保健品檢測衛(wèi)生檢驗

保健品檢測衛(wèi)生檢驗第一頁，共七十八頁，2022年，8月28日前言

健康相關產(chǎn)品：

是指保健食品、化妝品、涉及飲用水衛(wèi)生安全產(chǎn)品、消毒產(chǎn)品等與人體健康密切相關的產(chǎn)品。

第二頁，共七十八頁，2022年，8月28日第一節(jié)有毒有害物質(zhì)的免疫學檢驗一、免疫學技術在環(huán)境中有毒有害物質(zhì)檢測中的應用檢測奶、肉、蛋、肝、蔬菜水果等食品中殘留的農(nóng)藥（殺蟲劑、除草劑）、殘留的抗生素。檢測水和土壤中殘留的農(nóng)藥。水中藻毒素。谷物及其制品中的霉菌毒素。保健功能食品中的激素、毒品、興奮劑等。

國外已有多種檢測試劑盒應用，抗體多為單克隆抗體，而且把免疫學技術與自動化分析儀器相結(jié)合，如免疫親和柱、高效液相色譜法、免疫親和柱－熒光分光光度法。第三頁，共七十八頁，2022年，8月28日二、有毒有害物質(zhì)免疫學檢測方法（一）RIA法（放射免疫分析）應用：環(huán)境樣品中的殺蟲劑、除草劑、激素的測定。缺點：放射元素的污染，特殊的分析儀器。第四頁，共七十八頁，2022年，8月28日二、有毒有害物質(zhì)免疫學檢測方法（二）ELISA法應用最多的技術類型，是競爭抑制法。ELISA主要用于食品中殘留農(nóng)藥、抗生素、激素的檢測。谷物中真菌毒素的檢測和水中藻毒素的檢測。第五頁，共七十八頁，2022年，8月28日二、有毒有害物質(zhì)免疫學檢測方法（三）酶增強免疫測定技術（enzyme-multipliedimmunoassaytechnique，EMIT）用途：用于半抗原或小分子抗原的檢測。原理：將這類抗原接合在酶分子活性點附近，如與相應抗體結(jié)合則封閉了該活性點位，使酶失活，測定時將待測樣品、酶標抗原（半抗原）、特異性抗體一起混合，加酶底物，測定反應體系中酶的活性。由于樣品中待測抗原與酶標記抗原競爭結(jié)合反應體系中限量的抗體，從而使游離酶標抗原量增多，最終測得的酶活性隨著反應體系中未標記待測抗原的濃度升高而增強。第六頁，共七十八頁，2022年，8月28日二、有毒有害物質(zhì)免疫學檢測方法（四）斑點金免疫層析試驗（dotimmunogoldchromatographicassay,DICA）是膠體金標記技術和蛋白質(zhì)層析技術相結(jié)合的以微孔濾膜為載體的快速定性或半定量篩查試驗。應用：毒品、霉菌毒素的檢測等。

第七頁，共七十八頁，2022年，8月28日二、有毒有害物質(zhì)免疫學檢測方法

（五）免疫磁珠用于定量、半定量檢測環(huán)境中殘留的農(nóng)藥。第八頁，共七十八頁，2022年，8月28日三、有毒有害物質(zhì)免疫學檢測的應用(一)殘留農(nóng)藥的檢測1.ELISA法應用：檢測食品、土壤、水中殘留的有機氯、有機磷、甲苯胺、滴滅威、多菌靈、百草枯、擬除蟲菊酯，三嗪類等殺蟲劑、除草劑等。優(yōu)點：比用氣相色譜或高效液相色譜方法所用的試劑費要低20倍，對樣品的處理方法也比較簡單，且兩者的最低檢出限及回收率均吻合。

第九頁，共七十八頁，2022年，8月28日三、有毒有害物質(zhì)免疫學檢測的應用(一)殘留農(nóng)藥的檢測

2.金免疫層析法已有對有機磷（甲基對硫磷、乙基對硫磷）、殺螟硫磷、毒死蜱、呋喃丹等農(nóng)藥檢測的商品膠體金試劑盒。第十頁，共七十八頁，2022年，8月28日(二)真菌毒素的檢測1．黃曲霉毒素的檢測（1）ELISA法主要適用于大批量樣品的定性、定量分析，與常規(guī)標準方法符合率較高。缺點是只能檢測一種毒素。（2）金標記試紙法非常適于現(xiàn)場檢測和大量樣品初篩。

第十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日(二)真菌毒素的檢測1．黃曲霉毒素的檢測（3）免疫親和柱的應用黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1單克隆抗體免疫親和柱均已商品化，用于各種食品、飼料和體液樣品純化、濃縮，為進一步的儀器定量檢測奠定了基礎。

第十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日(二)真菌毒素的檢測2．玉米赤霉烯酮（ZEN）小麥中玉米赤霉烯酮ELISA檢測已納入國家標準方法（GT/T14933-94）。有高靈敏度的ELISA試劑盒商品提供。商品玉米赤霉烯酮免疫親和柱，與熒光計相連接可檢測飼料中的玉米赤霉烯酮檢測范圍為10－200ng/g。檢出限為4ng/g，總回收率為94％，檢測結(jié)果與HPLC法吻合。第十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日(二)真菌毒素的檢測3．脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）我國已把小麥、面粉、玉米粉中DON的ELISA檢測和TCL納入限量標準制定的檢測方法?，F(xiàn)有高靈敏度的ELISA檢測DON試劑盒商品。DONtest免疫親和柱已有商品供應，可與色譜法結(jié)合應用。第十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日（三）人工合成有毒污染物的檢測1．二噁英的檢測雙抗體放射免疫分析ELISA法定量檢測2．多氯聯(lián)苯的檢測

ELISA試劑盒用PCB3多克隆抗體包被磁珠，用于定性、半定量、定量檢測土壤、水、沉淀物、魚漿中的PCB3，檢測范圍為0.25～25.0ppb。第十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日第二節(jié)化妝品的免疫學檢驗第十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日第十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日第十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日第三節(jié)保健食品免疫學檢驗和評價第十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日前言

為了規(guī)定評價保健食品功能的統(tǒng)一程序和試驗規(guī)程，衛(wèi)生部于2003年2月頒發(fā)了保健食品檢驗與評價技術規(guī)范，在確定的檢驗機構(gòu)對其功能學評價方法和試驗結(jié)果進行驗證后，方能向SFDA（StateFoodandDrugAdministration）申報，批準后才可進入市場。第二十頁，共七十八頁，2022年，8月28日前言

保健食品功能的試驗和評價的項目從原來的22項增加到27項，主要有增強免疫功能，輔助降血脂功能，輔助降血糖功能，抗氧化功能，輔助改善記憶功能，緩解疲勞功能，促進排鉛功能等等，保健食品的免疫學檢驗，主要用于對其增強免疫力功能的驗證與評價。第二十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日一、增強免疫力功能檢驗項目

（MethodfortheAssessmentofEnhancingImmuneFunction）（一）細胞免疫功能的檢測（二）體液免疫功能的檢測（三）單核巨噬細胞功能的檢測（四）NK細胞功能的檢測ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應抗體生成細胞檢測血清溶血素的測定小鼠碳廓清實驗小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗乳酸脫氫酶（LDH）測定法第二十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日一、增強免疫力功能檢驗項目實驗動物推薦用近交系小鼠，18-22g，單一性別，每組10-15只。劑量分組及受試樣品給予時間實驗至少應設三個劑量組和一個陰性對照組，必要時設陽性對照組或空白對照組。劑量選擇應合理，盡可能找出最低有效劑量。以人體推薦量的10倍為其中的一個劑量組，另設兩個劑量組，受試樣品給予時間30天，必要時可延長至45天。第二十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日對受試樣品處理的要求受試樣品推薦量較大，超過灌胃量，可以適當減少樣品中非功效成分的含量，或濃縮。如：60-70℃減壓濃縮。對合理設置對照組的要求以載體和功效成分組成的受試樣品，當載體本身可能具有相同功能時，應將該載體作為對照。第二十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日二、免疫學檢驗方法（一）ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗（MTT法）

1．原理：當T淋巴細胞受ConA刺激后發(fā)生母細胞轉(zhuǎn)化，活細胞特別是增殖細胞通過線粒體水解酶將MTT（一種淡黃色的唑氮鹽）分解為蘭紫色結(jié)晶而顯色，其光密度值能反映細胞的增殖情況。

ConA刺激48~72小時第二十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日（一）ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗（MTT法）

2.儀器和材料RPMI1640細胞培養(yǎng)液、小牛血清、2-巰基乙醇（2-ME）、青霉素、鏈霉素、刀豆蛋白A(ConA)、鹽酸、異丙醇、MTT、Hank's液、PBS緩沖液（pH7.2-7.4)紗布或200目篩網(wǎng)、24孔培養(yǎng)板，96孔培養(yǎng)板(平底),手術器械、二氧化碳培養(yǎng)箱、酶標儀、721分光光度計、超凈工作臺、高壓滅菌器、無菌濾器。第二十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日（一）ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗（MTT法）3.試劑配制完全培養(yǎng)液：RPMI1640培養(yǎng)液過濾菌，用前加入10%小牛血清，1%谷氨酰胺（20mmol/L)，青霉素（100U/mL),鏈霉素（100g/L)及5×10mol/L的2-巰基乙醇，用無菌的1mol/L的HC1或1mol/L的NaOH調(diào)pH至7.0-7.2,即完全培養(yǎng)液。ConA液：用雙蒸水配制成100g/mL的溶液，過濾除菌，在低溫冰箱(-20)保存。無菌Hank‘s液：用前以3.5%的無菌NaHCO3調(diào)。MTT液：將5mgMTT溶于1mLpH7.2的PBS中，現(xiàn)配現(xiàn)用。酸性異丙醇溶液：96mL異丙醇中加入4mL1mol/L的HC1，臨用前配制。第二十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日4.技術要點：

（1）脾細胞懸液制備無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank’s液平皿中。用4層紗布將脾磨碎，制成單個細胞懸液。用Hank’s液洗2次，每次離心10min（1000r/min）。然后將細胞懸浮于1ml的完全培養(yǎng)液中。用臺盼蘭染色計數(shù)活細胞數(shù)（應在95%以上），調(diào)整細胞濃度為3×106個/ml。（一）ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗（MTT法）第二十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日（一）ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗（MTT法）（2）淋巴細胞增殖反應將脾細胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1ml。一孔加75μlConA液（相當于7.5μg/ml），另一孔作為對照，置5％CO2，37℃CO2孵箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔輕輕吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，同時加入MTT（5mg/ml）50μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1ml酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，每個孔分裝3～6孔作為平行樣，用酶聯(lián)免疫檢測儀，以570nm波長測定光密度值。第二十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日（一）ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗（MTT法）（3）實驗中ConA的濃度的確定選擇有絲分裂原時ConA的濃度很重要，ConA的濃度過高會產(chǎn)生抑制作用，不同批號的ConA在實驗前要預試，以找到最佳刺激分裂濃度。第三十頁，共七十八頁，2022年，8月28日（一）ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗（MTT法）5．結(jié)果判定：淋巴細胞的增殖能力=加ConA孔的光密度值–不加ConA孔的光密度值

受試樣品組的光密度差值顯著高于對照組的光密度差值，可判定該項實驗結(jié)果陽性。第三十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日（一）ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗（MTT法）6.數(shù)據(jù)處理

一般用方差分析，先檢驗方差齊性，方差齊，計算F值，F(xiàn)值<F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換；若變量轉(zhuǎn)換仍達不到要求，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。第三十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日（二）二硝基氟苯誘導的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應（耳腫脹法）1．原理二硝基氟苯（DNFB）是一種半抗原，將其稀釋液涂抹小鼠腹壁皮膚后，與皮膚蛋白結(jié)合成完全抗原，由此刺激T淋巴細胞增殖成致敏淋巴細胞。4d～7d后再將其涂抹于耳部，使局部產(chǎn)生遲發(fā)型變態(tài)反應。一般在抗原攻擊后24h～48h達高峰，故于此時測定其腫脹程度。第三十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日（二）二硝基氟苯誘導的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應（耳腫脹法）2.材料DNFB、丙酮、麻油、硫化鋇、打孔器3.試劑配制DNFB溶液：應新鮮配制，稱取DNFB50mg，置清潔干燥小瓶中，將預先配制好的5ml丙酮麻油溶液（v/v=1:1），倒入小瓶，蓋好瓶塞并用膠布密封?；靹蚝螅?50μl注射器通過瓶蓋取用。第三十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日（二）二硝基氟苯誘導的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應（耳腫脹法）4.技術要點（1）致敏小鼠腹部皮膚用硫化鋇脫毛，范圍約3cm×3cm，用DNFB溶液50μl均勻涂抹致敏。（2）遲發(fā)性變態(tài)反應的產(chǎn)生與測定5天后，用DNFB溶液10μl均勻涂抹于小鼠右耳（兩面）進行攻擊。攻擊后24h頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼。用打孔器取下直徑8mm的耳片，稱重。第三十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日（二）二硝基氟苯誘導的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應（耳腫脹法）5.結(jié)果判定

用左右耳重量之差表示遲發(fā)型變態(tài)反應的程度。受試樣品組的重量差值顯著高于與對照組的重量差值，可判定該項實驗結(jié)果陽性。6.注意事項操作時避免DNFB與皮膚接觸。第三十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日（三）抗體生成細胞檢測（Jerne改良法）1．原理

用綿羊紅細胞（SRBC）免疫的小鼠脾細胞懸液與一定量的SRBC混合，在補體參與下，使分泌抗體的脾細胞周圍的SRBC溶解，形成肉眼可見的空斑。溶血空斑數(shù)大體可反映抗體分泌細胞數(shù)。第三十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日（三）抗體生成細胞檢測（Jerne改良法）2.儀器和材料二氧化碳培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、離心機、手術器械、玻片架、200目篩網(wǎng)、SRBC、補體（豚鼠血清）、Hank's液、RPMI1640培養(yǎng)液、SA緩沖液、瓊脂糖。第三十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日（三）抗體生成細胞檢測（Jerne改良法）3.技術要點（1）SRBC綿羊紅細胞的制備綿羊頸靜脈取血。將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中，朝一個方向搖動，以脫纖維。放入4℃冰箱保存?zhèn)溆?，可保?周。第三十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日（三）抗體生成細胞檢測（Jerne改良法）（2）制備補體采集豚鼠血，分離出血清（至少5只豚鼠的混合血清）。將1ml壓積SRBC加入到5ml豚鼠血清中。4℃冰箱放置30min，經(jīng)常振蕩。離心取上清，分裝，－70℃保存。用時以SA緩沖液按1∶8～15稀釋。第四十頁，共七十八頁，2022年，8月28日（三）抗體生成細胞檢測（Jerne改良法）（3）玻片涂膜在清潔玻片上刷上一薄層瓊脂（0.5%），干后可長期保存?zhèn)溆?。第四十一頁，共七十八頁?022年，8月28日（三）抗體生成細胞檢測（Jerne改良法）（4）免疫動物取脫纖維羊血，用生理鹽水洗滌3次，每次離心（2000r/min）10min，計數(shù)細胞。每只鼠經(jīng)腹腔或靜脈注射SRBC5×107～2×108個。也可將壓積SRBC用生理鹽水配成2%（v/v）的細胞懸液，每只鼠腹腔注射0.2ml。第四十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日（三）抗體生成細胞檢測（Jerne改良法）（5）脾細胞懸液制備將SRBC免疫4～5d后的小鼠頸椎脫臼處死。取出脾臟，放在盛有Hank‘s液的小平皿內(nèi)，用4層紗布將脾磨碎，制成細胞懸液，離心10min（1000r/min），用Hank’s液洗2遍。最后將細胞懸浮在5mlRPMI1640培養(yǎng)液中，計數(shù)細胞，并將細胞濃度調(diào)整為5×106個/ml。第四十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日（三）抗體生成細胞檢測（Jerne改良法）（6）空斑的測定將表層培養(yǎng)基（1%瓊脂糖）加熱溶解后，放45℃水浴保溫，與等量pH7.2～7.4、2倍濃度的Hank‘s液混合，分裝小試管，每管0.5ml。再向管內(nèi)加50μl10%SRBC(v/v，用SA液配制)，20μl脾細胞懸液（5×106個/ml），迅速混勻，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，做平行片。待瓊脂凝固后，將玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育1～1.5h。然后用SA緩沖液稀釋的補體（1：8）加入到玻片架凹槽內(nèi)。繼續(xù)孵育1～1.5h后，計數(shù)溶血空斑數(shù)。第四十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日（三）抗體生成細胞檢測（Jerne改良法）4.結(jié)果判定用空斑數(shù)/106脾細胞表示。

受試樣品組的空斑數(shù)顯著高于對照組的空斑數(shù)，可判定該項實驗結(jié)果陽性。第四十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日（四）血清溶血素的測定

半數(shù)溶血值（HC50）的測定

1.原理用SRBC免疫動物后，血清中出現(xiàn)SRBC抗體（溶血素），在補體參與下，與SRBC一起孵育，可發(fā)生溶血反應，釋放血紅蛋白，通過測定血紅蛋白含量反映動物血清中溶血素的含量。第四十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日（四）血清溶血素的測定

半數(shù)溶血值（HC50）的測定

2.儀器和材料分光光度計、離心機、恒溫水浴、SRBC、補體（豚鼠血清）、SA緩沖液、都氏試劑（碳酸氫鈉1.0g、高鐵氰化鉀0.2g、氰化鉀0.05g,加蒸餾水至1000mL）第四十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日（四）血清溶血素的測定

半數(shù)溶血值（HC50）的測定3.技術要點（1）SRBC制備（2）制備補體

第四十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日（四）血清溶血素的測定

半數(shù)溶血值（HC50）的測定（3）免疫動物及血清分離取羊血，用生理鹽水洗滌3次，每次離心（2000r/min）10min。將壓積SRBC用生理鹽水配成2%（v/v）的細胞懸液，每只鼠腹腔注射0.2mL進行免疫。4-5天后，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，放置約1h，使血清充分析出，2000r/min離心10min,或6000r/min,4min,收集血清。第四十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日（四）血清溶血素的測定

半數(shù)溶血值（HC50）的測定（4）溶血反應取血清用SA緩沖液稀釋（一般為200-500倍）。將稀釋后的血清1mL置試管內(nèi)，依次加入2%(v/v)SRBC0.5mL,補體1mL（用SA液按1：8稀釋），另設不加血清的對照管（以SA緩沖液代替）。置37℃恒溫水浴中保溫15-30min后，冰浴終止反應。2000r/min。取上清液1mL，加都氏試劑3mL,同時取2%(v/v)SRBC0.25mL加都氏試劑至4mL,充分混勻。放置10min后，于540nm處以對照管作空白，分別測定各管光密度值。第五十頁，共七十八頁，2022年，8月28日（四）血清溶血素的測定

半數(shù)溶血值（HC50）的測定（5）結(jié)果判定溶血素的量以半數(shù)溶血值（HC50）表示，按下列公式計算。

樣品光密度值

HC50=×稀釋倍數(shù)

SRBC半數(shù)溶血時的光密度值受試樣品組的HC50顯著高于對照組的HC50，可判定該項實驗結(jié)果陽性。第五十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日（五）小鼠碳廓清實驗1．原理在一定范圍內(nèi)，體內(nèi)碳顆粒的清除速率與其劑量呈指函數(shù)關系。以血碳濃度對數(shù)值為縱坐標，時間為橫坐標，兩者成直線關系。此直線斜率（K）可表示吞噬速率。動物肝、脾重量影響吞噬速率，一般以校正吞噬指數(shù)a表示。第五十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日（五）小鼠碳廓清實驗2.儀器和試劑

721分光光度計、計時器、血色素吸管、印度墨汁、Na2CO3第五十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日（五）小鼠碳廓清實驗3．技術要點（1）注射用墨汁配制將印度墨汁原液用生理鹽水稀釋3～4倍。（2）注射墨汁稱小鼠體重，從小鼠尾靜脈注入稀釋的印度墨汁，按每10g體重0.1ml計算。待墨汁注入，立即計時。第五十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日（五）小鼠碳廓清實驗（3）測定注入墨汁后2、10min，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20μl，并立即將其加到2ml0.1%Na2CO3溶液中。用721分光光度計在600nm波長處測光密度值（OD）。以Na2CO3溶液作空白對照。第五十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日（五）小鼠碳廓清實驗（4）肝脾稱重

將小鼠處死，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重。第五十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日（五）小鼠碳廓清實驗4．結(jié)果判定

以吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清的能力。按下式計算吞噬指數(shù)a。

lgOD1-lgOD2K＝───────

t2－t1

體重吞噬指數(shù)a＝───────×3√K

肝重＋脾重

受試樣品組的吞噬指數(shù)顯著高于對照組的吞噬指數(shù)，可判定該項實驗結(jié)果陽性。第五十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日（五）小鼠碳廓清實驗5.注意事項靜脈注入碳粒的量、取血時間、取血量一定要準確。墨汁放置中，碳?？沙劣谄康?，臨用前應搖勻。使用新的墨汁時，應在實驗前摸索一個最適墨汁注入量，即正常小鼠在20min內(nèi)不容易廓清。第五十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日（六）小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗（滴片法）

1.原理：是利用巨噬細胞對光滑表面如玻璃表面具有粘附的特性，將含有巨噬細胞的腹腔液滴于載玻片上，加入雞紅細胞，孵育一定時間后，沖洗掉無粘附力或粘附力差的細胞，固定染色，，獲得以巨噬細胞為主的標本，在顯微鏡下計數(shù)吞噬雞紅細胞的巨噬細胞的百分比和吞噬指數(shù)，據(jù)此判定巨噬細胞的吞噬能力。第五十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日（六）小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗（滴片法）2.儀器和材料顯微鏡、37℃孵箱、計數(shù)器、手術器械一套、注射器、滴管、膠頭吸管、吸耳球、載玻片、染色槽、試管第六十頁，共七十八頁，2022年，8月28日（六）小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗（滴片法）3．技術要點（1）1％雞紅細胞懸液：實驗前取雞頸靜脈或動脈血，置于盛有玻璃珠（20個左右）的三角瓶內(nèi)，連續(xù)順一個方向充分搖動5min～10min，除去纖維蛋白，4℃冰箱保存。實驗前用生理鹽水洗滌3次，每次1500r/min，離心10min，棄去上清。按血球壓積用Hank’s液配制成1％的紅細胞懸液。第六十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日去纖維蛋白第六十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日（六）小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗（滴片法）（2）小鼠巨噬細胞的激活:實驗前4d給每只小鼠腹腔注射2%壓積羊血紅細胞0.2ml。用頸椎脫臼法處死小鼠，腹腔注射加小牛血清的Hank‘s液4ml/只，輕輕按揉腹部數(shù)次。然后將腹壁剪開一個小口，用膠頭吸管吸取腹腔洗液2ml于試管內(nèi)（或用注射器）。用1ml加樣器吸取腹腔洗液0.5ml加入盛有0.5ml1％雞血紅細胞懸液的試管內(nèi)，混勻。用注射器（裝大針頭）吸取0.5ml混合液，加入玻片。放置孵箱內(nèi)37℃孵育15～20分鐘。孵育結(jié)束后迅速用生理鹽水將未貼壁細胞沖掉，于甲醇液中固定1分鐘，Giemsa液染色15分鐘。用蒸餾水沖洗干凈，晾干。第六十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日（六）小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗（滴片法）（3）實驗操作過程中應嚴格掌握時間。

怎樣解決各實驗組玻片作用時間不一致的誤差？？第六十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日（六）小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗（滴片法）（4）計數(shù)

用40×顯微鏡計算吞噬率和吞噬指數(shù)。每張片計數(shù)100個巨噬細胞，按下式計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。

吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)吞噬百分率（%）=───────────────×100

計數(shù)的巨噬細胞數(shù)

被吞噬的雞紅細胞總數(shù)吞噬指數(shù)=─────────────

計數(shù)的巨噬細胞數(shù)第六十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日小鼠腹腔中分離巨噬細胞第六十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日腹水中巨噬細胞第六十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日巨噬細胞第六十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日（六）小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗（滴片法）4．結(jié)果判定

以吞噬百分率或吞噬指數(shù)表示小鼠巨噬細胞的吞噬能力。

受試樣品組的吞噬百分率、吞噬指數(shù)與對照組吞噬百分率、吞噬指數(shù)比較，差異均有顯著性，方可判定該項實驗結(jié)果陽性。第六十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日（六）小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗（滴片法）5.注意事項頸椎脫臼處死小鼠勿用力過大，防止腹腔內(nèi)血管和內(nèi)臟破裂出血影響實驗結(jié)果。放滴片的搪瓷盤內(nèi)應保持一定的濕度，以防液體干燥。孵育后的標本沖洗次數(shù)的差別不宜太大，更不要直接沖在有細胞的部分。在鏡下計數(shù)細胞時要數(shù)完一個視野后再換另一個視野。第七十頁，共七十八頁，2022年，8月28日（七）NK細胞活性測定－乳酸脫氫酶（LDH）測定法1．原理活細胞的胞漿內(nèi)含有LDH。正常情況下，LDH不能透過細胞膜，當細胞受到NK細胞的殺傷后，LDH釋放到細胞外。LDH可使乳酸鋰脫氫，進而使NAD還原成NADH，后者再經(jīng)遞氫體吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）還原碘硝基氯化四氮唑（INT），INT接受H＋被還原成紫紅色甲臢類化合物。在酶標儀上用490nm比色測定。第七十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日（七）NK細胞活性測定－乳酸脫氫酶（LDH）測定法2.儀器和材料酶標儀、YAC-1細胞、Hank’s液（）、RPMI1640完全培養(yǎng)液、乳酸鋰、硝酸氯化四氮唑（INT）、吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）、NAD、0.2mol/L的Tris-HCl緩沖液（PH8.2）、1%NP40或2.5%Triton第七十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日（七）NK細胞活性測定－乳酸脫氫酶（LDH）測定法3.試劑配制LDH基質(zhì)液的配制乳酸鋰5×10-2mol/L硝酸氯化四