化學(xué)生物絮凝與化學(xué)混凝污水處理工藝的微生物種群結(jié)構(gòu)比較

化學(xué)生物絮凝與化學(xué)混凝污水處理工藝的微生物種群結(jié)構(gòu)比較分析摘要：從化學(xué)生物絮凝、化學(xué)混凝污水工藝的污泥樣品中提取總DNA，進行PCR擴增，結(jié)合DGGE（變性濃度梯度凝膠電泳），分析了樣品中微生物種群結(jié)構(gòu)，討論并比較了在兩種污水處理工藝中微生物種群結(jié)構(gòu)的不同。結(jié)果證明，在化學(xué)生物絮凝污水處理工藝中，微生物種群龐大且復(fù)雜，并對污染物的處理起到較為重要的作用。關(guān)鍵詞：化學(xué)生物絮凝；化學(xué)混凝；PCR；DGGE；微生物種群結(jié)構(gòu)；Shannon多樣性指數(shù)ComparisionofCommunitystructureanalysisinchemicalandbiologicalflocculationwithchemicalcoagulationprocessAbstract:Inthispaper,thedifferenceofthecommunitystructurebetweenthechemical-biologicalflocculationandchemicalcoagulationwastewatertreatmentprocesshasbeendiscussedandcompariedwithmolecularbiologicalmethods,suchasDNAextraction,polymerasechainreaction(PCR)anddenaturtinggradientgelelectrophoresis(DGGE).Theresulthasindicatedthathighnumberofbacterialspeciespresentedinthesludgeofthechemical-biologicalflocculationprocesswithcomplexity,whichplayedanimportantroleintheremovalofthepollutant.KeyWords:chemicalandbiologicalflocculation,chemicalcoagulation,PCR,DGGE,activatedsludge,microbialcommunitystructure,ShannonDiversityIndex城市污水化學(xué)－生物絮凝強化一級處理是利用化學(xué)混凝和生物絮凝聯(lián)合作用強化沉淀的污水處理工藝，一般由一個停留時間較短（約30min）的曝氣池和沉淀池構(gòu)成。工藝中采用空氣混合絮凝反應(yīng)和污泥回流，利用外加的化學(xué)混凝劑和污水中的天然生物絮凝劑，將化學(xué)混凝處理與生物絮凝強化處理相結(jié)合，充分發(fā)揮生物的絮凝吸附作用以及化學(xué)混凝對顆粒狀和膠體狀物質(zhì)的去除作用，試驗中應(yīng)用PCR－DGGE技術(shù)對化學(xué)生物絮凝工藝及化學(xué)混凝反應(yīng)器中微生物種群進行了初步的比較分析。1.試驗材料和方法1.1樣品的采集及預(yù)處理：污泥樣品取自上海安亭污水處理廠國家“863”計劃課題污水處理中試裝置（以下稱化學(xué)生物絮凝處理工藝及化學(xué)混凝處理工藝）（見圖1），化學(xué)生物絮凝處理工藝中曝氣池采用微孔曝氣管曝氣，分三段推流回轉(zhuǎn)式布置，階梯式速度梯度變化，每段可獨自調(diào)節(jié)曝氣量以改變速度梯度?；瘜W(xué)混凝采用機械攪拌，分三格推流式布置。兩反應(yīng)器中加藥量為：PAFC70mg·L-1。取樣條件以及運行參數(shù)見表1。圖1化學(xué)生物絮凝、化學(xué)混凝處理工藝中試裝置圖（50t·d-1）Fig1Thepilotplant(50t/d)inShanghaiAntingwastewatertreatmentplant表1取樣位置和條件Table1Thepositionsandprocessconditionsforsampling取樣裝置進水化學(xué)生物絮凝污水水處理中試裝裝置化學(xué)混凝污水處理理中試裝置取樣位置------化學(xué)生物絮凝反應(yīng)應(yīng)池一、二、三三廊道化學(xué)混凝反應(yīng)池一一、二、三格格樣品名稱Sample1Sample2,3,,4Sample5,6,,7運行情況DO(mg·L--1)------一、二、三廊道分分別為3.7、3.1、1.7-------pH------6.9～7.36.8～7.533絮凝劑------投加聚合硫酸鋁鐵鐵70mgg·L-1COD(mg·LL-1)174.6264.8688.74NH3-N(mgg·L-1)14.5410.5411.62TP(mg·LL-1)3.410.931.6樣品預(yù)處理過程見圖2，化學(xué)混凝池樣品取泥水混合物1000ml，其余步驟同進水。圖2樣品預(yù)處理過程Fig.2Thepre-treatmentofthesample1.2DNA提?。悍椒霸噭┮娢墨I3-6。提取到的總DNA用0.5％的瓊脂糖凝膠電泳（瓊脂糖1g，0.5×TBE緩沖液100mL,電泳緩沖液為0.5×TBEbuffer）進行檢測，在紫外燈下觀察拍照。電泳所用Marker為寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)的λ-HindⅢdigest。1.3PCR引物及程序、PCR產(chǎn)物濃縮：見表2，PCR產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，在紫外燈下觀察拍照。電泳所用Marker為寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)的DNAMarkerDL2000。表2試驗中所用PCR引物及條件Table1PCRprimersandconditionsusedinthisstudyPCR引物P15`-ATTAACCGCGGGCTGCCTGG-33`P25`-CCGCCCGGCCGCGGCGCGGGCGGGCCGGGGCCGGGGGGCACGGGGGGGCCCCCATACGGGGAGGGCAGCAAG-3`PCR擴增程序94℃預(yù)變性2mmin94℃，45s裂裂解共30cycless72℃延伸100min60℃，45s退退火72℃，90s延延伸PCR反應(yīng)體系無菌ddH2O399μL，10×PCCRbufffer55μL，2.5mmmol·L-1dNTP溶液1μL，10mmmol·L-1引物P1、P2各1μL，Taq酶1U，樣品DNA溶液2μL合并6管PCR產(chǎn)物，用Parafilm膜封口，-70℃冷凍過夜，取出后用冷凍干燥機抽干4小時，將得到的干粉溶解于30μLddH2O中,-20℃保存。1.4DGGE條件：PCR產(chǎn)物進一步用DGGE（變性梯度凝膠電泳）分離，儀器為DcodeTMSystem(bio-RadLaboratories)。凝膠變性梯度30%～60%，聚丙烯酰胺濃度8%，厚1mm，電泳緩沖液為0.5×TAE，電壓150V，60℃，電泳時間4h。在含溴乙錠（0.5mg·L-1）0.5×TAE緩沖液中染色后，在紫外燈下觀察拍照。1.5生物多樣性分析分析出DGGE圖譜的密度曲線后（SmartView軟件），利用Shannon多樣性指數(shù)計算樣品的生物多樣性，Shannon多樣性指數(shù)計算公式如下：其中：H-Shannon多樣性指數(shù)；ni-第i個條帶的峰高值；N-密度曲線中所有峰高之和。1.6污泥樣品顯微鏡觀察取污泥樣品，在Leica顯微鏡下觀察并拍照。2結(jié)果與討論2.1污泥樣品總DNA提取結(jié)果從樣品中提取的總DNA通過0.5％的瓊脂糖凝膠電泳檢驗，通過SmartView軟件分析提取出的DNA片段大小約為23kb，樣品濃度計算結(jié)果列于表2。表2樣品DNA濃度Table2TheconcentrationofextractedDNA樣品1234567DNA濃度(ugg·L-1)0.1222832410269.68.77.5從表2可以看出化學(xué)生物絮凝反應(yīng)體系中DNA含量（樣品2，3，4）約為化學(xué)混凝池體系中（樣品5，6，7）的20-100倍左右，這說明在前者的反應(yīng)體系中存在含量較高的微生物；另外從表1可以看出，在投加相同劑量的絮凝劑時，化學(xué)生物絮凝工藝對污水當中污染物的去除表現(xiàn)出更高的去除率，由此可以初步判斷，在化學(xué)生物絮凝工藝中，微生物的存在及其作用是比較明顯的，但微生物對污染物的去除途徑究竟是以生物降解還是生物吸附為主則有待于更深入的研究。2.2PCR擴增結(jié)果取2μLDNA樣品作為模板，進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗，經(jīng)SmartView軟件分析，擴增得到的DNA片段大小為220bp左右，為要擴增的目的片段。2.316SrRNA基因片段PCR擴增的DGGE結(jié)果圖3是經(jīng)分離的16SrRNA的DGGE圖譜，圖中亮度明顯的條帶較少，同時也由于存在較多的亮度比較暗的條帶，導(dǎo)致圖譜中條帶有一定的模糊，這可能是由于在活性污泥樣品中，存在著數(shù)量龐大的細菌種類。圖3擴增后樣品DGGEFig.316SrDNAseparatedbyDGGEDGGE圖譜中條帶的數(shù)目和亮度并不能完全準確地反映微生物群落中種的數(shù)量和豐富程度。由于rRNA操縱子的多樣性、異相性，使得一種微生物可能會產(chǎn)生多個DGGE條帶[8-10]。另一方面，部分的16srDNA序列并非總是能做到“種”（species）之間的區(qū)分，使得一個DGGE條帶可能會代表幾種具有相同部分的16srDNA序列的種[11]。此外，在模板DNA中，由于濃度的不同，使得數(shù)量少的序列擴增不充分，在DGGE膠片中無法看到相應(yīng)的條帶，因此DGGE圖譜中僅僅反映了樣品中數(shù)量最豐富的DNA類型。由于16srDNADGGE存在的諸多缺陷，由擴增16srDNA序列得到的DGGE條帶圖譜而計算的生物多樣性僅僅能作為一種指示，而不能作為衡量生物多樣性的一個絕對指標[12]。參照進水樣品，可將圖3中條帶代表的菌種大致分為三類（見表2）。表2樣品菌種分類Table2ThecategoryofthebacteriaintheDGGEprofile菌種種類典型條帶化學(xué)生物絮凝池化學(xué)混凝池與進水樣品比較，細細菌數(shù)量增加加的Bandb,cc,f,h,,i,j,kkBandc,ff,g與進水樣品比較，細細菌數(shù)量變化化不大的Banda,ee,gBande與進水樣品比較，細細菌數(shù)量減少少的BanddBanda,bb,d,i,,k在化學(xué)生物絮凝池中，與進水樣品比較，細菌數(shù)量增加的微生物種類較多，一方面這是因為反應(yīng)器中30%的污泥回流量增加了微生物量，另一方面也說明這些細菌能夠很好地適應(yīng)環(huán)境的變化，甚至可能還在進行細菌的繁殖。比較樣品1、5、6、7的DGGE圖，可以看出，化學(xué)混凝池內(nèi)的細菌種類基本與進水相一致，這也符合在化學(xué)混凝池內(nèi)沒有曝氣供氧、沒有污泥回流，其內(nèi)微生物主要來自進水的原則，也符合在化學(xué)混凝池內(nèi)，污染物如COD、SS、TP的去除，主要來自化學(xué)藥劑引起的絮凝作用，而與微生物作用無關(guān)。2.4樣品多樣性指數(shù)分析根據(jù)Shannon多樣性指數(shù)公式進行計算，結(jié)果列于表3中。表3Shannon多樣性指數(shù)計算結(jié)果Table3TheShannonDiversityIndex樣品1234567H1.821.701.671.641.731.711.70Shannon多樣性指數(shù)H通常用于評價一個微生物種群內(nèi)物種的豐富性，H值越高，微生物種群越豐富。多樣性指數(shù)通常由兩個因素構(gòu)成：①樣品中物種的數(shù)量或稱為種的豐富度，②各個物種的量的分布或稱為種的均勻度。由表3可以看出，進水樣品（樣品1）H值最高，這是由于樣品1中（見圖3）條帶數(shù)目較多而且優(yōu)勢菌種較少的結(jié)果。進水樣品中微生物種群最為豐富，各種群數(shù)量分布比較均勻，數(shù)量明顯占優(yōu)勢的菌種較少，在環(huán)境發(fā)生改變（氧氣、添加PAFC等）的情況下，進水中一些微生物由于不能適應(yīng)而遭到淘汰，存活在反應(yīng)器中的菌種則能夠很好地適應(yīng)反應(yīng)器的條件。2.5顯微鏡觀察結(jié)果圖4是對污泥樣品進行鏡檢的結(jié)果（2000倍）。化學(xué)混凝池的污泥樣品，絮體松散，顏色呈暗灰，是典型的化學(xué)污泥狀態(tài)；在化學(xué)生物絮凝池第二廊道的污泥樣品中，觀察到有鐘蟲的存在，菌膠團呈活性污泥的黃褐色，這更進一步說明在化學(xué)生物絮凝池中微生物作用的存在。圖4-a樣品3顯顯微鏡觀察結(jié)結(jié)果圖4-b樣品6顯顯微鏡觀察結(jié)結(jié)果Fig.4-aTThemiicrogrraphoofsammple33Fig.4-aTThemiicrogrraphoofsammple663結(jié)論在化學(xué)生物絮凝反應(yīng)器中，微生物多樣性相當豐富（表3），微生物種群結(jié)構(gòu)也比較復(fù)雜。在化學(xué)混凝反應(yīng)器中，微生物種類同樣較為豐富，但數(shù)量與化學(xué)生物絮凝反應(yīng)器比較則極少（表2）。結(jié)合表1的數(shù)據(jù)可以看出，化學(xué)生物絮凝池內(nèi)由于生物作用的存在，使得其對污染物的去除率顯著高于化學(xué)混凝池。對于化學(xué)生物絮凝池，進水中的微生物根據(jù)其在反應(yīng)器中濃度的變化大致可以劃分為三類：增加、維持不變和減少。圖3中Bindb、c、i、j等條帶所代表的菌種，屬于優(yōu)勢菌種，很有可能是反應(yīng)器中生物作用的主體。對兩套反應(yīng)器內(nèi)污泥樣品的顯微鏡觀察結(jié)果同樣表明，在曝氣且有污泥回流的化學(xué)生物絮凝池內(nèi)，微生物生長狀態(tài)較好，明顯不同于化學(xué)污泥，有較好的生物作用存在。由于污泥樣品成分復(fù)雜，樣品中的痕量重金屬，鹽類，均有可能在樣品的DNA提取，PCR擴增，DGGE分離過程中產(chǎn)生復(fù)雜的影響，使得利用PCR－DGGE分子生物學(xué)技術(shù)對污泥樣品的微生物分析存在一定的困難，本文只是進行了該技術(shù)在污水處理樣品中的初步研究，相信隨著研究的深入，結(jié)合常規(guī)的微生物培養(yǎng)分離、微生物鏡檢等技術(shù)，對環(huán)境微生物進行研究將會有較好的發(fā)展前景。參考文獻[1]吳志平，夏四清，揚殿海，高廷耀.化學(xué)生物絮凝工藝處理城市污水比較研究.重慶環(huán)境科學(xué)，2003，25(7)：12–14[2]張智，邱維，張國慶.城市污水強化一級處理技術(shù)及發(fā)展趨勢.重慶環(huán)境科學(xué)，2001，23(1)：46–49[3]薩姆布魯克J，弗里奇EF曼尼阿蒂斯T（金冬雁等譯）.分子克隆試驗指南.第二版.北京：科學(xué)出版社，1996.919–929[4]陳灝，唐小樹，林潔等.不經(jīng)培養(yǎng)的農(nóng)田土壤微生物種群構(gòu)成及系統(tǒng)分類的初步研究.微生物學(xué)報，2002，42(4)：478–483[5]YL

TsaiandBH

Olson.RapidmethodfordirectextractionofDNAfromsoilandsediments.Appl.Envir.Microbiol.1991,57(4):1070–1074[6]Bourrain,Muriel;Achouak,Wafa;Urbain,Vincent;Heulin,Thierry.DNAextractionfromactivatedsludges.CurrentMicrobiology.1999,38(6):315–319[7]GW考克斯（蔣有緒譯）．普通生態(tài)學(xué)實驗手冊．北京：科學(xué)出版社，1979.120–124[8]Nubel,U.,Engelen,B.,Felske,A.,Snaidr,J.,Wieshuber,A.,Amann,R.I.,Ludwig,W.andBackhaus,H.Sequenceheterogeneitiesofgenesencoding16SrRNAsinPaenibacilluspolymyxadetectedbytemperaturegradientgelelectrophoresis.J.Bacteriol.1996,178:5636–5643.[9]Rainey,F.A.,WardRainey,N.L.,Janssen,P.H.,Hippe,H.andStackebrandt,E.ClostridiumparadoxumDSM7308(T)containsmultiple16SrRNAgeneswithheterogeneousintervening