獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)抗生素類(lèi)

獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)抗生素類(lèi)第一頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日一、氨基糖苷類(lèi)二、四環(huán)素類(lèi)三、氯霉素類(lèi)四、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)五、林可霉素類(lèi)第二頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日一、氨基糖苷類(lèi)抗生素氨基糖苷類(lèi)抗生素是由鏈霉菌或小單孢菌培養(yǎng)液中提取,或以天然品為原料半合成制取而得的一類(lèi)水溶性較強(qiáng)的堿性抗生素。包括鏈霉素、雙氫鏈霉素、新霉素、慶大霉素、卡那毒素、阿米卡星、阿布拉霉素、斑伯霉素、妥布霉素、壯觀霉素等,結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖。由于其分子結(jié)構(gòu)中都有一個(gè)氨基環(huán)醇環(huán)和一個(gè)或多個(gè)氨基糖分子,由配糖鍵相連接,因此最好稱(chēng)為氨基糖苷-氨基環(huán)醇類(lèi)(Aminoglycoside-Aminocyclitol)抗生素,但因氨基糖苷類(lèi)抗生素這一名稱(chēng)沿用已久，故仍用此名。氨基環(huán)醇氨基糖氨基糖第三頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日從抗菌作用的特點(diǎn)看,氨基糖苷類(lèi)是一類(lèi)較優(yōu)良的抗生素,然而,該類(lèi)藥物的治療濃度范圍窄,不良反應(yīng)較常見(jiàn),主要為腎毒性、耳毒性、神經(jīng)肌肉阻滯、造血系統(tǒng)毒性反應(yīng)和過(guò)敏性反應(yīng),其中有些是不可逆毒性。氨基糖苷類(lèi)肌肉注射或靜脈滴注吸收,內(nèi)服后不吸收或很少吸收。與血漿蛋白結(jié)合很少,主要分布在細(xì)胞外液。腎臟皮質(zhì)內(nèi)藥物濃度可超過(guò)血藥濃度10~50倍,也可進(jìn)入內(nèi)耳外淋巴液,其半衰期較血漿半衰期長(zhǎng)5~6倍。氨基糖苷類(lèi)藥物在體內(nèi)幾乎不被代謝，約90%以原形經(jīng)腎小球過(guò)濾排出,尿藥濃度極高,約為血漿峰濃度的25~100倍。靶組織檢測(cè)物第四頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日例如：卡那霉素卡那霉素對(duì)耳毒性、腎毒性的發(fā)生率較高,僅次于新霉素?？敲顾丶∽?1h血藥濃度達(dá)峰值,血漿蛋白結(jié)合率很低。用藥后24h內(nèi)有90%的藥物經(jīng)腎以原形排泄?？敲顾乜赏高^(guò)胎盤(pán)進(jìn)入羊水和胎兒循環(huán)中,在牛奶中可檢測(cè)到。牛、羊、豬肌注,1日5~10mg/kg,分為2次給予,間隔12h,36h后牛奶中觀測(cè)不到卡那霉素殘留,腎臟中藥物滯留期長(zhǎng)。靶組織檢測(cè)物第五頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日鏈霉素、雙氫鏈霉素鏈霉素和雙氫鏈霉素對(duì)腎毒性反應(yīng)稍輕,但可引起神經(jīng)性紊亂,如聽(tīng)力減退、耳鳴或耳部脹滯、眩暈、麻木、針刺感、面部灼傷感;偶可發(fā)生生理力減退、皮疹、乏力、呼吸困難等。鏈霉素和雙氫鏈霉素內(nèi)服吸收差,大部分以原形隨糞便和尿液排出。牛、羊、馬肌注后,血藥濃度于1h達(dá)到峰值。一次肌注有效濃度可維持12h。24h內(nèi),30%~90%的藥物以原形經(jīng)腎排出。注射部位和腎臟中鏈霉素殘留滯留期較長(zhǎng),其他可食部分殘留量低,停藥期不必很長(zhǎng)。乳牛肌注雙氫鏈霉素后不久,乳汁中殘留量很低,在0.05~0.13ng/g間。乳房注入不吸收,藥物滯留期應(yīng)予注意,以免乳汁中殘留超標(biāo)。靶組織第六頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日壯觀霉素、新霉素壯觀霉素毒副作用較小,無(wú)明顯的耳毒性,但可引起肝、腎和血液系統(tǒng)紊亂,偶可發(fā)生過(guò)敏性反應(yīng)。壯觀霉素主要以原形藥物由腎排泄,半衰期約為2.5h。肝和腎中代謝物主要為雙氫壯觀霉素和壯觀霉素。肝和腎中藥物殘留量高,滯留期約15天。新霉素幾乎不被胃腸道吸收,乳腺很少吸收。藥物不經(jīng)胃腸道給予,體內(nèi)藥物生物轉(zhuǎn)化很小。內(nèi)服大部分以原形隨糞便排出,注射吸收迅速,很快隨尿液排出。新霉素在動(dòng)物可食部分、雞蛋、牛奶中藥物滯留期長(zhǎng)應(yīng)予注意。靶組織靶組織第七頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日（一）樣品處理用塑料器皿盛放難以用有機(jī)溶劑提取脫脂除蛋白液液萃取在水相中或加入離子對(duì)試劑進(jìn)入有機(jī)相陽(yáng)離子交換吸附劑進(jìn)行固液萃取與蛋白質(zhì)和脂類(lèi)等混雜較強(qiáng)極性多羥基堿性水溶性不揮發(fā)氨基糖苷類(lèi)抗生素性質(zhì)第八頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日生物樣品預(yù)處理生物樣品預(yù)處理是除去混雜物以免污染色譜柱和干擾氨基糖苷類(lèi)的分離、分析。樣品的預(yù)處理包括脫脂除蛋白、提取、凈化和樣品濃縮。生物樣品中氨基糖苷類(lèi)藥物仍具有水溶性質(zhì),難以用有機(jī)溶劑提取,因此首先必須用蛋白沉淀劑或固相萃取柱除去生物組織(如蛋白質(zhì)、脂肪等)。含脂高的生物樣品一般在提取前先除去脂類(lèi)。體液樣品脫脂可采用離心或正己烷提取。固態(tài)樣品(如肌肉、腎、肝)處理相對(duì)復(fù)雜些,包括勻漿、提取/脫脂等步驟。第九頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日除蛋白的方法：一是沉淀法,即在樣品溶液中加入甲醇/鹽酸溶液沉淀蛋白質(zhì)。二是酸提取法,即在樣品中加入三氟乙酸、三氯乙酸、三氯乙酸/檸檬酸鹽、高氯酸溶液沉淀蛋白質(zhì),將生物樣品與酸溶液混勻或一起均質(zhì)。某些情況下,如測(cè)定腎臟中阿布拉霉素,還需用濃氫氧化氨溶液對(duì)蛋白進(jìn)行水解,保證有較好的樣品回收率。蛋白水解包括酸解法或堿解法,上清液再經(jīng)中和。三是超濾法,經(jīng)超濾法處理后的樣品不會(huì)引入新的鹽類(lèi)污染及假色譜峰。四是固相萃取法,這是近年來(lái)在殘留分析中應(yīng)用最廣的一種快速、簡(jiǎn)便的除蛋白方法。第十頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日1、提取用高或低的pH值介質(zhì)可有效提取生物樣品中氨基糖苷類(lèi)藥物。酸性介質(zhì)：三氯醋酸、三氟醋酸、高氯酸、三氯醋酸-檸檬酸或甲醇-高氯酸溶液與樣品一起均質(zhì)、提取。堿性介質(zhì)：如甲醇-氫氧化氨溶液提取豬腎組織中的阿布拉霉素。食品中氨基糖苷類(lèi)藥物的提取,可加入堿性緩沖液,并加熱脫去蛋白,達(dá)到提取的目的。第十一頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日2、凈化凈化方法包括液-液分配、固相萃取和基質(zhì)固相分散技術(shù)(MSD)、在線痕量富集法等。有時(shí)為了達(dá)到更好的凈化效果,通常將幾種方法結(jié)合應(yīng)用。液-液分配是將干擾組分從水相直接轉(zhuǎn)移至有機(jī)相中。由于氨基糖苷類(lèi)的高極性,在pH范圍內(nèi)不能被提取到有機(jī)相中,仍留在水相中。唯一例外的是阿布拉霉素,在辛烷磺酸離子對(duì)試劑介質(zhì)中,可以用乙酸乙酯進(jìn)行提取,提取回收率約90%。第十二頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日固相萃取法是近年發(fā)展起來(lái)的一種更有效、迅速和方便的提取及除蛋白方法。氨基糖苷類(lèi)藥物的濃縮和凈化采用陽(yáng)離子交換吸附劑較為理想,如CM-SephadexC-25、AmberliteCG-50、苯磺酸基、羧基陽(yáng)離子交換柱等。正相或反相色譜吸附劑也能對(duì)樣品進(jìn)行提取和凈化,如C18固相萃取柱凈化時(shí),提取液中預(yù)先加入適當(dāng)庚烷磺酸離子對(duì)試劑,以提高氨基糖苷類(lèi)抗生素的保留能力?；|(zhì)固相分散技術(shù)應(yīng)用相對(duì)較少第十三頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日柱切換技術(shù)：采用在線痕量富集技術(shù)對(duì)初提取液進(jìn)行凈化,在含離子對(duì)試劑的流動(dòng)相中,預(yù)柱(C18柱)對(duì)鏈霉素和雙氫鏈霉素進(jìn)行富集,干擾組分被淋洗除去,最后待測(cè)物被洗脫進(jìn)入分析柱中。與預(yù)富集過(guò)程相反,在酸性流動(dòng)相中,陽(yáng)離子交換柱對(duì)干擾組分有吸附作用，不被保留的壯觀霉素直接進(jìn)入分析柱進(jìn)行分離檢測(cè)。第十四頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日（二）分析方法1、氣相色譜法氣相色譜已被用于測(cè)定血清中的慶大霉素、妥布霉素、萘替米星和丁胺卡那霉素。樣品脫蛋白和脫水后,用三甲基硅咪唑和七氟丁酰咪唑分兩步衍生化,然后用電子捕獲檢測(cè)器（ECD）檢測(cè)。還有報(bào)道采用三氯乙酸提取和離子交換凈化的方法測(cè)定牛肉組織中的卡那霉素,提取液用七氟丁酰咪唑衍生化,隨后用三甲基硅烷化,GC/ECD檢測(cè),回收率為74%~86%,檢測(cè)限為0.1mg/kg。第十五頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日2、液相色譜法氨基糖苷類(lèi)藥物可采用陽(yáng)離子交換色譜柱或非極性反相色譜柱分離。由于氨基糖苷類(lèi)藥物的極性和離子特征,它們?cè)陉?yáng)離子交換柱上的分離效果較佳,在反相色譜柱上不易分離。但在反相色譜分離中,流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑如磺酸鈉或五氟丙酸,可以改善它們?cè)贑18柱上的分配性能。也可在反相柱分離前,將氨基糖苷類(lèi)藥物衍生化,使極性下降,以改善其在色譜柱上的分配性能。使用C8和C18分離柱,流動(dòng)相一般由醋酸鹽緩沖液和甲醇或乙腈組成,加入離子對(duì)試劑可以改變出峰順序和改善峰形。第十六頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日高效凝膠滲透色譜法亦應(yīng)用于牛奶中氨基糖苷類(lèi)藥物的測(cè)定。利用蛋白排阻柱(Hisep)選擇性地保留新霉素(進(jìn)入凝膠孔穴中),而蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)人凝膠的孔穴中,隨流動(dòng)相由固定相間隙通過(guò)色譜柱而不被保留,達(dá)到分離的目的。第十七頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日檢測(cè)器紫外或熒光衍生化檢測(cè)方法有熒光檢測(cè)、電化學(xué)檢測(cè)、示差折光檢測(cè)和質(zhì)譜檢測(cè)。大部分氨基糖苷類(lèi)分子中含-NH2基團(tuán),能與鄰苯二甲醛(OPA)、丹酰氯、1-氟-2,4-二硝基苯(FDND)等反應(yīng),形成穩(wěn)定的熒光產(chǎn)物。最常用的以鄰苯二甲醛為衍生劑,采用柱前或柱后熒光衍生化。柱前衍生反應(yīng)可在溶液中進(jìn)行,亦可在離子交換柱或硅膠柱的凈化過(guò)程中進(jìn)行。柱后衍生需要柱后衍生裝置。第十八頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日例子：熒光衍生化HPLC法測(cè)定牛奶中慶大霉素的四種主要組分取10mL牛奶樣品于4℃中離心,棄去上層脂肪層,加入1mL30%三氯醋酸,離心,上清液過(guò)C18固相萃取柱,用水、水-甲醇(1+1)和甲醇淋洗,最后用16%氫氧化銨的甲醇溶液洗脫,洗脫液揮發(fā)至干,用水溶解殘余物,取部分提取液加入離子對(duì)試劑戊磺酸,進(jìn)樣分析。色譜柱為SpherisorbODS2(15cm,5μm),以水-甲醇(82+18)含0.1%醋酸、5.6mmol/L硫酸鈉和11mmol/L戊磺酸作流動(dòng)相,鄰苯二甲醛柱后衍生,熒光檢測(cè),檢測(cè)限為15μg/kg。第十九頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日二、四環(huán)素類(lèi)四環(huán)素類(lèi)(Tetracyclines)抗生素是一類(lèi)堿性廣譜抗生素。包括從鏈霉菌屬培養(yǎng)物提取的四環(huán)素、土霉素、金霉素以及多種半合成四環(huán)素如強(qiáng)力霉素、美他霉素、米諾環(huán)素等。四環(huán)素類(lèi)早在20世紀(jì)的60~70年代即廣泛應(yīng)用,在獸醫(yī)上尤為濫用,以致細(xì)菌對(duì)四環(huán)素類(lèi)的耐藥現(xiàn)象頗為嚴(yán)重,一些常見(jiàn)病原菌的耐藥率很高。四環(huán)素、土霉素等鹽類(lèi),內(nèi)服能吸收,但不完全,而四環(huán)素堿、土霉素堿吸收更差。第二十頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日四環(huán)素內(nèi)服吸收不完全,約為30%~70%。血藥濃度較土霉素略高,對(duì)組織的透過(guò)率亦較高。蛋白結(jié)合率65%。在膽汁中濃度可達(dá)血清濃度的5~20倍,可透入胎盤(pán)進(jìn)入乳汁。水牛、黃牛、豬一次靜脈注射鹽酸四環(huán)素的半衰期分別為3.99h、5.39h、3.62h。休藥期:牛5日,豬5日,雞2日。第二十一頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日土霉素內(nèi)服易吸收,但不完全。一次內(nèi)服后,一般2~4h達(dá)血藥峰濃度,牛因部分藥物進(jìn)入瘤胃后延緩吸收,需4~8h才達(dá)峰濃度。吸收后廣泛分布于肝、腎、肺等組織和體液中,易滲入胸水、腹水、胎畜循環(huán)及乳汁中。主要以原形從尿中排出。一部分在肝臟膽汁中濃縮,排入腸內(nèi),部分再被吸收,形成“肝腸循環(huán)”。腎功能減退時(shí)可在體內(nèi)蓄積。第二十二頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日（一）樣品處理四環(huán)素類(lèi)抗生素的四環(huán)母核上含有下列官能團(tuán):二甲胺基[-N(CH3)2]、酰氨基(-CONH2)、酚羥基和兩個(gè)含有酮基和烯醇基的共軛雙鍵系統(tǒng)。本類(lèi)抗生素是兩性化合物,分子中存在酚羥基和烯醇型羥基,顯弱酸性;同時(shí)含有二甲胺基,顯弱堿性,故遇酸及堿,均能生成相應(yīng)的鹽。四環(huán)素類(lèi)抗生素的游離堿,在水中的溶解度很小,其溶解度與溶液的pH值有關(guān),在pH4.5~7.2之間時(shí)難溶于水,但若酸性或堿性增強(qiáng),則溶解度增加。當(dāng)pH值低于4或高于8時(shí),可以得到高濃度的四環(huán)類(lèi)化合物的水溶液。其鹽類(lèi)在水中會(huì)水解,當(dāng)溶液濃度較大時(shí),會(huì)析出游離堿,酸度大時(shí)能防止水解。第二十三頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日由于四環(huán)類(lèi)抗生素的分子內(nèi)含有蒽酮類(lèi)發(fā)色團(tuán),一般為黃色結(jié)晶性粉末,在270~360nm處有強(qiáng)的紫外吸收。四環(huán)類(lèi)抗生素在堿性溶液中,C環(huán)打開(kāi),生成無(wú)活性的具有內(nèi)酯類(lèi)結(jié)構(gòu)的異四環(huán)素。若在強(qiáng)堿性溶液中加熱,幾乎可以定量轉(zhuǎn)化為異四壞素類(lèi)產(chǎn)物,具有強(qiáng)烈熒光。液體樣品(如牛奶)一般通過(guò)離心去除部分蛋白和顆粒,再用乙酸鹽、磷酸鹽、McⅡvaine或McⅡvaine/EDTA緩沖液稀釋。組織樣品(肌肉、腎臟、肝臟)提取前,樣品需要剁碎或均質(zhì)。第二十四頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日1、提取從生物樣品中分離四環(huán)素類(lèi)比較復(fù)雜,因?yàn)檫@類(lèi)藥物易與金屬離子形成螯合物,以及與組織中的蛋白強(qiáng)烈結(jié)合,因此須用強(qiáng)酸或酸性脫蛋白劑進(jìn)行提取。然而,在酸性條件下(pH＜2.0),四環(huán)素類(lèi)藥物降解為脫水物,加熱時(shí)又可轉(zhuǎn)變?yōu)椴钕虍悩?gòu)體。因此,提取時(shí)最好用含有EDTA、琥珀酸鹽、草酸等螯合劑的弱酸性溶劑。常用的弱酸性溶劑有EDTA-McⅡvaine緩沖液(pH4.0)、琥珀酸鹽緩沖液(pH4.0)、酸化乙腈、酸化甲醇。另外,三氯乙酸(pH2.0)、檸檬酸鹽緩沖液(pH4.0)、檸檬酸鹽緩沖液/乙酸乙酯(pH4~5)和鹽酸/甘氨酸緩沖液亦用于樣品的提取和沉淀蛋白質(zhì)。其他提取方法包括用含苯丁唑酮離子對(duì)試劑的二氯甲烷提取蛋中四環(huán)素類(lèi)藥物,超濾法提取牛奶、豬組織中四環(huán)素類(lèi)藥物。酸提取法+金屬螯合劑第二十五頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日2、凈化初提取液中含大量的內(nèi)源性干擾雜質(zhì),還需要凈化處理,包括液-液萃取、固相萃取(SPE)、基質(zhì)固相分散、超濾、免疫親和色譜和在線痕量富集等方法。為達(dá)到更好的凈化效果,可將幾種方法結(jié)合使用。（1）液-液萃?。核沫h(huán)素類(lèi)藥物不溶于二氯甲烷等疏水性有機(jī)溶劑,因此液-液萃取利用疏水性有機(jī)溶劑將水相中的一些脂溶性雜質(zhì)洗去。但有四丁基銨離子對(duì)試劑存在時(shí),二氯甲烷可直接提取水相中(pH8.2)的土霉素和四環(huán)素,其萃取率達(dá)85%以上。第二十六頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日（2）固相萃取(SPE)由于四環(huán)素類(lèi)不易從水相進(jìn)入有機(jī)相,可采用固相萃取柱凈化。常用的SPE柱固定相為C18、多聚類(lèi)和環(huán)己基填料。采用硅膠基質(zhì)的SPE柱時(shí),四環(huán)素類(lèi)易與固定相的硅醇基發(fā)生吸附,可通過(guò)加入EDTA等硅醇基阻斷劑來(lái)解決,并在淋洗液中加入草酸。將反相柱與陽(yáng)離子交換柱串聯(lián)使用,或使用混合填料的SPE柱,如C18與CM-SephadexC-25、苯磺酸型、羧酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂混合,可以提高凈化效率。基質(zhì)固相分散法采用C18吸附劑,已用于牛奶中的四環(huán)素類(lèi)的提取和凈化,加入等量的EDTA和草酸,可縮短提取時(shí)間。第二十七頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日超濾和免疫親和色譜法亦被用于牛奶樣品的提取和凈化。柱切換技術(shù)：有人采用金屬螯合親和柱作為富集柱(Anagel-TSKChelate-5PW),通過(guò)柱切換,在線濃縮凈化動(dòng)物組織和蛋中四環(huán)素類(lèi)藥物。第二十八頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日（二）分析方法生物樣品中四環(huán)素藥物的含量測(cè)定方法,除有微生物測(cè)定外,主要還有熒光分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法等。第二十九頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日1、熒光分光光度法四環(huán)素類(lèi)抗生素本身在0.1mo1/L鹽酸液中有微弱熒光,若將它們轉(zhuǎn)變?yōu)槊撍?能使熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。若在一定pH條件下,使脫水物與鋁鹽絡(luò)合,形成的絡(luò)合物具強(qiáng)烈熒光,可用于含量測(cè)定。由于本法靈敏度高(0.1mg/L),線性范圍在0~5mg/L間,適用于血漿中四環(huán)素類(lèi)抗生素的測(cè)定。第三十頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日血漿中四環(huán)素的測(cè)定取血漿2.0mL,加1.5mol/L三氯醋酸液0.6mL,振搖,離心(3500r/min)5min,取上層液1.6mL,加0.lmol/L鹽酸液0.5mL,某中含有β-硫代丙酸1.0g/L;溶液于100℃加熱10min后,立即將試管浸入冷水中冷卻,加pH6.0枸櫞酸緩沖液(1L溶液中含枸櫞酸125g和10mol/L氫氧化鈉液160mL)1.0mL,然后加0.75mol/L三氯化鋁液0.5mL,振搖并在室溫放置15min,于485nm處激發(fā),555nm處檢測(cè)熒光強(qiáng)度。第三十一頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日四環(huán)素在pH5的條件下,與Al3+以1:1的定量關(guān)系形成具有強(qiáng)烈熒光的絡(luò)合物,該絡(luò)合物至少能穩(wěn)定1h;試劑中加β-TPA,能增強(qiáng)四環(huán)素對(duì)光的穩(wěn)定性,β-TPA為抗氧劑。該法適用于血漿中其他四環(huán)類(lèi)抗生素的測(cè)定。Gala等報(bào)道了熒光分光光度法篩選測(cè)定牛奶中四環(huán)素藥物。Poiger等測(cè)定了組織中三種四環(huán)素類(lèi)藥物。Salinas等報(bào)道了一種4步熒光衍生化,熒光分光光度法測(cè)定蜂蜜中土霉素殘留量。第三十二頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日2、薄層色譜法薄層色譜法設(shè)備簡(jiǎn)單,操作方便,可作為四環(huán)素類(lèi)的篩選方法。薄層板一般采用硅膠板或C8板。硅膠板遍常以ETDA-2Na(pH7.0)-乙酸乙酯-氯仿-丙酮溶液作展開(kāi)劑,C8板用含0.5mol/L草酸的流動(dòng)相展開(kāi);展開(kāi)后,取出薄層板,晾干,檢測(cè)方法包括生物自顯影法(枯草桿菌)和分光光度法。熒光分光光度檢測(cè)采用氯化鎂和三乙胺顯色,紫外分光光度檢測(cè)采用快藍(lán)BB和吡啶顯色。第三十三頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日3、毛細(xì)管電泳法Chen等報(bào)道了毛細(xì)管電泳法測(cè)定牛奶中4種甲環(huán)素類(lèi)藥物。樣品用金屬螯合柱提取,洗脫液過(guò)C18固相萃取柱,乙醇洗脫,開(kāi)管石英毛細(xì)管柱(57cm×75μm)分離,電泳電壓23kV,溫度23℃,電泳液含10mmol/L十二烷基磺酸鈉、50mmol/L硼酸鹽和50mmol/L磷酸鹽,pH8.5,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)370nm,四環(huán)素類(lèi)的檢測(cè)限1.3~5.6ng/mL,定量檢測(cè)限1.7~8.7ng/mL。第三十四頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日4、高效液相色譜法HPLC法是四環(huán)素類(lèi)藥物殘留分析最常用的方法,但采用硅膠基質(zhì)的色譜柱時(shí),常遇見(jiàn)兩個(gè)問(wèn)題:一是四環(huán)素類(lèi)可與色譜系統(tǒng)中的金屬離子形成螯合物,色譜行為差;二是四環(huán)素類(lèi)與固定相發(fā)生吸附,造成峰形不對(duì)稱(chēng),靈敏度下降。前者可通過(guò)加入EDTA解決,后者可通過(guò)對(duì)柱填料進(jìn)行硅烷化或加入季銨鹽等硅醇基的阻斷劑來(lái)解決。亦可采用含金霉素的流動(dòng)相預(yù)先淋洗過(guò)夜,金霉素作為硅醇基的阻斷劑,以消除土霉素和四環(huán)素的峰形拖尾現(xiàn)象。第三十五頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日土霉素、四環(huán)素和強(qiáng)力霉素在酸性水溶液中,268nm、270nm和269nm處有最大吸收,在350~370nm處亦有強(qiáng)的紫外吸收,檢測(cè)靈敏度可達(dá)μg/kg水平。由于四環(huán)素類(lèi)分子中含有兩個(gè)共軛雙鍵,因此在紫外光照下能產(chǎn)生熒光,它們的降解產(chǎn)物也具有熒光性質(zhì),可供測(cè)定。但四環(huán)素類(lèi)的熒光檢測(cè)更多的采用柱后熒光衍生化測(cè)定。例如,以二氯化氧鋯作熒光衍生劑,柱后熒光檢測(cè)組織中的四環(huán)素類(lèi)藥物殘留,靈敏度可達(dá)pg水平,具有高的靈敏度和選擇性。電化學(xué)檢測(cè)具有高的靈敏度,但應(yīng)用相對(duì)較少。質(zhì)譜檢測(cè)可提供化合物的結(jié)構(gòu)信息,在殘留分析中作為確證分析方法。第三十六頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日HPLC法測(cè)定牛奶中土霉素和四環(huán)素取5mL牛奶樣品,用0.6mol/L硫酸調(diào)節(jié)至pH2.7,用10mL乙腈提取,吹干,用2mL磷酸鹽緩沖液溶解,加入四丁基銨離子對(duì)試劑,二氯甲烷提取,再用0.1mol/L高氯酸抽提。C18柱(25cm×5μm)分離,使用前用含金霉素的流動(dòng)相淋洗過(guò)夜,以0.02mol/L磷酸-乙腈(76+24)作流動(dòng)相,流速1.2mL/min,柱溫35℃,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)355nm。在上述條件下,樣品色譜圖見(jiàn)圖,可檢測(cè)到牛奶樣品中土霉素和四環(huán)素濃度10ng/mL。第三十七頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日HPLC法測(cè)定牛和豬的組織與血清中的四環(huán)素取25g組織樣,加3倍體積的1mol/L鹽酸,血清中加入1倍體積的1mol/L鹽酸,勻漿,取勻漿8mL加人乙腈32mL渦旋混合,靜置后濾過(guò),收集濾液20mL,加人二氯甲烷20mL和石油醚20mL,用力振蕩,取水層200μL進(jìn)樣。色譜柱為PRR1柱(25cm×4.1mm,10μm),流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸-甲醇(80+20)和0。01mol/L磷酸-乙腈-甲醇(30+50+zO),梯度淋洗,流速1mL/min。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)355nm。在上述條件下,方法回收率:肌肉,92.7%;血清,99.5%。檢測(cè)限:土霉素、四環(huán)素,10ng;金霉素,20ng。第三十八頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日柱切換技術(shù)采用柱切換技術(shù),金屬螯合親和柱在線濃縮/凈化動(dòng)物組織和蛋中四環(huán)素類(lèi)藥物,分離測(cè)定土霉素、四環(huán)素、地美環(huán)素和金霉素殘留量。取2g蛋樣或組織樣,用pH5的檸檬酸鹽緩沖液(雞肝,pH4)和乙酸乙酯均質(zhì),離心,上清液揮發(fā)至干,用甲醇溶解,注入Anagel-TSKChelate-5PW金屬螯合親和柱,通過(guò)柱切換,將富集的分析物洗脫至分析柱(PLRRS,15cm×5μm)中進(jìn)行分離,流動(dòng)相為0.1mol/L磷酸二氫鉀-0.01mol/L檸檬酸-0.01mol/LEDTA和乙腈-甲醇-1mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH4)(25+10+65),梯度淋洗:10min內(nèi)從(100+0)到(0+100),350nm紫外檢測(cè),組織和蛋中檢測(cè)限:土霉素3μg/kg、四環(huán)素5μg/kg、地美環(huán)素5μg/kg、金霉素6μg/kg。第三十九頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日采用金屬螯合親和柱凈化,LC分離測(cè)定牛奶中四環(huán)素類(lèi)藥物殘留量。取5.0mL牛奶樣品于10℃離心15min,分離乳油,加入0.1mol/L琥珀酸鈉10mL,混勻后離心,上清液過(guò)金屬螯合柱(已用Cμ2+處理過(guò)),洗脫液再過(guò)ENVⅠChromP固相萃取柱凈化;色譜柱為PLRP-S柱(15cm×4.6mm,5μm),以甲醇-5mmol/L草酸溶液作流動(dòng)相,梯度洗脫,流速1mL/min,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)355nm。在上述條件下,保留時(shí)間:土霉素13.2min、四環(huán)素13.8min、金霉素15.7min;檢測(cè)限﹤5ng/mL。第四十頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日龐國(guó)芳等建立了一種HPLC法同時(shí)測(cè)定禽肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素殘留的分析方法。Long等報(bào)道了基質(zhì)固相分散-LC法測(cè)定奶中土霉素、四環(huán)素、金霉素殘留量。Wan等報(bào)道了一種新穎的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)-HPLC法測(cè)定蜂蜜中四環(huán)素類(lèi)(土霉素、四環(huán)素、美他環(huán)素)殘留。Pena等采用柱后熒光衍生化LC測(cè)定奶中土霉素、四環(huán)素和金霉素殘留量,添加樣品的回收率大于80%,在1.45h內(nèi)可分析10個(gè)樣品,方法靈敏、快速、可靠,滿足殘留檢測(cè)的要求。Pena等采用LC熒光檢測(cè)法測(cè)定蜂蜜中土霉素和四環(huán)素殘留量。第四十一頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日Oka等最先報(bào)道了快速原子轟擊LC-MS測(cè)定蜂蜜中四環(huán)素、土霉素、金霉素和強(qiáng)力霉素的方法,后來(lái)用熱噴霧電離LG-MS分析四環(huán)素類(lèi)藥物。Carson等報(bào)道了LC-MS法測(cè)定蝦、牛奶中四環(huán)素類(lèi)多殘留的分析方法。張純萍等報(bào)道了牛奶中四環(huán)素類(lèi)藥物的HPLC-MS/MS法。Goto報(bào)道了一種電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)動(dòng)物組織中四環(huán)素和青霉素類(lèi)抗生素的高通量分析方法,可同時(shí)檢測(cè)肌肉組織中土霉素、四環(huán)素、金霉素、青霉素G、氨比西林和萘呋西林殘留。第四十二頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日三、氯霉素類(lèi)氯霉素類(lèi)屬酰胺醇類(lèi)廣譜抗生素,包括氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，后兩者為氯霉素的衍生物。由于分子中存在兩個(gè)不對(duì)稱(chēng)碳原子,故有四個(gè)立體異構(gòu)體。在這些異構(gòu)體中,惟具左旋性的D-(-)-蘇阿糖型有制菌活性。第四十三頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日氯霉素氯霉素是一種廣譜抗生素,具有良好的抗菌和藥理特性,被廣泛應(yīng)用于各類(lèi)家禽、家畜、水生動(dòng)物(魚(yú)、蝦等)及蜜蜂等動(dòng)物的各種傳染病的防治。但是氯霉素對(duì)人有嚴(yán)重的副作用,可導(dǎo)致再生障礙性貧血。美國(guó)、歐盟等國(guó)規(guī)定在動(dòng)物源食品中不得檢出氯霉素。第四十四頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日氯霉素口服吸收良好,在體內(nèi)分布廣泛,可進(jìn)人胸水、腹水、滑膜液和玻璃體內(nèi)。腦組織中藥物濃度可高于血清濃度幾倍,但腦脊液藥物濃度只為血清濃度的1/2?？赏高^(guò)胎盤(pán),并進(jìn)入乳汁。在膽汁中含量較低,有一半以上藥物在肝、腎和血清中與葡萄糖醛酸結(jié)合失活,肌肉中呈游離態(tài)。氯霉素肌內(nèi)注射后在注射部位蓄積,吸收比內(nèi)服慢(反芻動(dòng)物除外),牛在2~12h產(chǎn)生并維持有效血濃度。琥珀氯霉素的水溶性強(qiáng),注射后吸收迅速,給母牛一次肌注50mg/kg,其血藥峰濃度較同量氯霉素高6倍,消失也較快。第四十五頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日氯霉素注射后迅速進(jìn)入腸肝循環(huán),藥物作用時(shí)間較長(zhǎng),數(shù)周內(nèi)都可以檢出藥物的殘留。例如,山羊肌注后殘留量降到0.05mg/kg時(shí),注射部位需要14天,非注射部位肌肉6天,脂肪9天,肝和腎11天。氯霉素在肝臟中的主要代謝產(chǎn)物為氯霉素-葡萄糖醛酸結(jié)合物、氯霉素堿、氯霉素醇和氯霉素草氨酸鹽。肝中生物轉(zhuǎn)化后,大部分隨尿液排出。第四十六頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日甲砜霉素甲砜霉素抗菌譜和抗菌作用與氯霉素相仿,體外抗菌作用比氯霉素略差。但體內(nèi)比氯霉素強(qiáng),具有較強(qiáng)的免疫抑制作用,是氯霉素的2.5~5倍。主要抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成和抑制抗體的生成,在畜牧業(yè)中用于預(yù)防和治療牛、家禽呼吸道和腸道疾病。內(nèi)服或注射吸收快而完全,給藥后2h血藥濃度達(dá)峰值,膽汁中濃度可為血藥濃度的4倍。連續(xù)用藥在體內(nèi)無(wú)蓄積現(xiàn)象。甲砜霉素吸收后在體內(nèi)分布廣泛,以腎、脾、肝、肺等中的含量較多,比同劑量的氯霉素約高3~4倍。甲砜霉素在體內(nèi)很少代謝,兔和鼠中90%以上藥物以原形自尿中排出,部分自糞便中排出,但在豬中葡萄苷酸化相對(duì)較高。第四十七頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日氟苯尼考氟苯尼考是氯霉素的第二代替代品,其結(jié)構(gòu)與甲砜霉素相似,但抗菌活性、抗菌譜及不良反應(yīng)方面明顯優(yōu)于甲砜霉素,其抗菌能力可達(dá)甲砜霉素的10倍之多。氟苯尼考在動(dòng)物胃腸道內(nèi)吸收良好。氟苯尼考在動(dòng)物體內(nèi)主要代謝產(chǎn)物是氟苯尼考胺(Flμrfenicolamine,FFA)和氟苯尼考醇。美國(guó)殘留監(jiān)控中把FFA作為魚(yú)組織中氟苯尼考的標(biāo)志殘留物。氟苯尼考內(nèi)服吸收良好,在動(dòng)物體內(nèi)呈全身性分布,但各組織器官藥物濃度不同。血液和肌肉中藥物濃度相近,腦中藥物濃度較低,膽汁中濃度高,且有較高的內(nèi)服生物利用度(豬109%、犢牛88%、肉仔雞55%),預(yù)示存在腸肝循環(huán)。在腎和眼球脈絡(luò)模中有蓄積作用,說(shuō)明氟苯尼考及其代謝物可能與黑色素結(jié)合。氟苯尼考主要經(jīng)腎排泄,犢牛靜脈注射和內(nèi)服后分別有50%和65%的原藥從尿排出,少量經(jīng)糞便排出。第四十八頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日（一）樣品處理液體樣品(如牛奶)通過(guò)離心脫脂,用水稀釋后再經(jīng)固相萃取柱凈化。組織樣品(肌肉、腎臟、肝)在提取前,需要將樣品粉碎或均質(zhì)。氯霉素有一半以上藥物在肝、腎和血清中與葡萄糖醛酸結(jié)合,故用葡糖苷酸酶水解,釋出游離的氯霉素,但在豬、雞和牛肌肉組織中未發(fā)現(xiàn)有葡萄糖醛酸結(jié)合。第四十九頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日1、提取組織樣品的提取/脫蛋白一般用乙酸乙酯和乙腈。乙腈適合氯霉素類(lèi)三種藥物的同時(shí)提取,但其提取效率不及乙酸乙酯。其他有機(jī)溶劑/無(wú)機(jī)溶劑有丙酮、甲醇、乙醚、乙酸異戊酯、三氯乙酸、磷酸鹽緩沖液(pH7.8)、水和尿素溶液。第五十頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日2、凈化初提取液凈化可采用液-液分配、透析、固相萃取、基質(zhì)固相分散、免疫親和色譜、液相色譜和在線富集技術(shù)等。液-液分配是將水相中的藥物提取到有機(jī)相中,或是將水相或有機(jī)相中的內(nèi)源性干擾雜質(zhì)洗去。乙酸乙酯提取水相中氯霉素類(lèi)藥物,提取率較乙醚等其他有機(jī)溶劑高。水相中加入氯化鈉使?jié)舛葹?%~4%,可以提高乙酸乙酯的萃取效率,尤其對(duì)甲砜霉素和氟苯尼考效果更為明顯。第五十一頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日樣液脫脂可用正己烷、石油醚、異丙酮和甲苯等有機(jī)溶劑,但在分析氯霉素和氟苯尼考時(shí),盡量避免使用甲苯,因?yàn)樵谝?液分配過(guò)程中,部分藥物會(huì)轉(zhuǎn)化成甲苯。由于液-液分配過(guò)程中易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象,導(dǎo)致樣品損失,有人改用硅藻土小柱濃縮、凈化樣品,避免了液-液分配中的乳化現(xiàn)象,同時(shí)提高了萃取效率。除蛋白和雜質(zhì)亦可采用基質(zhì)固相分散技術(shù)(MSPD)和透析法。MSPD在凈化肌肉組織和奶樣中氯霉素時(shí),用C18作為吸附劑。透析法用于牛奶樣品中氯霉素的測(cè)定時(shí),先用乙酸乙酯提取樣品,提取液經(jīng)透析膜選擇性透析,使藥物分子從基體中分離出來(lái),達(dá)到與蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)分離的目的。第五十二頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日提取液凈化一般采用固相萃取法,最常用的吸附劑為反相吸附劑如C18。C18固相萃取柱凈化樣品,回收率高,但在許多情況下,C18柱凈化后,再用C18分析柱分離,可能某些雜質(zhì)與分析物一同出峰,干擾組分的測(cè)定。極性吸附劑如Florisil和氧化鋁亦被用于組織樣品的凈化。組織樣品經(jīng)Florisil小柱凈化后,氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的回收率為82.6%、75.4%、79.1%,而氧化鋁小柱凈化后,氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的回收率為75.8%、65.6%、63.4%。因此Florisil柱凈化后得到的回收率要比氧化鋁柱高,并且在除脂類(lèi)雜質(zhì)方面效果更好。免疫親和柱具有高的專(zhuān)一性,vandeWater首先采用免疫親和柱純化豬肌肉和牛奶樣品中的氯霉素。Moretti等應(yīng)用柱切換技術(shù),用免疫親和柱在線純化濃縮牛奶和豬肉中氯霉素。第五十三頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日vanGinkel等采用LC法純化牛肉和蛋中氯霉素,分離柱為L(zhǎng)iChrosorbDiol柱。Tjaden等通過(guò)柱切換技術(shù),用反相柱在線純化濃縮豬腎中氯霉素。Hμmmert等采用蛋白排阻色譜柱(Hisep)在線濃縮動(dòng)物組織中氯霉素,通過(guò)柱切換,洗脫劑將濃縮后的氯霉素洗脫至SμpelcoLC-18預(yù)柱中,再洗脫至分析柱中分離。第五十四頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日（二）分析方法生物樣品中氯霉素類(lèi)的分析主要采用色譜法,包括薄層色譜法、液相色譜法和氣相色譜法。表9.1列出了部分氯霉素類(lèi)藥物殘留的分析條件。第五十五頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日1、薄層色譜法薄層色譜法(TLC)測(cè)定食品中氯霉素類(lèi)藥物的文獻(xiàn)很少。TLC法樣品處理繁瑣,顯色過(guò)程復(fù)雜,方法重復(fù)性和靈敏度低,目前已很少應(yīng)用。第五十六頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日豬肉中氯霉素的TLC測(cè)定方法樣品用乙酸乙酯提取,離心分離,正己烷脫脂,然后用硅膠柱凈化,依次用乙酸乙酯-正己烷(3+1)、乙腈-甲醇(95+5)淋洗柱子,用丙酮-正己烷(2+1)洗脫,洗脫液濃縮后,用50μL甲醇溶解,點(diǎn)樣,以乙酸乙酯-正己烷(2+1)為展開(kāi)劑,展開(kāi)后,晾干,斑點(diǎn)進(jìn)行衍生化:先噴氯化鍶溶液,烘干后再?lài)姎溲趸c溶液,烘干,噴硼氫化鈉溶液,烘干,最后用熒光胺顯色,置紫外光(366nm)下檢視,供試液如顯雜質(zhì)斑點(diǎn),與對(duì)照溶液的主斑點(diǎn)比較,不得更深,該方法測(cè)定低限為0.01mg/kg。氯霉素斑點(diǎn)的檢測(cè)亦可采用枯草桿菌的生物自顯影法。第五十七頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日2、氣相色譜法氯霉素類(lèi)藥物為高極性、難揮發(fā)的化合物,須對(duì)它們的極性官能團(tuán)進(jìn)行酯化、硅烷化或酰化,生成熱穩(wěn)定和易揮發(fā)的衍生物,才能用GC或GC-MS進(jìn)行測(cè)定。由于氯霉素類(lèi)藥物都有羥基,通過(guò)三甲基硅烷化(TMS)可以定量衍生,生成易揮發(fā)和熱穩(wěn)定的硅烷化衍生物。常用的硅烷化試劑有N,O-雙(三甲基硅)三氟乙酰胺(BSTFA)、三甲硅基-N,N-二甲基氨基甲酸酯、六甲基二硅氧烷(HMDS)、六甲基乙硅氧烷-三甲基氯硅烷的吡啶溶液和N,O-雙(三甲基硅)三氟乙酰胺(BSTFA)-三甲基氯硅烷(TMCS)(99+1)。七氟丁酸酐與羥基反應(yīng),生成酯類(lèi)衍生物,用于牛奶中的氯霉素測(cè)定。第五十八頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日由于氯霉素類(lèi)分子中有吸電子的鹵素,用電子捕獲檢測(cè)器檢測(cè),具有高的靈敏度和專(zhuān)一性,檢測(cè)限可達(dá)0.1~5ng/g。GC-MS法檢測(cè)可提供化合物的結(jié)構(gòu)信息,被用于動(dòng)物源食品中氯霉素類(lèi)殘留的確證分析,質(zhì)譜采用化學(xué)電離源接口。氫火焰離子檢測(cè)器(FID)也可用于氯霉素和甲砜霉素的檢測(cè),但靈敏度低且專(zhuān)一性差,通常僅作為GC-MS的輔助檢測(cè)手段。第五十九頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日牛奶中氯霉素類(lèi)多殘留的GC測(cè)定方法以間硝基氯霉素作內(nèi)標(biāo)物。牛奶樣品用乙腈提取,離心,上清液濃縮至干,用水溶解殘余物,過(guò)C18固相萃取柱,用甲醇-水(60+40)溶液洗脫,洗脫液揮發(fā)至干,用N,O-雙(三甲基硅)三氟乙酰胺(BSTFA)-三甲基氯硅烷(TMCS)(99+1)試劑衍生化,加人甲苯和水,終止衍生反應(yīng),離心,有機(jī)相進(jìn)樣分析,色譜柱為OV-1石英毛細(xì)管柱(30m×0.25mm),載氣為氦氣,電子捕獲檢測(cè)器檢測(cè),可檢測(cè)到牛奶中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考?xì)埩袅?μg/kg。第六十頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日3、液相色譜法氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考都有很強(qiáng)的紫外吸收,因此可直接用HPLC/μV檢測(cè)。分析柱多采用C18或C8柱。一般來(lái)說(shuō)C8柱用于分析那些在C18柱上不能很好保留的化合物。由于C18柱可以很好地分離氯霉素和甲砜霉素,因此C18柱應(yīng)用更廣,流動(dòng)相主要是甲醇或乙腈與磷酸鹽緩沖液或醋酸鹽緩沖液。氯霉素的檢測(cè)波長(zhǎng)可選擇214nm、254nm或278nm。在214nm氯霉素的檢測(cè)靈敏度最高,但樣品提取液的色譜圖上會(huì)有許多內(nèi)源性化合物的干擾峰,在278nm檢測(cè)氯霉素時(shí)干擾峰較少。甲砜霉素和氟苯尼考在224nm、225nm或230nm進(jìn)行檢測(cè)。第六十一頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日LC法測(cè)定豬肌肉中氯霉素試樣中加入乙酸乙酯,超聲提取,加入無(wú)水硫酸鈉脫水,加入適量正己烷,過(guò)硅膠柱凈化,用少量正己烷淋洗,再用甲醇洗脫氯霉素,洗脫液濃縮至干后用流動(dòng)相溶解,進(jìn)樣分析,色譜柱為L(zhǎng)i-ChromspherC18柱(100mm×3.0mm,5μm),流動(dòng)相為乙酸鈉緩沖液(0.01mol/L,pH4.3)-乙腈(75+25),檢測(cè)波長(zhǎng)280nm,樣品添加濃度10~50μg/kg的平均回收率為79%。第六十二頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日采用柱切換技術(shù),反相色譜法測(cè)定豬腎中氯霉素殘留量樣品用乙醚提取,提取液用氮?dú)獯蹈?加入2mL乙腈和3mL石油醚溶解殘余物,乙腈相吹干后,殘余物用流動(dòng)相溶解,進(jìn)樣。第一柱為L(zhǎng)i-ChromspherC18柱(100mm×3.0mm,5μm),第二柱為PRP-l柱(100mm×3.0mm,5μm),檢測(cè)波長(zhǎng)280nm,流動(dòng)相為乙腈-水(90+10),方法檢測(cè)限小于0.01μg/g,添加濃度在125μg/kg時(shí)的回收率為狃41.7%。第六十三頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日LC法測(cè)定黃鱔肉中氟苯尼考胺(FFA)的殘留量樣品先酸解(樣品酸解可以將氟苯尼考及其代謝物轉(zhuǎn)化為FFA,并從組織中釋出),然后用乙酸乙酯提取,堿化后過(guò)固相萃取柱,C18柱分離,紫外檢測(cè),樣品添加濃度在0.075~35μg/g的回收率為85.7%~92.3%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差4.8%~17.2%,檢測(cè)限0.044μg/g。第六十四頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日LC-MS/MS法測(cè)定奶制品中氯霉素殘留量樣品經(jīng)液-液提取,固相萃取柱凈化后進(jìn)樣,負(fù)離子電噴霧電離,MRM檢測(cè)。由于氯霉素分子中有兩個(gè)氯原子,因此NIRM選擇4對(duì)離子對(duì):m/z321→257,321→152(35Cl2)和323→257,323→152(37C135Cl),雖然m/z

321→152的檢測(cè)響應(yīng)比其他離子對(duì)高,但基質(zhì)對(duì)它有干擾,故選擇仍m/z

321→257作為定量離子對(duì),添加水平在0.1μg/kg、0.2μg/kg、0.5μg/kg時(shí),回收率和精密度符合歐盟殘留檢測(cè)的要求,測(cè)定限和測(cè)定能力分別為0.03μg/kg和0.05μg/kg。第六十五頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日四、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和林可霉素類(lèi)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)(Macrolides)是一類(lèi)具有14~16員大環(huán)的內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的弱堿性抗生素,天然制品由鏈霉菌培養(yǎng)液中獲取,經(jīng)半合成改造可制得許多新型品種(圖10-1)。自1952年發(fā)現(xiàn)代表品種紅霉素以來(lái)已陸續(xù)有竹桃霉素、螺旋霉素、吉他霉素、麥迪霉素、交沙霉素及它們的衍生物問(wèn)世。并出現(xiàn)動(dòng)物專(zhuān)用品種如泰樂(lè)菌素、替米考星等。第六十六頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)的抗菌譜和抗菌活性基本相似,主霉對(duì)需氧革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性球菌、厭氧球菌及軍團(tuán)菌屬、支原體屬、衣原體屬有良好作用。僅作用于分裂活躍的細(xì)菌,屬生長(zhǎng)期抑菌劑。大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)內(nèi)服可吸收,體內(nèi)分布廣泛,膽汁中濃度很高,不易透過(guò)血腦屏障。主要從膽汁排出,糞中濃度較高。林可霉素類(lèi)(Lincosa而des)是一類(lèi)具有氨基酸側(cè)鏈單苷結(jié)構(gòu)的堿性抗生素,天然制品由鏈霉菌培養(yǎng)液中取得,經(jīng)半合成改造可制得新型品種,代表品種有林可霉素、克林霉素和吡利霉素。第六十七頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日林可霉素類(lèi)抗菌譜較大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)窄。革蘭陽(yáng)性菌及某些支原體(豬肺茨支原體、豬鼻支原體、豬關(guān)節(jié)液支原體)、鉤端螺旋體均對(duì)本品敏感。而革蘭陰性菌對(duì)本品耐藥。林可霉素類(lèi)的最大特點(diǎn)是對(duì)厭氧菌有良好抗菌活性。本類(lèi)藥物的作用機(jī)理同大壞內(nèi)酯類(lèi),主要作用于細(xì)菌核糖體的59s亞基,通過(guò)抑制肽鏈的延長(zhǎng)而影響蛋白質(zhì)的合成。第六十八頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日泰樂(lè)菌素動(dòng)物組織中殘留量取決于給藥方式。肌注在注射部位和腎中殘留量為最高,內(nèi)服在肝中殘留量為最高,而且肌注比內(nèi)服殘留量高、滯留時(shí)間更長(zhǎng)。由于內(nèi)服殘留量比較低,因此飼料中即使添加1000mg/kg,家畜喂服后在肝臟中也很難檢測(cè)到殘留物。泰樂(lè)菌素可以遷入奶和蛋中,產(chǎn)蛋母雞和泌乳奶牛禁用。有試驗(yàn)表明,奶17.6mg/kg,連續(xù)5日,停藥后3天內(nèi)奶中可檢出殘留量,平均濃度為0.03mg/kg。牛日因肌此注,奶牛用藥后96h內(nèi)采的奶不能供人類(lèi)食用。肉雞宰殺前,飼服休藥期1天,肌注休藥期3天。火雞和豬宰殺前休藥期5天和21天。第六十九頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日替米考星與其他大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素相比,替米考星用藥安全性低,其毒作用的靶器官是心臟,可引起心動(dòng)過(guò)速和收縮力減弱。內(nèi)服或皮下注射本品后吸收快,組織穿透力強(qiáng),分布容積大,尤以肝和乳中濃度較高。半衰期可達(dá)1~2日,體內(nèi)維持時(shí)間長(zhǎng)。通過(guò)給牛放射性標(biāo)記替米考星的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)主要通過(guò)糞排泄;可食組織、肝和腎中含高濃度的殘留,尤以肝中殘留量為最高且滯留期長(zhǎng);28天后肝中母體殘留量降至1mg/kg;在體內(nèi)滯留時(shí)間長(zhǎng),產(chǎn)奶期奶牛和肉牛犢禁用。第七十頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日紅霉素主要用于耐青霉素金黃葡萄球菌及其他敏感菌所致的各種感染,如肺炎、子宮炎、乳腺炎、敗血癥等。對(duì)雞支原體病(慢性呼吸道病)和傳染性鼻炎也有相當(dāng)療效。也可配成眼膏或軟膏用于皮膚和眼部感染。紅霉素可作為青霉素過(guò)敏動(dòng)物的替代藥物。紅霉素能廣泛分布到各種組織和體液中,在肝和膽汁中含量最高,膽汁中藥物濃度為血清濃度的30倍。大部分藥物在肝臟代謝,主要代謝途徑為脫氧糖胺的N-去甲基化。主要經(jīng)膽汁排泄,部分在腸道屮重吸收,少量以原形經(jīng)尿排泄。其消除半衰期:豬1.21h,黃牛1.97h。第七十一頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日竹桃霉竹桃霉素內(nèi)服吸收慢,內(nèi)服需用三乙酰竹桃霉素,但三乙酰竹桃霉素連續(xù)服用會(huì)損害肝臟,有皮膚過(guò)敏或腹瀉等反應(yīng)。三乙酰竹桃霉素在體內(nèi)可代謝,但竹桃霉素在體內(nèi)不代謝。內(nèi)服或注射后,大部分組織如肝、腎、脾、心、肺和膽中可以檢測(cè)到殘留物。第七十二頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日螺旋霉素內(nèi)服胃腸吸收不規(guī)則,吸收后廣泛分布于體內(nèi)。部分藥物被胃酸分解為新螺旋霉素，其抗菌活性與螺旋霉素相似。螺旋霉素在肝臟代謝,主要經(jīng)膽汁和腎排泄,部分由乳汁排出,乳汁中新螺旋霉素濃度是螺旋霉素濃度的6%~7%。螺旋霉素在體內(nèi)吸收后滯留時(shí)間較長(zhǎng),藥效維持時(shí)間長(zhǎng)。牛注射30mg/kg后,肝和腎中藥物濃度較高,肝中滯留期28天。犢牛日飼服25mg/kg,連續(xù)7日,肝和腎中藥物殘留很高,休藥24天降至0.1mg/kg,而脂肪和肌肉休藥3天后檢測(cè)不出殘留量。第七十三頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日吉他霉素本品內(nèi)服吸收良好,廣泛分布于主要臟器,尤以腎和肝中濃度為最高。豬單次內(nèi)服20g/kg,0.5h達(dá)血藥峰濃度4.5mg/kg,半衰期0.7h,1~2h達(dá)腎藥峰濃度21mg/kg,腎/肝最高濃度比約為3/2。主要經(jīng)肝膽系統(tǒng)排泄,在膽汁和糞中濃度高,少量經(jīng)腎排泄。吉他霉素在腸道內(nèi)吸收快,但釋出亦快,24h后在臟器中無(wú)明顯殘留,故其在組織中殘留量是大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素中最低的一種。第七十四頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日林可霉素內(nèi)服后可自胃腸道吸收,不被胃酸所破壞,空腹內(nèi)服僅20~30%被吸收,食物可降低其吸收速度和吸收量。吸收后除腦脊液外,廣泛及迅速分布于各體液和組織中,并能滲入骨組織內(nèi),也能進(jìn)入乳汁和透過(guò)胎盤(pán)。林可霉素主要在肝內(nèi)代謝,大部分隨膽汁排泄,少部分隨尿和乳汁排泄。犬內(nèi)服后經(jīng)糞便排泄的藥物占77%,經(jīng)尿排泄的占14%。肌內(nèi)注射給藥的消除半衰期為小動(dòng)物3~4h、豬66.79h、奶牛2.2h、黃牛4.13h、水牛9.27h、馬8.1h。第七十五頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日克林霉素克林霉素內(nèi)服吸收明顯優(yōu)于林可霉素,它吸收快而完全(約90%),進(jìn)食對(duì)吸收的影響不大；體內(nèi)分布廣泛,可進(jìn)入唾液、呼吸系統(tǒng)、胸腔積液、膽汁、肝臟、軟組織、骨和關(guān)節(jié)等,也可透過(guò)胎盤(pán),但不易進(jìn)入腦脊液中?？肆置顾卦诟闻K代謝,部分代謝物可保留抗菌活性。代謝物由膽汁和尿液排泄,約10%給藥量以活性成分由尿排出,其余以不具活性的代謝產(chǎn)物排出。第七十六頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日（一）樣品處理大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和林可霉素類(lèi)都是弱堿性化合物,微溶于水,易溶于有機(jī)溶劑。除了竹桃霉素,大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素在酸性或堿性條件下都不穩(wěn)定。大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素為多官能團(tuán)的糖苷結(jié)構(gòu),由大環(huán)內(nèi)酯苷元部分和至少一個(gè)氨基糖組成。此類(lèi)藥物有14-內(nèi)酯環(huán)的紅霉素和竹桃霉素,以及多烯大環(huán)內(nèi)酯的納他霉素和兩性霉素等。第七十七頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日1、提取及脫蛋白液體樣品(如牛奶)中的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和林可霉素類(lèi)殘留分析時(shí),一般先對(duì)樣品離心脫蛋白處理。半固體樣品(如肌肉、腎臟、肝臟)要進(jìn)行研磨或勻漿處理,破碎組織。欲有效提取食物中的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和林可霉素類(lèi)殘留,首先要將結(jié)合態(tài)的藥物解離出來(lái),盡可能去除蛋白質(zhì),這樣能得到高的提取效率。第七十八頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日由于本類(lèi)抗生素與蛋白質(zhì)的結(jié)合不是很強(qiáng),對(duì)于液體樣品的提取/脫蛋白,通常用有機(jī)溶劑振蕩提取,離心脫蛋白質(zhì)。對(duì)于半固體樣品則加入有機(jī)溶劑,均質(zhì)處理。常用的有機(jī)溶劑有乙腈、酸化乙腈或堿化乙腈、甲醇、酸化甲醇或者堿化甲醇、氯仿、堿化二氯甲烷。西地霉素屬中性化合物,組織樣可在酸性介質(zhì)中用乙酸乙酯提取。從魚(yú)組織中提取林可霉素,可先用鎢酸鈉溶液脫蛋白,再用酸性溶液提取。第七十九頁(yè)，共九十一頁(yè)，2022年，8月28日2、凈化樣品的粗提液要通過(guò)各種方法進(jìn)一步純化,這些方法包括液:液分配、固相萃取、液相色譜純化。有時(shí)將幾種方法結(jié)合使用,以獲取高純度的提取物。大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和林可霉素類(lèi)具親脂性,液-液分配時(shí),在堿性介質(zhì)中本類(lèi)抗生素被抑制電離,可用二氯甲烷、乙酸乙酯、氯仿來(lái)提取占提取后有機(jī)提取物蒸發(fā)至干,用流動(dòng)相溶