生物化學(xué)課件

EnzymeKineticsEnzymeChemistry2Toteachisnottofillavasebuttolightafire(一)中間絡(luò)合物學(xué)說(shuō)酶底物中間絡(luò)合物學(xué)說(shuō)(Henri,1903):某化學(xué)反應(yīng)，酶先和底物結(jié)合形成中間復(fù)合物(ES)，然后再生成產(chǎn)物P和釋放酶E。南通大學(xué)一、化學(xué)動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)（略）二、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響南通大學(xué)

底物濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響一級(jí)反應(yīng)非正比關(guān)系零級(jí)反應(yīng)

在[E]恒定、[S]很低時(shí)，酶未被底物飽和，反應(yīng)速度取決于[S]，呈一級(jí)反應(yīng)；當(dāng)[S]變大，根據(jù)質(zhì)量作用定律，ES生成愈多，反應(yīng)速度取決于ES，呈混合級(jí)反應(yīng)；當(dāng)[S]高時(shí)，酶全被底物飽和，反應(yīng)速度達(dá)最大，[S]的增加不會(huì)引起反應(yīng)速度的增加，呈零級(jí)反應(yīng)。南通大學(xué)（二）酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程米氏方程Michaelis&Menten根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)推導(dǎo)出表示酶促反應(yīng)中底物濃度與反應(yīng)速度關(guān)系的公式，稱~米氏方程：1.米氏方程的推導(dǎo)根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)：①式中K1，K2，K3分別為各反應(yīng)常數(shù)，可知：

ES形成速度＝K1

[E][S]ES分解速度＝(K2＋K3)[ES]當(dāng)反應(yīng)達(dá)恒穩(wěn)態(tài)時(shí)二速度相等，即:K1

[E][S]＝(K2＋K3)[ES]整理后②由于[E]與[ES]之和為總的酶濃度[E0],即:

[E0]＝[E]＋[ES][E]＝[E0]－[ES]③將③代入②整理得④∵酶促反應(yīng)速度由[ES]決定，而v＝K3[ES]⑤將④代入⑤得⑥當(dāng)[S]升高,所有E為S所飽和時(shí),即:

[E0]＝[ES]

此時(shí)達(dá)到最大反應(yīng)速度Vmax＝K3

[E0]⑦將⑦代入⑥得⑧2.Vmax及Km的測(cè)定與意義（1）

KmIfv＝0.5VmaxKm＝[S]Ifv＝0.5VmaxKm＝[S]Km值等于酶促反應(yīng)速度(v)為最大速度(Vm)一半時(shí)的底物濃度，單位為mol/L。（2）（當(dāng)K2

>>K3時(shí)）Km值近似于ES的解離常數(shù)Ks，可表示酶對(duì)底物的親和力，Km與親和力成反比關(guān)系。（3）Km值是酶的特征性常數(shù)之一只與酶的結(jié)構(gòu)、酶催化的底物和反應(yīng)環(huán)境（如溫度、pH、離子強(qiáng)度）有關(guān)，與酶的濃度無(wú)關(guān)。（4）Km值和Vm值的測(cè)定A.雙倒數(shù)作圖法(Lineweaver-Burk)兩邊取倒數(shù)B.Hanes-Woolf作圖法C.酶動(dòng)力學(xué)分析舉例21345678002

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68底物濃度mmole產(chǎn)物濃度806040200S+E↓P(在固定時(shí)間內(nèi)反應(yīng))南通大學(xué)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)操作實(shí)例實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)編號(hào)12340.250.501.02.00.420.720.800.92吸光值v(mmole/min)[S]0.210.360.400.46(1)已知反應(yīng)后呈色的吸光值每0.05吸光有1mmole生成物。(2)酶催化反應(yīng)的時(shí)間為10min。反應(yīng)速率底物濃度反應(yīng)呈色雙倒數(shù)1/S1/v4210.52.081.561.351.16→→→→1.00.50v直接作圖雙倒數(shù)作圖2.01.001/v-4-20241/[S]

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2[S]1.0-3.83.催化常數(shù)Kcat

酶的催化常數(shù)Kcat或轉(zhuǎn)化數(shù)等于每摩爾酶（或酶的每個(gè)活性中心）每秒鐘轉(zhuǎn)換底物（或轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物）的摩爾數(shù)，在數(shù)值上Kcat等于Vmax除以總酶濃度。

Kcat的單位是s－1。Kcat的倒數(shù)是完成一個(gè)催化反應(yīng)所需要的時(shí)間，所以催化常數(shù)可以衡量一個(gè)酶促反應(yīng)的快慢。EnzymeKcat(S-1)Papain10Ribonuclease102Carboxypeptidase102Trypsin102to

103Acetylcholinesterase103Kinases103Dehydrogenases103Transamina103Carbonicanhydrase106Superoxidedismutase106Catalase107Examplesofcatalyticconstants南通大學(xué)三、酶的抑制作用

抑制作用：使酶的活性降低或喪失的現(xiàn)象，稱為酶的抑制作用。抑制劑：能夠引起酶的抑制作用的化合物則稱為抑制劑。酶的抑制劑的特點(diǎn)：

a.在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與被抑制的酶的底物分子或底物的過(guò)渡狀態(tài)相似。

b.能夠與酶的活性中心以非共價(jià)或共價(jià)的方式形成比較穩(wěn)定的復(fù)合體或結(jié)合物。類型：不可逆性抑制作用；可逆性抑制作用（一）不可逆性抑制作用1.概念

抑制劑通常以共價(jià)鍵與酶活性中心上的必需基團(tuán)相結(jié)合，使酶失活（不能用透析、超濾等方法除去）

。2.舉例（4個(gè)例子）例1.青霉素與糖肽轉(zhuǎn)肽酶（Glycopeptide

Transpeptidase，把短肽接到多糖肽骨架）結(jié)合青霉素作用點(diǎn)N-乙酰葡糖胺N-乙酰胞壁酸金黃色葡萄球菌肽多糖五甘氨酸Penicillin

OHSerGlycopeptidetranspeptidase(inactive)OHH–CCCO=CH–NC=ORNCHSCH3CH3COO-H

OSerGlycopeptidetranspeptidase青霉素與糖肽轉(zhuǎn)肽酶結(jié)合，使得后者失去活性南通大學(xué)Penicillin

與酶糖肽轉(zhuǎn)肽酶（GT）活性區(qū)結(jié)合–COO-Cl–Hg–Para-chloro-mercuribenzoicacid(PCMB)對(duì)氯汞苯甲酸E-CH2-SHCysCl-E-CH2-S––COO-Hg–E-CH2-OHSerF-Diisopropyl-fluorophosphate(DIFP)二異丙基氟磷酸鹽

O–CH(CH3)2

F–P=O

O–CH(CH3)2E-CH2-O

O–CH(CH3)2

–P=O

O–CH(CH3)2例2.對(duì)氯汞苯甲酸,二異丙基氟磷酸鹽分別與酶的作用南通大學(xué)

例3.有機(jī)磷化合物—與酶活性直接有關(guān)的絲氨酸上的-OH牢固地結(jié)合，從而抑制某些蛋白酶或酯酶。(DFP、敵百蟲、敵敵畏、農(nóng)藥1605等)。膽堿酯酶+HO-E+HX解磷定XPROR’OO有機(jī)磷化合物有機(jī)磷化合物-膽堿酯酶復(fù)合物PROR’OOO-E＋＋2HCl路易士氣巰基酶失活的酶ClCl-CH＝CH-AsClCl-CH=CH-AsSSE

HSE

HS例4.重金屬離子如有機(jī)汞、有機(jī)砷化合物—與酶蛋白上的-SH作用，從而抑制含-SH酶的活性。2.類型競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用(competitiveinhibition)非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用(petitiveinhibition)反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用(petitiveinhibition)（二）可逆性抑制作用1.概念抑制劑通常以非共價(jià)鍵與酶或酶-底物復(fù)合物可逆性結(jié)合，使酶活性降低或消失。用透析或超濾的方法可去除抑制劑，從而使酶恢復(fù)活性。CompetitivepetitivepetitiveChartMechanismSIEIEISESISEIESI

某些抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)與底物相似，因而能與底物竟?fàn)幣c酶活性中心結(jié)合。當(dāng)抑制劑與活性中心結(jié)合后，底物被排斥在反應(yīng)中心之外，其結(jié)果是酶促反應(yīng)被抑制了。抑制劑與酶活性中心外的必需基團(tuán)結(jié)合,底物與抑制劑之間無(wú)競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,但酶-底物-抑制劑復(fù)合物(ESI)不能進(jìn)一步釋放出產(chǎn)物。抑制劑僅與酶和底物形成的ES結(jié)合，使ES的量下降。既減少?gòu)腅S轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的量，也同時(shí)減少?gòu)腅S解離出E和S的量。三種可逆性抑制作用的比較CompetitivepetitivepetitiveBlottingRaiseskm,VmaxremainsunchangedLowersVmax,kmremainsunchangedLowersVmaxandkm,RatioofVmax/kmremainsunchangedReciprocalblotvoVmaxkmKm’[S]voVmaxKm=Km’[S]voVmaxkmKm’[S]Vmax’Vmax’三種可逆性抑制作用的比較無(wú)抑制劑競(jìng)爭(zhēng)性抑制非競(jìng)爭(zhēng)性抑制反競(jìng)爭(zhēng)性抑制與I結(jié)合的組分EE,ESES表觀KmKm增大不變減小最大速度Vm不變降低降低三種可逆性抑制作用的比較四、溫度，pH，激活劑對(duì)酶反應(yīng)的影響酶活性反應(yīng)溫度溫度對(duì)淀粉酶活性的影響G-6-P酶的pH活性曲線