WATERS液相色譜教程三四七最全

會(huì)計(jì)學(xué)1WATERS液相色譜教程三四七最全啟動(dòng)液相色譜儀器的流程開啟HPLC系統(tǒng)各個(gè)設(shè)備的電源打開泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、檢測(cè)器電源，待設(shè)備通過(guò)自檢后，打開計(jì)算機(jī)，啟動(dòng)色譜管理軟件準(zhǔn)備流動(dòng)相過(guò)濾,脫氣色譜泵排氣用新配制的流動(dòng)相灌注泵第1頁(yè)/共141頁(yè)啟動(dòng)液相色譜儀器的流程用準(zhǔn)備好的流動(dòng)相平衡色譜系統(tǒng)可在泵的控制面板上設(shè)定流速參數(shù)(15×5泵需在軟件控制下操作)系統(tǒng)大約需平衡0.5--1小時(shí)方能穩(wěn)定工作準(zhǔn)備樣品用流動(dòng)相溶樣或重組樣品編制儀器方法,開始實(shí)驗(yàn)第2頁(yè)/共141頁(yè)液相色譜對(duì)流動(dòng)相的要求色譜柱對(duì)流動(dòng)相的要求過(guò)濾除去微粒純度的要求超純水，或用KMnO4處理過(guò)的雙蒸水有機(jī)溶劑：色譜純(溶劑中的雜質(zhì)含量盡可能低)，并與填料相匹配緩沖液的pH值，在填料的允許范圍(一般在pH2-8)內(nèi)緩沖液（鹽）的濃度不要太高(≤100mM)流動(dòng)相對(duì)樣品的溶解度調(diào)整有機(jī)溶劑和水的比例最好用流動(dòng)相溶樣第3頁(yè)/共141頁(yè)液相色譜對(duì)流動(dòng)相的要求液相色譜儀器對(duì)流動(dòng)相的要求∶與檢測(cè)器匹配脫氣避免用含鹵素離子的緩沖鹽（不銹鋼系統(tǒng)）溶劑的粘度防止細(xì)菌的生長(zhǎng)第4頁(yè)/共141頁(yè)流動(dòng)相的脫氣流動(dòng)相脫氣的目的使色譜泵的輸液準(zhǔn)確輸液量均勻準(zhǔn)確，并且脈動(dòng)減小保留時(shí)間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高提高檢測(cè)的性能防止氣泡引起的尖峰基線穩(wěn)定，信噪比增加溶劑的紫外吸收本底降低保護(hù)色譜柱減少死體積防止填料的氧化第5頁(yè)/共141頁(yè)流動(dòng)相脫氣的方法加熱簡(jiǎn)單，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流動(dòng)相組成的變化抽真空同上，一般在溶劑抽濾的同時(shí)，也有脫氣的效果超聲波振蕩簡(jiǎn)單，但效果不夠理想；超聲時(shí)間不要太長(zhǎng)(1分鐘左右即可)通惰性氣體（一般用氦氣）可保持在線連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度在線脫氣機(jī)（in-linedegasser)可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度第6頁(yè)/共141頁(yè)流動(dòng)相的保存有機(jī)溶劑流動(dòng)相:室溫下密封,避光保存緩沖鹽流動(dòng)相:當(dāng)日現(xiàn)配現(xiàn)用低溫下密封保存,一般不超過(guò)3天防止微生物生長(zhǎng)有機(jī)溶劑與水（緩沖鹽）混配的流動(dòng)相:低溫密封保存防止有機(jī)相的揮發(fā)選用適宜的容器第7頁(yè)/共141頁(yè)2星期1天1星期1小時(shí)新鮮配制5101520250分保存于聚乙烯瓶中的超純水測(cè)試條件水樣:40mltraceenrichment@2.0ml/min色譜柱:C18反相柱(Waters)梯度:線性100%水－100%乙腈波長(zhǎng):254nm第8頁(yè)/共141頁(yè)1天1星期新鮮配制5101520250分保存于棕色玻璃瓶中的超純水測(cè)試條件水樣:40mltraceenrichment@2.0ml/min色譜柱:C18反相柱(Waters)梯度:線性100%水－100%乙腈波長(zhǎng):254nm第9頁(yè)/共141頁(yè)色譜泵的排氣操作色譜泵實(shí)驗(yàn)前，應(yīng)先確認(rèn)泵頭內(nèi)沒(méi)有氣體，如有氣體要按以下步驟排氣：將泵入口管吸濾頭放入脫過(guò)氣的流動(dòng)相中打開泵及在線脫氣機(jī)電源開關(guān)將排液閥打開，或斷開與色譜柱連接的管路設(shè)置流速到6-9ml/min,排液閥出口有液流連續(xù)流出必要時(shí)(600泵)用10ml注射器從泵入口注入流動(dòng)相對(duì)于600,2695四元梯度泵,分別對(duì)所用各路溶劑進(jìn)行排氣操作停止泵流速,關(guān)閉排液閥,恢復(fù)斷開的管路,備用注:泵排氣后,應(yīng)輸液穩(wěn)定(系統(tǒng)壓力脈動(dòng)小,一般在幾十

Psi以內(nèi)),否則,需重做排氣操作第10頁(yè)/共141頁(yè)Waters515

泵的前面板電源開關(guān)柱塞桿清洗孔排液閥第11頁(yè)/共141頁(yè)Waters600泵的前面板柱塞桿清洗孔電源開關(guān)排液閥泵控制器泵體泵灌注閥第12頁(yè)/共141頁(yè)Waters2695分離單元溶劑瓶盤注射器箱門柱溫箱溶劑配比單元進(jìn)入門檢測(cè)器接液盤前面板顯示屏和鍵盤軟盤驅(qū)動(dòng)器樣品室門溶劑輸送單元進(jìn)入門第13頁(yè)/共141頁(yè)2695排氣操作示意圖面板操作:打開狀態(tài)(Statas)畫面按右下角DirectFunction功能鍵選DryPime或

WetPrime命令選OK

即可進(jìn)行泵的排氣注:當(dāng)流路中充滿空氣時(shí),

按圖示做DryPrime若只是更新流動(dòng)相時(shí),

只須作WetPrime第14頁(yè)/共141頁(yè)

關(guān)于色譜系統(tǒng)的反壓什么是反壓(backpressure)流動(dòng)相流經(jīng)管路及色譜柱時(shí)會(huì)有阻力,即所謂的反壓,

又稱系統(tǒng)反壓或系統(tǒng)壓力Waters習(xí)慣用的壓力單位是Psi(磅/平方英吋)其它單位有:Bar,Mpa影響系統(tǒng)反壓的主要因素:流動(dòng)相的溶劑組成溫度流速第15頁(yè)/共141頁(yè)

反壓與溶劑組成的關(guān)系流動(dòng)相的粘度是產(chǎn)生反壓的主要原因有機(jī)溶劑－水的粘度隨組成而改變其壓力隨組成變化如下圖所示第16頁(yè)/共141頁(yè)

反壓與流速的關(guān)系流速對(duì)反壓的影響是線性關(guān)系流速增加，反壓亦增大

下圖的實(shí)驗(yàn)條件：2.1×30mmSymmetryC18柱,20℃第17頁(yè)/共141頁(yè)

反壓與溫度的關(guān)系溫度對(duì)反壓的影響是反比關(guān)系溫度升高,反壓降低,對(duì)某些流動(dòng)相的影響更大一些

第18頁(yè)/共141頁(yè)

影響系統(tǒng)反壓的其它因素反壓與色譜柱長(zhǎng)度成正比反壓與填料顆粒度的平方成反比2.5μm填料比3.5μm填料反壓高反壓與管路直徑的四次方成反比(1/D4)反壓與管路的長(zhǎng)度成正比第19頁(yè)/共141頁(yè)色譜泵的運(yùn)行排氣后的色譜泵即可用于實(shí)驗(yàn)運(yùn)行注意∶排氣后，先設(shè)流速為0恢復(fù)排氣時(shí)斷開的部分，如:進(jìn)樣器、色譜柱如需要，恢復(fù)排氣時(shí)斷開的控制線根據(jù)色譜柱的不同，逐漸提高流速到設(shè)定值若使用緩沖鹽流動(dòng)相,用前和用后均需用水過(guò)渡(包括排氣操作)第20頁(yè)/共141頁(yè)色譜泵的維護(hù)保養(yǎng)流動(dòng)相要過(guò)濾常用緩沖液時(shí)，停泵前要用水清洗泵頭，并用水沖洗柱塞桿清洗孔關(guān)閉排液閥時(shí)，不要太用力擰緊，以不滲液為準(zhǔn)更換流動(dòng)相時(shí)，要保證兩種溶劑的互溶性,如不互溶，要用一種中間溶劑過(guò)渡色譜泵在停用時(shí),應(yīng)先用水洗去緩沖鹽,然后用純甲醇充滿泵頭及管路,并保存在純甲醇中第21頁(yè)/共141頁(yè)液相色譜系統(tǒng)的清洗與鈍化色譜泵吸濾頭,進(jìn)出口閥及管路(包括進(jìn)樣器和檢測(cè)池)若被污染,應(yīng)作清洗和鈍化處理一般采用30％磷酸水溶液作為清洗劑，用6M硝酸作為鈍化劑，先清洗再鈍化清洗的目的是去除不銹鋼管路及系統(tǒng)內(nèi)的污垢鈍化的目的是使不銹鋼管路的內(nèi)表面形成光滑均勻的氧化膜第22頁(yè)/共141頁(yè)色譜泵及系統(tǒng)的清洗清洗液用30%磷酸水溶液30%磷酸配制:取85%濃磷酸35ml與65ml水混勻清洗步驟如下:取下色譜柱，用兩通(Union)連接進(jìn)樣器和檢測(cè)器用純水灌注泵頭(四元泵的A,B,C,D四路各為25%)用30%磷酸清洗液洗系統(tǒng)(1ml/min流速)45分鐘

(四元泵的A,B,C,D四路各為25%)換成清水洗至出口水pH顯中性用純甲醇過(guò)渡，浸潤(rùn)泵頭及管路，備用第23頁(yè)/共141頁(yè)色譜泵及系統(tǒng)的鈍化鈍化液用6M硝酸水溶液6M硝酸的配制:取濃硝酸40ml與60ml水混勻鈍化步驟如下:在清洗步驟完成后進(jìn)行鈍化處理確認(rèn)清洗用的磷酸已基本洗凈用純水灌注泵頭(四元泵的A,B,C,D四路各為25%)用6M硝酸水溶液鈍化系統(tǒng)(1ml/min流速)45分鐘換成清水洗至出口水pH顯中性用純甲醇過(guò)渡，浸潤(rùn)泵頭及管路，備用第24頁(yè)/共141頁(yè)實(shí)驗(yàn)樣品的制備標(biāo)樣和樣品標(biāo)樣:又稱對(duì)照品,它作為液相色譜定性和定量分析的參考標(biāo)準(zhǔn)物,一般是純度較高的純物質(zhì)樣品:待測(cè)物,一般是成分復(fù)雜的混合物液相色譜對(duì)樣品(包括標(biāo)樣)制備的要求:必須能溶于流動(dòng)相如樣品的溶劑不是流動(dòng)相,一定要用流動(dòng)相試溶解度,以免在進(jìn)樣時(shí)樣品在流動(dòng)相中析出,堵塞管路和色譜柱樣品溶液要過(guò)濾除去微粒及雜質(zhì)了解樣品對(duì)色譜柱的基質(zhì)/填料是否有破壞作用第25頁(yè)/共141頁(yè)復(fù)雜樣品的預(yù)處理樣品預(yù)處理的目的除去微粒減少干擾雜質(zhì)濃縮微量的組份提高檢測(cè)的靈敏度及選擇性改善分離的效果有利于保護(hù)色譜柱及儀器第26頁(yè)/共141頁(yè)樣品預(yù)處理的重要性是影響實(shí)驗(yàn)成敗的決定性步驟占樣品分析時(shí)間的比例最大樣品預(yù)處理所用時(shí)間遠(yuǎn)多于色譜分離的時(shí)間占分析消耗總成本的比重最大消耗大量的溶劑及其它化學(xué)品對(duì)分析結(jié)果的重現(xiàn)性及準(zhǔn)確性影響最大的環(huán)節(jié)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果好壞的最重要因素第27頁(yè)/共141頁(yè)樣品預(yù)處理常用的方法高速離心取上清液過(guò)濾、超濾選擇性沉淀衍生反應(yīng)液-液萃取固相提取(SolidPhaseExtract,SPE)Oasis和Sep-Pak固相提取小柱其它第28頁(yè)/共141頁(yè)去除微粒的方法過(guò)濾過(guò)濾膜/過(guò)濾裝置有機(jī)濾膜(≤0.5μm)/水溶性濾膜(≤0.45μm)膜片可更換一次性使用的膜“Cartridge”使用方便簡(jiǎn)單，交叉污染小有更小內(nèi)徑，可用于微量樣品的處理高速離心大于：10,000rpm第29頁(yè)/共141頁(yè)超濾機(jī)理超濾是一種基于分子量分離的技術(shù)目的根據(jù)分子量的不同把分子、細(xì)胞及病毒等分為不同的餾份除去小分子樣品中的大分子蛋白脫鹽第30頁(yè)/共141頁(yè)選擇性沉淀常用于生化樣品中除蛋白有機(jī)溶劑乙腈，甲醇強(qiáng)酸三氯乙酸，高氯酸鹽50%

硫酸銨10%TCA(三氯乙酸鈉)第31頁(yè)/共141頁(yè)樣品衍生提高檢測(cè)的靈敏度增加紫外基團(tuán)以增強(qiáng)紫外檢測(cè)的靈敏度增加熒光基團(tuán)以便使用高靈敏度熒光檢測(cè)器改變分離的選擇性改變組份的基團(tuán)，如：變離子型化合物為非離子型，用反相方法分離典型的例子柱前衍生氨基酸分析第32頁(yè)/共141頁(yè)AccQ-Tag衍生法NNOHOONO+NOR1R2HNNOOOHNH20NH2NOOOHN++AQC衍生試劑１°及２°氨基酸衍生后的氨基酸CO2N-羥基琥珀酰亞胺N-羥基琥珀酰亞胺半衰期＜1秒半衰期約15秒6-氨基喹啉第33頁(yè)/共141頁(yè)濃縮樣品目的：富集微量或痕量組份濃縮樣品的方法萃取/吹干沉淀/再溶解色譜法固相提取

Oasis小柱

Sep-Pak小柱第34頁(yè)/共141頁(yè)OasisHLB固相提取小柱親水-親脂平衡共聚物“親水”使填料具有水可浸潤(rùn)性質(zhì)降低與水的接觸角“親脂”提供對(duì)被分析物質(zhì)的反相保留能力NO親水性單體∶

N-乙烯基吡咯烷酮親脂性單體∶

二乙烯基苯第35頁(yè)/共141頁(yè)活化/平衡1ml甲醇/1ml水上樣多至200ml樣品沖洗廢棄物1ml5%甲醇/水溶液洗脫想要的化合物1ml甲醇揮發(fā)溶劑并重新定容制備樣品這是適合于分析眾多基質(zhì)中大多數(shù)樣品的通用操作步驟建議首先使用這種通用的操作步驟如果需要進(jìn)一步降低干擾物的影響，可使用二維SPE方法注:此方法于規(guī)格為3cc,60mg的Oasis?HLB

小柱上開發(fā)樣品預(yù)處理的通用SPE方法第36頁(yè)/共141頁(yè)SPE處理的效果第37頁(yè)/共141頁(yè)進(jìn)樣器的使用進(jìn)樣器的種類:手動(dòng)進(jìn)樣器－7725i自動(dòng)進(jìn)樣器－717Plus，2695樣品管理系統(tǒng)進(jìn)樣器與系統(tǒng)的連接：進(jìn)樣器的入口與色譜泵的出口相連進(jìn)樣器的出口與色譜柱的入口相連要求：出入口方向不能接錯(cuò)，接頭不能留有空隙進(jìn)樣器的連接管路：出口管路一定要用細(xì)管(內(nèi)徑≤0.009″),長(zhǎng)度要短,盡量減少譜帶擴(kuò)展第38頁(yè)/共141頁(yè)手動(dòng)進(jìn)樣器的使用7725i手動(dòng)進(jìn)樣器的進(jìn)樣方式:固定體積進(jìn)樣:進(jìn)樣量取決于Loop的體積可變體積進(jìn)樣:進(jìn)樣量由微量注射器量取注意:固定體積進(jìn)樣需要用超過(guò)Loop體積5-10倍的樣品量進(jìn)樣,以保證進(jìn)樣濃度不被稀釋可變體積進(jìn)樣在注射器注入樣品后,應(yīng)盡快將進(jìn)樣器扳至Inject位置,以避免樣品在Loop中的擴(kuò)散進(jìn)樣器的清洗:每次進(jìn)樣前應(yīng)將微量注射器清洗干凈,防止樣品間交叉污染,影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果第39頁(yè)/共141頁(yè)自動(dòng)進(jìn)樣器的使用自動(dòng)進(jìn)樣器(717Plus和2695樣品管理系統(tǒng)):樣品瓶位置和進(jìn)樣量由軟件設(shè)定注意:樣品瓶中應(yīng)有超過(guò)1／3瓶高度的樣品量使用內(nèi)襯管(Insert)時(shí)應(yīng)設(shè)定針高度為2mm(2695)或

75%高度(717Plus)進(jìn)樣器的清洗:進(jìn)樣針是流路的組成部分,運(yùn)行中一直由流動(dòng)相清洗進(jìn)樣針外部由軟件控制在每次進(jìn)樣前用洗針液清洗若注射器內(nèi)出現(xiàn)氣泡，用面板操作的PurgeInject功能清除之第40頁(yè)/共141頁(yè)自動(dòng)進(jìn)樣器的洗針液注意∶洗針溶劑瓶(內(nèi)放綠色塑料管)不要放在儀器的上部，應(yīng)放于與儀器同一水平面的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上洗針溶劑根據(jù)流動(dòng)相的不同應(yīng)有不同：第41頁(yè)/共141頁(yè)檢測(cè)器的啟動(dòng)操作連通流路：色譜柱出口接檢測(cè)器入口注意接頭不要留有空隙連接管路要用細(xì)管(≤0.009″)檢測(cè)器出口用適當(dāng)?shù)墓苈?內(nèi)徑,長(zhǎng)度)通向廢液瓶連通數(shù)據(jù)線路:IEEE電纜(對(duì)大多數(shù)檢測(cè)器)與軟件busLAC/E卡連接手動(dòng)進(jìn)樣器的啟動(dòng)信號(hào)線與檢測(cè)器背板上的InjectStart接口連接開啟電源開關(guān)后,需待檢測(cè)器通過(guò)自檢后,才能被軟件控制(約需5-10分鐘)通流動(dòng)相平衡至少30分鐘后才能正常工作第42頁(yè)/共141頁(yè)Waters2487

檢測(cè)器第43頁(yè)/共141頁(yè)2487的顯示屏幕通道吸光度燈開/關(guān)波長(zhǎng)靈敏度下一畫面運(yùn)行時(shí)間(分)自控/遙控診斷開/關(guān)鍵盤鎖開/關(guān)單/雙波長(zhǎng)Shift開/關(guān)AUFS(AbsorbanceUnitFullScale):滿量程吸光度單位第44頁(yè)/共141頁(yè)2487的面板及操作回車鍵分屏顯示鍵選項(xiàng)移動(dòng)鍵主屏幕方法調(diào)用，A/B通道切換設(shè)置及診斷單/雙波長(zhǎng)，自動(dòng)調(diào)零運(yùn)行/停止鍵第二功能鍵監(jiān)視色譜圖屏幕對(duì)比度第45頁(yè)/共141頁(yè)Waters2996PDA檢測(cè)器PDA(PhotoDiodeArray):光電二極管矩陣第46頁(yè)/共141頁(yè)由軟件設(shè)定檢測(cè)器參數(shù)只需設(shè)定如下參數(shù)即可采集數(shù)據(jù)波長(zhǎng)范圍分辨率每秒采集的光譜數(shù)操作極為簡(jiǎn)便不需費(fèi)神選擇參比波長(zhǎng)及其帶寬第47頁(yè)/共141頁(yè)Waters2414示差折光檢測(cè)器第48頁(yè)/共141頁(yè)2414的顯示屏幕沖洗參比池折射率極性RIU量程檢測(cè)器溫度下一畫面運(yùn)行時(shí)間(分)自控/遙控鍵盤鎖開/關(guān)模式Shift第49頁(yè)/共141頁(yè)2414的面板及操作回車鍵屏幕對(duì)比度選項(xiàng)移動(dòng)鍵主屏幕方法調(diào)用，溫度設(shè)置自動(dòng)調(diào)零運(yùn)行/停止鍵第二功能鍵監(jiān)視色譜圖沖洗參比池設(shè)置及診斷下一頁(yè)第50頁(yè)/共141頁(yè)2414檢測(cè)器的日常操作設(shè)定檢測(cè)器內(nèi)、外(如有柱溫箱)溫度以5ml/min的流速“purge”參比池五分鐘不接色譜柱！參數(shù)設(shè)置按文獻(xiàn)值或?qū)嶒?yàn)決定至少需要2小時(shí)以上的平衡時(shí)間通常檢測(cè)器可以在白天結(jié)束工作后不關(guān)機(jī)，保持0.1到0.5ml/min的流速循環(huán)沖洗樣品池和參比池,可節(jié)省第二天的平衡時(shí)間第51頁(yè)/共141頁(yè)使用示差檢測(cè)器的注意事項(xiàng)不能做梯度實(shí)驗(yàn)最大的池耐壓是100psi注意保持出口管路的暢通流速范圍是0.1-10ml/min此種類型檢測(cè)器是壓力敏感和溫度敏感型檢測(cè)器注意保持泵壓力的平穩(wěn)注意環(huán)境溫度的恒定第52頁(yè)/共141頁(yè)Waters2475熒光檢測(cè)器第53頁(yè)/共141頁(yè)2475檢測(cè)器的特點(diǎn)可調(diào)波長(zhǎng)熒光檢測(cè)器雙掃描在掃描模式下(Scan)發(fā)射波長(zhǎng)及激發(fā)波長(zhǎng)均可掃描高靈敏度∶水的RAMAN峰S/N大于200可編程時(shí)間-波長(zhǎng)時(shí)間-增益由RS232串行口或網(wǎng)線與計(jì)算機(jī)相連第54頁(yè)/共141頁(yè)2475的主顯示屏發(fā)射/能量燈開/關(guān)下一頁(yè)運(yùn)行時(shí)間(分)面板/軟件控制鍵盤鎖/開Shift開/關(guān)單/多波長(zhǎng)通道選擇增益波長(zhǎng)診斷鍵開/關(guān)靈敏度第55頁(yè)/共141頁(yè)2475的面板及操作回車鍵分屏顯示鍵選項(xiàng)移動(dòng)鍵主屏幕方法調(diào)用，通道切換設(shè)置／診斷自動(dòng)調(diào)零運(yùn)行/停止鍵第二功能鍵監(jiān)視色譜圖開／關(guān)燈屏幕亮度調(diào)節(jié)光譜掃描第56頁(yè)/共141頁(yè)2475熒光檢測(cè)器的掃描功能掃描功能

由面板功能執(zhí)行Empower

英文版亦能由軟件執(zhí)行第57頁(yè)/共141頁(yè)熒光檢測(cè)器使用注意事項(xiàng)不是所有化合物都有熒光，有時(shí)需要衍生檢測(cè)器對(duì)溶解氣體及其它“淬滅”物質(zhì)(如甲醇)敏感,流動(dòng)相最好能在線脫氣對(duì)Ex及Em的最佳，易受溫度、溶劑極性和粘度、pH及樣品濃度影響檢測(cè)池的耐壓較低,注意出口管路要暢通設(shè)置的發(fā)射波長(zhǎng)至少要比激發(fā)波長(zhǎng)高10nm第58頁(yè)/共141頁(yè)流動(dòng)相脫氣與否的信號(hào)比較MinutesColumn- WatersPAHColumn, @27oCEluentA: WaterEluentB: AcetonitrileGradient: 60%Bto100%Busing curve9in12minutes Hold11minutes BacktoinitialconditionsFlowRate 1.2ml/minInjection: 20ul Timeprogrammed wavelengthchanges20.521.022.01000MV脫氣未脫氣Breeze?withFluorescence1231.Benzo(b)flouranthene–400ppb2.Benzo(k)fluoranthene-200ppb3.Benzo(a)pyrene-200ppb第59頁(yè)/共141頁(yè)樣品濃度對(duì)激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的影響發(fā)射激發(fā)~10–3M~10–5M在庚烷中第60頁(yè)/共141頁(yè)檢測(cè)器的使用和保養(yǎng) 如長(zhǎng)時(shí)間不用檢測(cè)器可以關(guān)掉光源燈(UV,FL)僅在4小時(shí)以上不用時(shí),才需關(guān)燈頻繁開關(guān)燈也會(huì)影響燈壽命不要讓緩沖液長(zhǎng)期停滯在檢測(cè)池內(nèi)用純水沖洗保存在純甲醇中示差檢測(cè)器及熒光檢測(cè)器若與其它檢測(cè)器串聯(lián)使用,應(yīng)將此兩種檢測(cè)器串在其它檢測(cè)器的后面不用檢測(cè)器的液晶顯示屏?xí)r，應(yīng)將其亮度調(diào)暗第61頁(yè)/共141頁(yè)Waters

中國(guó)有限公司培訓(xùn)中心液相色譜教程

(四)

液相色譜柱基礎(chǔ)知識(shí)

第62頁(yè)/共141頁(yè)液相色譜柱基礎(chǔ)知識(shí)

(3)反相色譜柱的選擇Waters

中國(guó)有限公司培訓(xùn)中心第63頁(yè)/共141頁(yè)液相色譜柱與分離機(jī)理的關(guān)系從色譜方法上分正相/反相離子交換分子體積排除親合疏水回受從柱子類型上分分配/吸附離子交換凝膠親合第64頁(yè)/共141頁(yè)對(duì)HPLC色譜柱的要求(1)合適的選擇性滿足不同的分離要求良好的色譜峰形重現(xiàn)性寬應(yīng)用范圍第65頁(yè)/共141頁(yè)硅膠基質(zhì)C18填料都相同嗎？色譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示：疏水性不同殘留硅羥基活性不同為什么？不同

C18配體鍵合水平（狀況）配體覆蓋率不同硅膠顆粒基質(zhì)密度，表面積，孔徑純度第66頁(yè)/共141頁(yè)色譜柱品牌名稱不同色譜柱“品牌名稱”表示不同的硅膠基質(zhì)WatersSymmetry?C18WatersNova-Pak?C18相同的“品牌名稱”,不同的配體表示相同的硅膠基質(zhì)，鍵合相不同WatersSymmetry?C18WatersSymmetry?C8注意：由于硅羥基的影響，許多情況下硅膠基質(zhì)對(duì)整個(gè)鍵合相的性能起決定作用第67頁(yè)/共141頁(yè)Minutes04812162024YMC-Pack?ProC18?YMC-Pack?ProC4?二氫苊萘對(duì)羥基苯甲酸丁酯提示:相似的選擇性歸因于相同的硅膠基質(zhì)(同一品牌,不同鍵合相)配體不同的影響：C18與C4第68頁(yè)/共141頁(yè)品牌不同的影響:(相同配體)分45678910YMC-Pack?ODS-AQ?YMC-Pack?ProC18?

酮洛芬痛滅定萘普生舒洛芬舒洛芬

萘普生酮洛芬和痛滅定注意:由于硅膠顆?；|(zhì)不同(品牌不同),分離的選擇性不同第69頁(yè)/共141頁(yè)01020304050用于浸潤(rùn)固定相的甲醇水溶液的比例%020406080100在1mL/min流速下的浸潤(rùn)率%C18鍵合相硅膠柱填料需要

合適的濕潤(rùn)度注意：需要有機(jī)溶劑來(lái)保證反相填料有合適的濕度,

反之停流速后易出現(xiàn)“疏水塌陷”問(wèn)題第70頁(yè)/共141頁(yè)未濕潤(rùn)的孔濕潤(rùn)的孔注意：保留時(shí)間與填料表面積與配體有關(guān)。然而，如果硅膠表面未濕潤(rùn)，那么有效的色譜表面積會(huì)減少95%，因此，減少被分析物的保留時(shí)間即等于“疏水塌陷”，記?。簬缀跛械谋砻娣e都在孔內(nèi)！低比例有機(jī)溶劑或純水溶液流動(dòng)相C18

硅膠什么是“疏水塌陷”？第71頁(yè)/共141頁(yè)分0246810流動(dòng)相：0.1%醋酸水溶液阿莫西林Vo：被分析物沒(méi)有保留“濕潤(rùn)時(shí)”“去濕后”Symmetry?C8：疏水塌陷第72頁(yè)/共141頁(yè)停流速后

(孔去濕:~3%)流動(dòng)相：0.1%醋酸水溶液Minutes0246810

初始時(shí)保留時(shí)間無(wú)變化阿莫西林SymmetryShield?RP8：

無(wú)疏水塌陷現(xiàn)象發(fā)生內(nèi)嵌極性基團(tuán)鍵合相：使用高比例水溶液流動(dòng)相時(shí)色譜性能穩(wěn)定第73頁(yè)/共141頁(yè)帶有極性基團(tuán)的反相色譜填料第74頁(yè)/共141頁(yè)內(nèi)嵌極性基團(tuán)配體:可能機(jī)理-極性基團(tuán)增加了填料表層水的濃度降低堿性物質(zhì)的保留減少了拖尾改善與水的浸潤(rùn)性屏蔽了帶負(fù)電的硅羥基第75頁(yè)/共141頁(yè)水表面層機(jī)理水“屏蔽”層降低了堿性化合物的保留降低了拖尾現(xiàn)象屏蔽了帶負(fù)電的硅羥基第76頁(yè)/共141頁(yè)SymmetryShield?RP18TfUSP=1.1分0102030阿米替林Symmetry?C18TfUSP=1.9注意：對(duì)堿性化合物而言，可以減少保留時(shí)間并且改善色譜峰形相同硅膠基質(zhì)(配體不同)內(nèi)置極性基團(tuán)的配體與直鏈烷烴配體的比較第77頁(yè)/共141頁(yè)注:使用相同的流動(dòng)相SymmetryShield?RP8Symmetry?C8選擇性不同呋喃唑酮(痢特靈)雜質(zhì)分析第78頁(yè)/共141頁(yè)色譜柱選擇性比較表(ln[k]二氫苊)Hypersil?BDSC18Symmetry?C18Inertsil?ODS-2Inertsil?ODS-3Kromasil?C18YMC-Pack?ProC18?YMC-Pack?ODS–AQ?Nova-Pak?C18Hypersil?ODSYMCJ'sphere?ODS–H80YMCJ'sphere?ODS–M80Nucleosil?C18μBondapak?C18YMCJ'sphere?ODS–L80WatersSpherisorb?ODS1Resolve?C18WatersSpherisorb?ODS2-0.20.30.81.31.82.32.811.522.533.5疏水性增加硅羥基活性降低(ln[a]阿米替林/二氫苊)選擇性變化第79頁(yè)/共141頁(yè)對(duì)HPLC色譜柱的要求(2)合適的選擇性良好的色譜峰形定量精度、靈敏度與分離度重現(xiàn)性寬應(yīng)用范圍第80頁(yè)/共141頁(yè)USP拖尾因子（TailingFactor）:

Tf＝

不對(duì)稱因子

(AssymmetryFactor):

As＝ab峰高之5%處色譜峰對(duì)稱性的衡量方法abab)(a2+第81頁(yè)/共141頁(yè)對(duì)稱峰形的益處更準(zhǔn)確與精確的定量結(jié)果純度分析穩(wěn)定性分析

更高的靈敏度

更好的檢出限與定量限（LOD和LOQ）對(duì)低濃度雜質(zhì)有更強(qiáng)的檢測(cè)能力更好的分離度更有利于相鄰色譜峰的分離第82頁(yè)/共141頁(yè)99.6%99.8%99.9%峰面積回收率T=1.00Waters21,379由于拖尾引起的積分誤差92.3%95.3%97.8%T=1.58峰面積回收率第83頁(yè)/共141頁(yè)由于拖尾引起的靈敏度差異

他莫昔芬0.25g/mL信噪比11.06.5AUSymmetryC18AU5.0010.00MinutesConventionalC18第84頁(yè)/共141頁(yè)峰形對(duì)分離度的影響Rs=(t

峰2–t峰1)/0.5(w4.4%

峰1+w4.4%

峰2)=(11.5-10.6)/0.5(2.0+0.5)=0.72Minutes0510152025提示:基線分離的分離度

=1.5第85頁(yè)/共141頁(yè)不同填料的峰形比較1.二羥基丙酮2.心得安(T=1.0)3.二氫苊4.阿米替林(T=1.6)1.二羥基丙酮2.心得安(T=5.7)3.二氫苊4.阿米替林(T=7.0)AlltimaC8

SymmetryC8第86頁(yè)/共141頁(yè)具有良好峰形的Symmetry柱建立高效液相色譜柱的新標(biāo)準(zhǔn)，開創(chuàng)新一代高品質(zhì)色譜柱全新的標(biāo)準(zhǔn)：在很寬的pH范圍下，對(duì)酸、堿及中性化合物均有非常好的色譜峰形極高的批間重現(xiàn)性獨(dú)特的選擇性良好的柱壽命第87頁(yè)/共141頁(yè)對(duì)HPLC色譜柱的要求(3)合適的選擇性良好的色譜峰形重現(xiàn)性色譜柱間重現(xiàn)性批次間重現(xiàn)性寬應(yīng)用范圍第88頁(yè)/共141頁(yè)色譜柱重現(xiàn)性的重要性重現(xiàn)性是液相色譜分析的基本要求缺乏重現(xiàn)性是用戶最擔(dān)心的問(wèn)題加快方法驗(yàn)證(Validation)的速度更容易傳遞方法色譜系統(tǒng)之間以及實(shí)驗(yàn)室之間確保長(zhǎng)期符合認(rèn)證及系統(tǒng)適應(yīng)性等要求更容易符合法規(guī)要求第89頁(yè)/共141頁(yè)同一批次合成的填料—色譜柱之間的重現(xiàn)性柱床填充質(zhì)量控制塔板數(shù)色譜峰對(duì)稱性反壓無(wú)選擇性差異不同批次合成的填料—色譜柱批次間重現(xiàn)性顆粒的物理性質(zhì)表面之化學(xué)性質(zhì)柱間重現(xiàn)性與批次間重現(xiàn)性的區(qū)別第90頁(yè)/共141頁(yè)Symmetry—優(yōu)異的重現(xiàn)性不同產(chǎn)品批號(hào)間的差別最低，充分滿足各種嚴(yán)格的cGMP要求孔徑 RSD=3%滲透性 RSD=2%特征表面積 RSD=2%平均顆粒度 RSD=2%第91頁(yè)/共141頁(yè)不同批次間重現(xiàn)性Symmetry?C18品牌B品牌CSymmetry?C18–45批第92頁(yè)/共141頁(yè)紫杉醇中的不純物分析:三批色譜柱所得色譜重疊圖色譜柱:Symmetry

C83.5m(4.6x100mm)8

流速:1.8mL/min流動(dòng)相:甲醇/乙腈/水9:34:57檢測(cè)波長(zhǎng):UV230nm樣品:25Lof1mg/mL紫杉醇0.0010.0020.0030.00Minutes

不同批次間重現(xiàn)性第93頁(yè)/共141頁(yè)Symmetry?色譜柱優(yōu)點(diǎn)優(yōu)異的色譜峰形無(wú)可比擬的重現(xiàn)性所認(rèn)證的方法置信度高容易達(dá)到法規(guī)要求認(rèn)證方法的長(zhǎng)期穩(wěn)定性有利于長(zhǎng)期符合法規(guī)要求第94頁(yè)/共141頁(yè)對(duì)HPLC色譜柱的要求(4)合適的選擇性良好的色譜峰形重現(xiàn)性寬應(yīng)用范圍pH

范圍溫度范圍第95頁(yè)/共141頁(yè)pH對(duì)填料穩(wěn)定性的影響高pH實(shí)驗(yàn)pH>8時(shí),許多C18硅膠基質(zhì)過(guò)早地喪失柱效由于填料顆粒溶解,色譜柱內(nèi)產(chǎn)生空隙隨著鍵合相覆蓋率的增加，色譜柱壽命延長(zhǎng)低pH實(shí)驗(yàn)pH<2時(shí),許多C18硅膠基質(zhì)過(guò)早地喪失柱效由于鍵合相之水解作用,被測(cè)物喪失保留行為使用三官能團(tuán)鍵合相可獲得最佳的穩(wěn)定性第96頁(yè)/共141頁(yè)XTerra色譜填料Tetraethoxysilane(TEOS)Polyethoxysilane(MPEOS)Methyltriethoxysilane(MTEOS)雜化顆粒合成(Hybridparticlesynthesis)同時(shí)含有有機(jī)和無(wú)機(jī)組分擁有介于有機(jī)與無(wú)機(jī)材料之間的性質(zhì)Xterra:Waters創(chuàng)新的雜化填料第97頁(yè)/共141頁(yè)0102030400123456789101112pHXTerra?色譜柱硅羥基電離硅羥基不電離

弱保留

好峰形

保留增加

好色譜峰形

必須嚴(yán)格控制pH方可獲得良好色譜重現(xiàn)性pH10

去甲替林阿米替林Minutes0123Minutes0123pH2

保留最強(qiáng)

好色譜峰形

改善色譜重現(xiàn)性保留因子(k)堿性化合物在不同pH條件下的分離度第98頁(yè)/共141頁(yè)靈敏度與選擇性的改變色譜柱:XTerra?RP18,4.6.x150mm,3.5μm檢測(cè):254nm(相同進(jìn)樣量)流動(dòng)相:50%乙腈/40%水/10%含100mM

CAPSO,

pH10流動(dòng)相:30%乙腈/60%水/10%含100mM磷酸鈉,

pH2.0MinutespH100.000.2524681012酮康唑阿司咪唑0酮康唑阿司咪唑AUpH2色譜圖重疊pH2與10：阿司咪唑與酮康唑分析第99頁(yè)/共141頁(yè)簡(jiǎn)化方法開發(fā)過(guò)程123456789101112pH中間pH硅膠柱低pH硅膠柱高pH聚合物基質(zhì)柱寬pH范圍XTerra?填料色譜柱XTerra?色譜柱之寬pH范圍(以一當(dāng)三)第100頁(yè)/共141頁(yè)溫度pHXTerra?填料：高溫穩(wěn)定性第101頁(yè)/共141頁(yè)Xterra:高溫壽命試驗(yàn)PeakNumber

USPTailingFactor1.多慮平1.22.去甲替林1.13.阿米替林1.14.三甲丙咪嗪1.0AU-0.0050.10Minutes1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00AU-0.020.48Minutes1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.001234123412341234AU0.000.26Minutes1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00AU-0.0050.10Minutes1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00第二十一天第二天XTerra?RP18普通硅膠C18

Conditions:Column:XTerra?RP18,5μm,4.6X150mmMobilePhase:40%pH7,10mMNa2PO4,60%ACNColumnTemp.:60°CFlowRate:1.5mL/minDetector:254nm三環(huán)抗抑郁藥物分離第102頁(yè)/共141頁(yè)Xterra色譜柱的優(yōu)點(diǎn)XTerra色譜柱為方法開發(fā)提供了極其有效且方便的工具寬pH范圍良好色譜峰形高穩(wěn)定性高速度WatersPatentTechnology2000R&D100AwardWinner第103頁(yè)/共141頁(yè)最新研制的Atlantis反相柱第104頁(yè)/共141頁(yè)新型AtlantisTM

填料的性質(zhì)提高極性物質(zhì)保留能力的同時(shí)，改善常規(guī)反相色譜性能雙官能團(tuán)鍵合C18(dC18)端基封口平均孔徑為100?顆粒度：3,5及10m

第105頁(yè)/共141頁(yè)新型AtlantisTM

填料的特點(diǎn)對(duì)極性與非極性化合物的優(yōu)異保留特性在100％水溶液流動(dòng)相中運(yùn)行保持色譜性能穩(wěn)定峰形優(yōu)異超低鍵合相流失，質(zhì)譜兼容酸性條件下穩(wěn)定性良好雙鍵鍵合C18，使之：

具有較長(zhǎng)的色譜柱壽命

低pH條件下穩(wěn)定性增強(qiáng)極佳的色譜柱間重現(xiàn)性第106頁(yè)/共141頁(yè)同時(shí)分離極性與非極性化合物極性化合物在AtlantisTM

色譜柱上保留較強(qiáng)，而非極性物質(zhì)在其上的保留時(shí)間與常規(guī)C18色譜柱相似。12345109876V0=0.98minTime(Min)1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.00ConditionsColumn:AtlantisTM4.6x150mm,5μmMobilePhaseA:H2OMobilePhaseB:ACNMobilePhaseC:100mMNH4COOH,pH3.0Flowrate:2.0mL/minGradient:TimeProfile(min)%A%B%C0.008010

1010.0095515.00955Injectionvolume:5.0μLTemperature:30oCDetection:UV@254nmCompounds1.Uracil2.Acetanilide3.Triamcinolone4.Hydrocortisone5.2-Amino-7-chloro-5-oxo-5H-[1]-benzopyrano-[2,3-b]pyridinecarbonitrile6.6a-Methyl-17a-hydroxyprogesterone7.3-Aminofluoranthene8.2-Bromofluorene9.Perylene10.Naphthol[2,3-a]pyrene第107頁(yè)/共141頁(yè)兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物12345109876Time(Min)2.004.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.00V0=1.83min化合物:1.去甲腎上腺素(NE)2.腎上腺素(E)3.3,4-二羥基苯基丙氨酸(DOPA)4.多巴胺(DA)5.3-甲氧基-4-羥基苯乙二醇(MHPG)6.4-羥基-3-甲氧基苯基乙醇酸(VMA)7.5-羥色胺(5-HT)8.3,4-二羥基苯乙酸(DOPAC)9.5-羥基-3-吲哚乙酸(5HIAA)10.4-羥基-3-甲氧基苯乙酸(HVA)條件色譜柱: 4.6x150mm,5μm流動(dòng)相A: H2O流動(dòng)相B: ACN流動(dòng)相C: 100mMNH4COOH,pH3.0流速 1.0mL/min梯度: 時(shí)間

流動(dòng)相組成 (min) %A%B%C 0.00 90010 5.00 90010 15.0 652510 20.0 652510進(jìn)樣體積: 10μL溫度: 30oC檢測(cè): UV@280nm第108頁(yè)/共141頁(yè)水溶性維生素(Vitamins)化合物:

USP拖尾因子1.L-抗壞血酸(Vc) 1.122.煙酸 1.273.硫胺(VB1) 1.204.吡哆醛 1.135.VB6 1.046.葉酸 1.107.咖啡因 1.108.核黃素(VB2) 1.14Time(Min)1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.0012345876V0=1.37min條件色譜柱:4.6x150mm,5μm流動(dòng)相A:0.1%TFA流動(dòng)相B:乙腈流速:1.4mL/min梯度: 時(shí)間 流動(dòng)相組成 (min) %A%B 0.0 1000 4.0 973 6.0 8515 15.0 8020進(jìn)樣體積:10.0μL溫度:30oC檢測(cè):UV@260nm第109頁(yè)/共141頁(yè)反相色譜柱的選擇小結(jié):(1)常規(guī)應(yīng)用現(xiàn)代高純硅膠色譜柱：SymmetryShield/Symmetry優(yōu)點(diǎn)：峰形好，重現(xiàn)性高，壽命長(zhǎng)限制：pH2-8流動(dòng)相中含有大量水溶液采用Shield技術(shù)：XTerraRP或SymmetryRP填料Atlantis填料技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：在含有大量水溶液（100％水溶液）流動(dòng)相中性能穩(wěn)定：峰形好第110頁(yè)/共141頁(yè)需要使用寬pH值或高溫條件－如生物堿分離XTerra雜化顆粒技術(shù)：pH1-12優(yōu)點(diǎn)：pH范圍寬，高溫條件下填料穩(wěn)定性好，色譜峰形好，壽命長(zhǎng)采用質(zhì)譜檢測(cè)器:窄內(nèi)徑/小顆粒/短柱XterraMSC18AtlantisSymmetryC18反相色譜柱的選擇小結(jié):(2)第111頁(yè)/共141頁(yè)需要提高極性物質(zhì)的保留常規(guī)pH：AtlantisdC18極端pH：Xterra：如堿性化合物需要分析分子量較大的多肽或蛋白Symmetry300C18C4反相色譜柱的選擇小結(jié):(3)第112頁(yè)/共141頁(yè)結(jié)論各種品牌的C18柱皆有各自不同的選擇性第113頁(yè)/共141頁(yè)液相色譜教程

(七)

液相色譜常見問(wèn)題分析Waters中國(guó)有限公司培訓(xùn)中心第114頁(yè)/共141頁(yè)色譜圖常見問(wèn)題色譜圖常見問(wèn)題主要有三類:色譜峰峰形異常問(wèn)題例如負(fù)峰,寬峰,肩峰,雙峰,峰形不對(duì)稱等色譜圖中多峰少峰問(wèn)題色譜圖未出峰,出峰比預(yù)想的多等色譜峰保留時(shí)間問(wèn)題保留時(shí)間不穩(wěn)定等第115頁(yè)/共141頁(yè)色譜圖常見問(wèn)題分析(一)色譜峰峰形異常問(wèn)題:所有的峰均為負(fù)峰:信號(hào)電纜接反或檢測(cè)器輸出極性設(shè)置顛倒光學(xué)裝置尚未達(dá)到平衡一個(gè)或幾個(gè)峰是負(fù)峰流動(dòng)相吸收本底高進(jìn)樣過(guò)程中進(jìn)了空氣離子對(duì)分離中的系統(tǒng)峰樣品組分的吸收(RI或UV)低于流動(dòng)相第116頁(yè)/共141頁(yè)色譜圖常見問(wèn)題分析(一)色譜峰峰形異常問(wèn)題:所有的峰都是寬峰系統(tǒng)未平衡或未達(dá)到化學(xué)平衡溶樣的溶劑比流動(dòng)相強(qiáng)很多色譜柱類型或尺寸不正確色譜柱或保護(hù)柱被污染或降級(jí)溫度變化對(duì)色譜柱的影響第117頁(yè)/共141頁(yè)色譜圖常見問(wèn)題分析(一)色譜峰峰形異常問(wèn)題:較早洗脫的峰呈寬峰進(jìn)樣體積過(guò)大或樣品濃度太高進(jìn)樣器有問(wèn)題,定量環(huán)(Loop)大小不合適在線過(guò)濾器,保護(hù)柱,色譜柱或管路堵塞管路問(wèn)題:內(nèi)徑不對(duì)或切管不正確管路連接問(wèn)題:接頭或錐箍不正確檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)不正確第118頁(yè)/共141頁(yè)色譜圖常見問(wèn)題分析(一)色譜峰峰形異常問(wèn)題:峰比預(yù)想的要小樣品粘度過(guò)大進(jìn)樣器有問(wèn)題或進(jìn)樣體積有誤檢測(cè)器設(shè)置不正確,定量環(huán)(Loop)體積不正確檢測(cè)器輸出未置零用了不正確的檢測(cè)器輸出信號(hào)檢測(cè)池被污染檢測(cè)器的燈可能有問(wèn)題第119頁(yè)/共141頁(yè)色譜圖常見問(wèn)題分析(一)色譜峰峰形異常問(wèn)題:雙峰或肩峰進(jìn)樣量或樣品濃度過(guò)大保護(hù)柱或色譜柱進(jìn)口堵塞保護(hù)柱或色譜柱污染或失效前伸峰進(jìn)樣量或樣品濃度過(guò)大溶樣的溶劑相對(duì)于流動(dòng)相太強(qiáng)保護(hù)柱或色譜柱污染或失效第120頁(yè)/共141頁(yè)色譜圖常見問(wèn)題分析(一)色譜峰峰形異常問(wèn)題:平頭峰檢測(cè)器設(shè)置不正確進(jìn)樣體積太大或樣品濃度太高拖尾峰保護(hù)柱或色譜柱問(wèn)題:污染或失效進(jìn)樣問(wèn)題檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)不正確第121頁(yè)/共141頁(yè)拖尾是由什么引起的?混合型保留機(jī)理與鍵合相的疏水作用與帶電點(diǎn)的離子交