較低，O2容易從氧合血紅蛋白中卸載。

波耳效應(yīng)（Bohreffect）pH對氧飽和曲線的影響

蛋白質(zhì)的性質(zhì)1.蛋白質(zhì)的大小及分子量2.蛋白質(zhì)的兩性性質(zhì)與等電點3.蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性4.蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與沉淀反應(yīng)5.蛋白質(zhì)的紫外吸收性質(zhì)6.蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)蛋白質(zhì)的大小及分子量蛋白質(zhì)的分子大?。旱鞍踪|(zhì)是分子量很大的生物分子，相對分子質(zhì)量大于10000.最高可達(dá)40000000（煙草花葉病毒）．蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定方法根據(jù)化學(xué)成分測定最小相對分子質(zhì)量超離心法凝膠過濾法SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法一.蛋白質(zhì)的分子大小蛋白質(zhì)是分子量很大的生物分子，相對分子質(zhì)量大于10000.最高可達(dá)40000000（煙草花葉病毒）．

蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定方法1.根據(jù)化學(xué)成分測定最小相對分子質(zhì)量此法首先利用化學(xué)分析方法測定蛋白質(zhì)分子中某一特殊成分的百分含量然后，假定蛋白質(zhì)分子中該成分只有一個，據(jù)其百分含量可計算出最低相對分子質(zhì)量：最小相對分子質(zhì)量＝（已知成分的相對分子、原子質(zhì)量）/已知成分的百分含量如果蛋白質(zhì)分子中所含已知成分不是一個單位，則真實相對分子質(zhì)量等于最小相對分子質(zhì)量的倍數(shù)。2.

超離心法在60000～80000r/min的高速離心力作用下，蛋白質(zhì)分子會沿旋轉(zhuǎn)中心向外周方向移動用光學(xué)方法測定界面移動的速度即為蛋白質(zhì)的離心沉降速度蛋白質(zhì)的沉降速度與分子大小和形狀有關(guān)蛋白質(zhì)的大小及分子量沉降系數(shù)是溶質(zhì)顆粒在單位離心場中的沉降速度，用S表示。一個S單位，為1×10-13秒相對分子質(zhì)量越大，S值越大蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)：1～200S

由沉降系數(shù)S可根據(jù)斯維得貝格〔Svedberg〕方程計算蛋白質(zhì)分子的相對分子質(zhì)量：

M=RST/D〔1－iρ〕R：氣體常數(shù)T：絕對溫度

D：擴(kuò)散系數(shù)ρ：溶劑的密度3.凝膠過濾法凝膠過濾所用介質(zhì)為凝膠珠，其內(nèi)部為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)一定型號的凝膠網(wǎng)孔大小一定，只允許相應(yīng)大小的分子進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，大分子則被排阻在外洗脫時大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來，洗脫液體積小；小分子在顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中穿來穿去，歷程長，后洗脫下來，洗脫體積大測定蛋白質(zhì)分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex測得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的洗脫體積〔Ve〕以相對分子質(zhì)量對數(shù)（logM）對Ve作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線再測出未知樣品洗脫體積〔Ve〕從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出樣品蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量4.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法SDS:十二烷基硫酸鈉，變性劑普通蛋白質(zhì)電泳的泳動速率取決于荷質(zhì)比（凈電荷、大小、形狀）用SDS和巰基乙醇（打開二硫鍵）處理蛋白質(zhì)變性（肽鏈伸展）并與SDS結(jié)合，形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物不同蛋白質(zhì)分子的均帶負(fù)電（SDS帶負(fù)電）；且荷質(zhì)比相同（蛋白質(zhì)分子大，結(jié)合SDS多；分子小，結(jié)合SDS少）不同蛋白質(zhì)分子具有相似的構(gòu)象用幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的對數(shù)值對它們的遷移率作圖測出待測樣品的遷移率從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)的多肽鏈含有末端氨基和羧基，一些側(cè)鏈上含有可解離的基團(tuán)，有的可以接受氫離子，有的可以電離出氫離子，因此蛋白質(zhì)具有酸堿兩性電離的性質(zhì)。對某一蛋白質(zhì)而言，在某一pH下，當(dāng)它所帶正負(fù)電荷相等的時候，該溶液的pH就稱為該蛋白質(zhì)的等電點。蛋白質(zhì)的等電點的大小與蛋白質(zhì)的氨基酸組成有關(guān)。蛋白質(zhì)的兩性性質(zhì)與等電點PrNH3+COOHPrNH3+COO-PrNH2COO-+OH-+OH-+H++H+PH＜ＰIPH=ＰIPH＞ＰI靜電荷為正靜電荷為零靜電荷為負(fù)利用蛋白質(zhì)的兩性解離可以通過電泳分離純化蛋白質(zhì)。（1）膠體性質(zhì)（親水膠體性質(zhì)）溶液：真溶液溶質(zhì)顆粒直徑〈1nm

膠體溶液溶質(zhì)顆粒直徑1nm~100nm

懸濁液溶質(zhì)顆粒直徑〉100nm蛋白質(zhì)在溶液中的顆粒直徑范圍在2nm~100nm蛋白質(zhì)是一種親水膠體蛋白質(zhì)在水溶液中得以穩(wěn)定存在的主要因素：①.水化膜—蛋白質(zhì)表面的親水基團(tuán)與水分子以非共價鍵結(jié)合在蛋白質(zhì)分子周圍形成的一層水膜。②分子間的靜電排斥力—在同一溶液中（PH相同），同種蛋白質(zhì)所帶靜電荷相同，彼此產(chǎn)生靜電排斥力。蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與沉淀反應(yīng)蛋白質(zhì)具有膠體性質(zhì)，如布朗運動、光散射、電泳、不能透過半透膜及具有吸附能力等。＋溶液中蛋白質(zhì)的聚沉帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒＋＋＋＋＋＋＋－－－－－－－－帶正電荷的蛋白質(zhì)在等電點的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)＋＋＋＋＋＋＋＋－－－－－－－－水化膜OH-H+OH-OH-OH-H+H+H+蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性蛋白質(zhì)變性的概念：天然蛋白質(zhì)受物理或化學(xué)因素（變性因素）的影響后，高級結(jié)構(gòu)（分子構(gòu)象）被破壞,一級結(jié)構(gòu)不變,導(dǎo)致使其理化性質(zhì)的改變和生物學(xué)功能的喪失的現(xiàn)象。使蛋白質(zhì)的變性因素：1）物理因素：高溫、高壓、紫外線、X-射線、超聲波、劇烈攪拌等

2）化學(xué)因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑、去污劑及重金屬鹽等變性的本質(zhì)：分子中各種次級鍵斷裂，使其空間構(gòu)象從緊密有序的狀態(tài)變成松散無序的狀態(tài)，一級結(jié)構(gòu)不破壞。

蛋白質(zhì)變性后出現(xiàn)的特征：

結(jié)晶性能和生物學(xué)功能喪失一些物理性質(zhì)發(fā)生改變：溶解度、擴(kuò)散速度、滲透壓下降，黏度增加，易絮凝沉淀一些側(cè)鏈基團(tuán)暴露而導(dǎo)致某些化學(xué)反應(yīng)發(fā)生并出現(xiàn)光譜變化生物化學(xué)性質(zhì)改變:變性蛋白分子松散且伸展，肽鍵暴露易被蛋白酶作用蛋白質(zhì)變性的應(yīng)用：利用變性：酒精消毒；高壓滅菌等防止變性：低溫保存生物制品取代變性：乳品解毒（急救重金屬中毒）變性不可逆變性可逆變性復(fù)性：某些變性蛋白質(zhì)（三維結(jié)構(gòu)破壞不嚴(yán)重），當(dāng)除去變性因素后，蛋白質(zhì)分子的高級結(jié)構(gòu)和功能得以部分或完全恢復(fù)的現(xiàn)象。不可逆變性：三維結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重），即使除去變性因素后，蛋白質(zhì)分子的高級結(jié)構(gòu)和功能也難以恢復(fù)的現(xiàn)象。大多蛋白質(zhì)變性后，很難復(fù)性

使蛋白質(zhì)從溶液中析出的現(xiàn)象稱為沉淀，方法有：1.

鹽析：在蛋白質(zhì)的水溶液中，加入大量高濃度的強(qiáng)電解質(zhì)鹽如硫酸胺、氯化鈉、硫酸鈉等，使蛋白質(zhì)從溶液中析出，稱為蛋白質(zhì)的鹽析。而低濃度的鹽溶液加入蛋白質(zhì)溶液中，會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度增加，該現(xiàn)象稱為鹽溶。鹽析的機(jī)理：破壞蛋白質(zhì)的水化膜，中和表面的凈電荷。2.

有機(jī)溶劑沉淀法：在蛋白質(zhì)溶液中，加入能與水互溶的有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等，蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀。有機(jī)溶劑沉淀法的機(jī)理：破壞蛋白質(zhì)的水化膜。有機(jī)溶液沉淀蛋白質(zhì)通常在低溫條件下進(jìn)行，否則有機(jī)溶劑與水互溶產(chǎn)生的溶解熱會使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。

蛋白質(zhì)的沉淀作用3.重金屬鹽沉淀（條件：pH稍大于pI為宜）：在蛋白質(zhì)溶液中加入重金屬鹽溶液，會使蛋白質(zhì)沉淀。重金屬沉淀法的機(jī)理：重金屬鹽加入之后，與帶負(fù)電的羧基結(jié)合。4.生物堿試劑沉淀法（條件：pH稍小于pI）生物堿是植物組織中具有顯著生理作用的一類含氮的堿性物質(zhì)。能夠沉淀生物堿的試劑稱為生物堿試劑。生物堿試劑一般為弱酸性物質(zhì)，如單寧酸、苦味酸、三氯乙酸等。生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)的機(jī)理：在酸性條件下，蛋白質(zhì)帶正電，可以與生物堿試劑的酸根離子結(jié)合而產(chǎn)生沉淀。5.弱酸或弱堿沉淀法：蛋白質(zhì)的紫外吸收性質(zhì)

大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。這三種氨基酸的在280nm附近有最大吸收。因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm附近顯示強(qiáng)的吸收。利用這個性質(zhì)，可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行定性鑒定。蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)主要與其定性、定量測定有關(guān)：

1.雙縮脲反應(yīng)：兩分子雙縮脲與堿性硫酸銅作用，生成粉紅色的復(fù)合物含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物，能發(fā)生同樣的反應(yīng)肽鍵的反應(yīng)，肽鍵越多顏色越深受蛋白質(zhì)特異性影響小蛋白質(zhì)定量測定；測定蛋白質(zhì)水解程度2.米倫氏反應(yīng)酪氨酸的顯色反應(yīng)（酚羥基反應(yīng)）米倫試劑為硝酸、亞硝酸、硝酸汞、亞硝酸汞的混合物蛋白溶液中，加入米倫試劑，產(chǎn)生白色沉淀，加熱后變成紅色蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)3.乙醛酸反應(yīng)在蛋白質(zhì)溶液中加入HCOCOOH，將濃硫酸沿管壁緩慢加入，不使相混，在液面交界處，即有紫色環(huán)形成色氨酸的反應(yīng)（吲哚環(huán)的反應(yīng)）鑒定蛋白質(zhì)中是否含有色氨酸明膠中不含色氨酸4.坂口反應(yīng)精氨酸的反應(yīng)（胍基的反應(yīng)）精氨酸與α-萘酚在堿性次氯酸鈉（或次溴酸鈉）溶液中發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生紅色產(chǎn)物鑒定蛋白質(zhì)中是否含有精氨酸定量測定精氨酸5.福林試劑反應(yīng)酪氨酸、色氨酸的反應(yīng)（還原反應(yīng)）福林試劑：磷鉬酸-磷鎢酸與雙縮脲法結(jié)合Lowry法在堿性條件下，蛋白質(zhì)與硫酸銅發(fā)生反應(yīng)蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物，將福林試劑還原，產(chǎn)生磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物靈敏度提高100倍6.茚三酮反應(yīng)：靈敏度差7.黃蛋白反應(yīng)濃硝酸與酪氨酸、色氨酸的反應(yīng)生成黃色化合物指甲、皮膚、毛發(fā)8.考馬斯亮藍(lán)G-250本身為紅色，與蛋白質(zhì)反應(yīng)呈藍(lán)色與蛋白的親和力強(qiáng)，靈敏度高11000微克/毫升七、蛋白質(zhì)的分類主要的兩種分類法：按形狀分：球狀蛋白和纖維狀蛋白。按組成分：單純蛋白和結(jié)合蛋白。

單純蛋白——僅由氨基酸組成的蛋白質(zhì)。分為7類：清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白、精蛋白、組蛋白、硬蛋白。

結(jié)合蛋白——由氨基酸和其它成分共同組成的蛋白質(zhì)。分為6類：糖蛋白、脂蛋白、核蛋白、色蛋白、磷蛋白、金屬蛋白。1、分離純化的意義從生物材料中分離制備蛋白質(zhì)、研究其結(jié)構(gòu)與功能，對于了解生命活動的規(guī)律，闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)有重大意義。工業(yè)生產(chǎn)的需要：食品、發(fā)酵、紡織、制革等工業(yè)，需要大量的高活性的酶制劑。如用淀粉酶制造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿等。醫(yī)療的需要：如用豬胰島素治療糖尿病?；蚬こ痰男枰?/p>

八、蛋白質(zhì)的分離純化與鑒定

2、分離純化的要求純度：主要取決于研究的目的和應(yīng)用上的要求。活性：要求大分子保持天然構(gòu)象狀態(tài)，有高度的生物活性。收率：希望收率越高越好，但在分離純化過程中總有不少損失。而且提純步驟越多，損失越大。3、分離純化的一般程序生物大分子的分離純化一般可分為以下幾個階段：①材料的選擇和預(yù)處理②破碎細(xì)胞及提?。ㄓ袝r還需要進(jìn)行細(xì)胞器的分離）③分離純化：包括粗分級分離和細(xì)分級分離其中前兩個階段為生物大分子分離純化的前處理。

蛋白質(zhì)分離純化的一般步驟和原則

層析法電泳法超離心法透析和超濾鹽析等點電沉淀有機(jī)溶劑沉淀離心│←前處理→│←粗分級→│←細(xì)分級→│材料選擇與處理細(xì)胞破碎（機(jī)械破碎、溶賬和自溶、酶解、化學(xué)處理）生物組織→→提取液→

→粗產(chǎn)品→→結(jié)晶分子大小溶解度電荷性質(zhì)吸附性質(zhì)生物親和力依據(jù)原理

蛋白質(zhì)分離純化的前處理材料的選擇與預(yù)處理選擇材料主要根據(jù)實驗?zāi)康亩āＲ话氵x擇含量高、來源豐富、易獲得的生物材料預(yù)處理：去除不需要的組織和成分。必須盡可能保持材料的新鮮，盡快加工處理。若不立即進(jìn)行實驗或加工，應(yīng)冷凍保存。細(xì)胞的破碎分離提取某一生物大分子，首先要求生物大分子從原來的組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來，并保持原來的天然狀態(tài)，不丟生物活性。因此應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞破碎。但若材料是體液（如血）或生物體分泌到體外的分泌物，則不必進(jìn)行組織細(xì)胞的破碎。一般動物組織和細(xì)胞可用電動搗碎機(jī)或勻漿器破碎或用超聲波處理破碎。植物組織和細(xì)胞一般常用與石英砂和適當(dāng)?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ㄆ扑榛蛴美w維素酶處理也能達(dá)到目的。細(xì)菌細(xì)胞的破碎比較困難，破碎的方法常有超聲波震蕩、與石英砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理（以分解肽聚糖）。細(xì)胞的破碎

蛋白質(zhì)（酶）的提取蛋白質(zhì)的提取一般以水溶液提取為主。通常采用類似生理條件下的緩沖液，如20-50mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH7.0-7.5）或0.1mol/LTris-HCl（pH7.5-8.0）緩沖液作提取液。對于一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性較多的蛋白質(zhì)和酶，不溶于水、稀鹽、稀