熒光定量PCR技術原理及應用

熒光定量PCR技術原理及應用

REAL-TIMEPCR高冬妮PCR產物的積累是按照2n指數(shù)擴增。PCR后借助電泳對擴增反應的終產物進行定量及定性分析。常規(guī)PCR的局限性：◆只能對終產物進行分析，無法對起始模板準確定量；◆必需借助電泳方法分析，費時費事而且EB有毒；◆無法對擴增反應實時檢測。RT-PCR熒光探針雜交技術PCR技術熒光定量PCR熒光WhatisReal-TimePCR?

熒光實時定量PCR技術的產生

1992年由Higuchi等人第一次報告：使用EB加入PCR反應體系，經改裝的帶有冷CCD的PCR儀檢測樣品的熒光強度。核酸?熒光染料后來用與雙鏈DNA有更強結合力的SYBRGreenI

取代EB.WhatisReal-TimePCR?WhatisReal-TimePCR?所謂實時熒光定量PCR就是通過對PCR擴增反應中每一個循環(huán)產物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量和定性分析。在實時熒光定量PCR反應中，引入一種熒光化學物質，隨著PCR反應的進行，產物不斷積累，熒光信號強度也等比增加。通過檢測熒光強度的變化，我們就可以得到熒光擴增曲線。①樣品處理③瓊脂糖電泳③PCR反應中實時檢測④EB染色④自動數(shù)據(jù)分析②熒光染料②常規(guī)PCR⑤⑥人工數(shù)據(jù)分析熒光定量PCR與普通PCR的比較●實時熒光定量PCR三個關鍵詞：

實時熒光定量●如何實時檢測借助熒光物質示蹤擴增產物量的變化。隨著PCR反應的進行，擴增產物不斷積累，熒光信號強度不斷增加。每經過一個循環(huán)，收集一次熒光強度信號，得到一條熒光擴增曲線圖。擴增曲線圖：橫坐標：擴增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標：熒光強度擴增曲線分成三個階段：背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。定量PCR擴增曲線概念Baseline是背景曲線的一段，范圍——從反應開始不久熒光值開始變得穩(wěn)定，直到所有反應管的熒光都將要，但是還未，超出背景。Threshold熒光超過本底，達到可檢測水平時的臨界數(shù)值CTthresholdcycle，臨界循環(huán)數(shù)(熒光信號達到閾值所經過的循環(huán)數(shù)）。threshold橫線與擴增曲線相交，所得交點所對應的循環(huán)數(shù)。

閾值，熒光強度標準如何對起始模板定量?

通過CT值和標準曲線實現(xiàn)對起始模板的定量分析。為什么要用CT值定量？在指數(shù)擴增的開始階段進行檢測，此時樣品間的細小誤差尚未放大，因此該CT值具有極好的重復性。線性關系根據(jù)樣品CT值，就可以計算出樣品中所含的模板量CTLogofDNAconcentration絕對定量用于生成標準曲線的樣品如何設定？含有和待測樣品相同擴增片段的克隆質粒含有和待測樣品相同擴增片段的cDNA紫外分光光度計或熒光酶標測定濃度根據(jù)質?；騝DNA分子量換算成拷貝數(shù)，做系列稀釋病毒感染的定量監(jiān)測

HIV感染后，潛伏期長短和臨床癥狀輕重與血液中的病毒量顯著相關。病毒載量是預測HIV異性戀間傳播風險的主要因素，在HIVRNA水平小于1500個拷貝/mL時的傳播很少發(fā)生。因此，采用熒光定量PCR的方法檢出HIVRNA對臨床有重要的意義。絕對定量分析實時定量PCR檢測HIV絕對定量腫瘤耐藥基因表達的研究

real-timePCR是了解腫瘤耐藥，指導臨床治療策略的有用手段，它能觀測用藥前后腫瘤細胞的耐藥基因mRNA表達變化，從而及時調整治療方案和評價疾病的預后。

相對定量分析內參基因的選擇

特點選擇內參基因內參基因beta-actin、GAPDH、18SrRNA、28SrRNA等--文獻檢索--實驗篩選選擇多個備選內參基因，以備選內參基因的幾何平均數(shù)作為均一化標準

內參基因HousekeepingGene--RNA抽提、反轉錄為cDNA的效率不同，用于定量分析的樣本初始濃度不同。對樣本初始濃度差異進行均一化校正。不同環(huán)境，不同器官、組織、細胞類型之間，表達量相對恒定。2-ΔΔCt法滿足條件：1）內參基因和目標基因的擴增效率接近-正負10%2）內參基因和目標基因的擴增效率基本為90%-110%

相對定量數(shù)據(jù)分析1、目標基因的CT值-內參基因的CT值（ΔCT

）2、待測樣本的ΔCT值-對照樣本的ΔCT值（ΔΔCT

）3、計算表達水平比率：2–ΔΔCT=表達量的變化倍數(shù)2-△△Ct

法

目的基因內參基因目的基因-內參基因△Ct待測樣本-對照樣本△△Ct倍數(shù)值fold2-△△Ct

對照樣本30.48523.6256.8601待測樣本27.02522.664.365-2.4955.63728雙標準曲線法（1）不同基因擴增效率存在差異，用標準曲線來校正擴增效率。（2）比較適合于樣本量不大，但研究的基因較多的客戶。（3）雙標準曲線：內參基因、目標基因

校正模板核酸數(shù)量上的差異Real-timePCR檢測原理◆熒光標記擴增產物，動態(tài)監(jiān)測熒光信號變化非特異性熒光標記：

SYBRGreenI特異性熒光標記：水解探針：

TaqMan非水解探針：Molecularbeacon（分子信標）

RQReporterQuencherRQ

染料法與探針法對比探針法特異性高--探針與特異靶序列結合對模板有選擇性--可進行多重PCR反應成本高--不同靶基因需要合成不同探針

染料法通用性好--對DNA模板沒有選擇性使用方便，成本低--僅需設計兩個引物有假陽性現(xiàn)象--通過融解曲線判斷5’3’5’3’SGSGSGSG5’3’5’3’SGSGSGSGEmissionExcitationSYBRGreenI是一種與雙鏈DNA小溝結合的熒光染料。SYBRGreenI只與雙鏈DNA結合才能發(fā)出熒光。熒光信號的強度與反應體系中所有雙鏈DNA分子成正比。

SYBRGreenI工作原理熔解曲線PCR中，可控制溫度緩慢升高(ie.60octo95oc,0.2oc/sec)雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNASYBRGreenI被釋放，熒光信號消失以熒光信號強度對溫度作圖，即為熔解曲線對熔解曲線求一階導數(shù)，峰值代表TmTm值：50%DNA變成單鏈時的溫度，此溫度與雙鏈DNA的長度、GC含量有關，可部分代表序列的特異性。融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準確非特異性產物非特異性產物進行熔解曲線分析，以判斷退火溫度是否合適，產物中是否有引物二聚體的影響。對于SYBRGreenI，一定要在最后做一步熔解曲線的分析，這對于反應條件的優(yōu)化和結果的正確判定都有著非常重要的作用。RealtimePCR流程樣本處理與RNA提取–cDNA–realtimePCR樣本處理與RNA提取外界刺激

–檢測目的基因的表達改變樣品處理–固定、裂解細胞RNA樣本保存液Trizol

超純RNA提取試劑盒RNA的評價與鑒定

-完整性

-純度小心DNA污染！-使用DNaseⅠ-引物設計

-以RNA作PCR陰性對照

RT-qPCR一步法還是兩步法？兩步法：步驟多但靈活多樣。cDNA可長期保留，檢測多個基因，便于反應條件的優(yōu)化。

推薦：工作的初期階段，以及單個樣本多個靶基因檢測。一步法：簡單、靈敏度高，有效減少實驗操作誤差和污染。每次只能做一個基因。

推薦：工作的成熟階段，以及多個樣本單個靶基因檢測。逆轉錄逆轉錄引物選擇逆轉錄酶SuperRT

逆轉錄酶（RNaseH-）M-MLV逆轉錄酶（RNaseH-）引物特異性反應效率Oligo

dT中低Randomhexmer低中Specificprimer高高引物設計原則

上下游引物間Tm值差小于4℃

避免引物錯誤引發(fā)（特別是3’端與靶基因不配對）

避免引物內和引物間的互補（避免形成發(fā)夾結構和引物二聚體）跨一個或多個內含子設計引物（避免對基因組DNA的擴增）使用Blast檢查引物特異性（/blast)SYBRGreen法

PCR反應的建立SYBRGreen使用濃度:太高抑制Taq酶活性，太低，熒光信號太弱，不易檢測；Primer：引物的特異性高，否則擴增有雜帶，定量不準；MgCl2的濃度：可以降低到1.5mM,以減少非特異性產物；反應溫度和時間參數(shù)：由酶和引物決定；其他與常規(guī)PCR相同。Troubleshooting

常見問題

可能原因

解決方法Housekeepinggene無信號RNA降解用新鮮組織提取RNAHousekeepinggene有信號而目標基因無信號1.目的基因表達低。逆轉錄效率不高2.PCR引物不良1.富集mRNA2.在逆轉錄中嘗試不同引物，如特異引物。3.嘗試不同PCR引物。減小產物大小，改換目標區(qū)段，考慮不同剪接體。4.嘗試不同熱循程序，降低復性溫度。Housekeepinggene反應效率正常,但目標基因放大效率不高PCR引物不良重新設計引物，減小產物大小，改換目標區(qū)段，考慮不同剪接體目標基因表達豐度在樣本之間異常一致RNA被基因組DNA污染使用跨intron

引物用DNase處理RNA確保RNA陰性對照表現(xiàn)陰性溶解曲線出現(xiàn)雜峰出現(xiàn)非特異PCR產物出現(xiàn)引物二聚體嘗試不