DNA斑點雜交及殘留量測定

會計學(xué)1DNA斑點雜交及殘留量測定

雙鏈probe或DNA解鏈，主要取決于：

1、鏈的長度：鏈越長，需要的能量多才能解鏈；

2、堿基成分：GC含量高，較難變性；

3、化學(xué)環(huán)境：單價陽離子穩(wěn)定雙鏈，甲酰胺，尿素破壞雙鏈第1頁/共33頁一、雜交探針的獲得

是指一段能與目的基因或DNA/RNA片段特異雜交的核苷酸序列。Probe可以是整個基因，或是基因的一部分，是DNA，也可以是RNA。

第2頁/共33頁（一）制備特異性探針所需要的基本條件1.被檢基因結(jié)構(gòu)清楚；

2.有明確的基因產(chǎn)物;3.已知某一基因產(chǎn)物對表型的反應(yīng)或缺少某一基因?qū)Ρ硇偷姆磻?yīng)。具備以上條件之一就可以制備特異性基因探針。第3頁/共33頁（二）特異探針的來源

1、基因組探針：從已建立的基因組文庫中篩選和分離所需的目的基因?？寺U增大量的DNA探針第4頁/共33頁DNA克隆第5頁/共33頁2、cDNAprobe:從已構(gòu)建的cDNA文庫中篩查和分離目的基因探針。第6頁/共33頁3、寡核苷酸探針

克隆（clone）:是指用無性繁殖的方法獲得同一個體、細胞或分子的大量復(fù)制品。根據(jù)已知基因序列，人工合成一段互補的DNA片段。一般長約15～50個bp。多數(shù)探針的制備都通過分子克隆的方法獲得。第7頁/共33頁二、探針的標記

將探針標記上一種標識物以便雜交后檢測。常用于標記探針的標識物：

同位素：32P

,35S

,3H-dNTP等；

非同位素：地高辛-dNTP，生物素-dNTP。常用的標記方法：第8頁/共33頁1、缺口平移法（NickTranslation）原理及過程：反應(yīng)體系中DNA酶I隨機在探針DNA上打開缺口，然后利用DNA聚合酶I5’→3’外切酶活性，在缺口處按5’→3’方向切除單核苷酸；同時DNA聚合酶I有5’→3’的聚合酶活性，在缺口處3’端加入底物中的單核苷酸，彌補缺口處的核苷酸鏈。隨著反應(yīng)的進行底物中被標記單核苷酸，并被隨機摻入。DNA聚合酶I的兩種作用交替進行，探針即被標記。第9頁/共33頁NickTranslationOHpOH+PPDNAdNTP、DNA酶I、DNA聚合酶I32P-dNTPBio-dNTP地高辛-dNTP第10頁/共33頁2、隨機引物法（6核苷酸引物標記法）

原理及過程：利用E.coliDNA聚合酶I的Klenow亞單位，合成含有標記核苷酸的DNA鏈。Klenow具有5’→3’聚合酶活性。被標記的DNA（探針）變性成單鏈，引物與模板結(jié)合。在Klenow的催化下，以引物3’端為起點，沿模板3’→5’方向合成DNA新鏈。反應(yīng)體系中含有標記的dNTP,隨機摻入新合成的DNA鏈中，探針即被標記。第11頁/共33頁隨機引物標記探針5`3`5`5`3`DNA32p-dNTP,Bio-DNTP地高辛-dNTP，6bpprimer變性Klenow,dNTP第12頁/共33頁三、DNA雜交常用的方法

（一）Southernblot

1975年，英國科學(xué)家Southern首創(chuàng)，是指DNA-DNA雜交，是經(jīng)典的基因分析方法。

1、原理和步驟:

提取Tissue、CellDNA

限制性內(nèi)切酶消化DNA片段

電泳分離

變性轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜

變性、雜交

洗膜、放射自顯影、結(jié)果分析第13頁/共33頁SouthernBlot第14頁/共33頁(二)斑點雜交(dotandslothybridization)

1、原理及步驟：

提取T、CellDNA

↓

點樣品至膜、干燥、固定

↓

探針、DNA變性、雜交

↓洗膜、放射自顯影

↓結(jié)果分析

第15頁/共33頁DNA

樣品點樣Probe-32P檢測AB1234第16頁/共33頁附錄ⅨB外源性DNA殘留量測定法供試品中的外源性DNA經(jīng)變性為單鏈后吸附于固相膜上，在一定溫度下可與相匹配的單鏈DNA復(fù)性而重新結(jié)合成為雙鏈DNA，稱為雜交。將特異性單鏈DNA探針標記后，與吸附在固相膜上的供試品單鏈DNA雜交，并使用與標記物相應(yīng)的顯示系統(tǒng)顯示雜交結(jié)果，與已知含量的陽性DNA對照比對后，可測定供試品中外源性DNA的含量。第17頁/共33頁

試劑：

(1)DNA標記和檢測試劑盒

(2)DNA雜交膜尼龍膜或硝酸纖維素膜。

(3)2％蛋白酶K溶液稱取蛋白酶K0.20g，溶于滅菌水10ml中，分裝后儲藏于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

(4)3％牛血清白蛋白溶液稱取牛血清白蛋白0.30g，溶于滅菌水10ml中。

(5)1mol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液(pH8.0)用鹽酸調(diào)pH值至8.0。第18頁/共33頁(6)5.0mol/L氯化鈉溶液

(7)0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液(pH8.O)用10mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.0。

(8)20％十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液用鹽酸pH至7.2。

(9)蛋白酶緩沖液(pH8.0)量取lmol/LTris溶液1.0ml(pH8.O)，5.0mol/L氯化鈉溶液2.0ml，0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液(pH8.0)2.0ml，20%SDS溶液2.5ml，加滅菌水至10ml。第19頁/共33頁(10)TE緩沖液(pH8.0)量取lmol/LTris溶液(pH8.O)10ml，0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液(pH8.0)2ml，加滅菌水至1000ml。

(11)l％魚精DNA溶液精密稱取魚精DNA0.10g，置10ml量瓶中，用TE緩沖液溶解并稀釋至度，搖勻，用7號針頭反復(fù)抽打以剪切DNA成為小分子，分裝后貯藏于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

(12)DNA稀釋液取1％魚精DNA溶液50ul，加TE緩沖液至10ml。第20頁/共33頁用于探針標記和陽性對照的DNA制備用于探針標記和陽性對照的DNA，由生產(chǎn)供試品用的傳代細胞、工程菌或雜交瘤細胞提取純化獲得，其提純和鑒定可參考下述推薦方案進行，具體方法可參考《分子克隆實驗指南([美]J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版利2002)或《精編分子生物學(xué)實驗指南》([美]F.奧斯伯等著，顏子穎、王海林譯，科學(xué)出版社，1998)。

第21頁/共33頁將待提取的細胞基質(zhì)懸液的細胞濃度調(diào)整為每lml1×107個細胞，如果為細菌，則將其濃度調(diào)整為每lml含1×108個細胞。取懸液lml，離心，在沉淀中加裂解液400ul混勻，37℃作用12～24小時后，加入飽和酚溶液450ul劇烈混合，以每分鐘10000轉(zhuǎn)離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上層液體，以飽和酚溶液450ul重復(fù)抽提一次；轉(zhuǎn)移上層液體加入三氯甲烷450u1，劇烈混勻，以每分鐘10000轉(zhuǎn)離心10分鐘；第22頁/共33頁轉(zhuǎn)移上層液體，加入pH5.2的3mol/L醋酸鈉溶液40ul，充分混合，再加入-20℃以下的無水乙醇lml，充分混合，-20℃以下作用2小時，以每分鐘15000轉(zhuǎn)離心15分鐘；用適量-20℃70％乙醇溶液洗滌沉淀1次，以每分鐘15000轉(zhuǎn)離心15分鐘，棄上清液，保留沉淀，吹至干燥后，加適量滅菌TE緩沖液溶解，RNase酶切，酚/三氯甲烷抽提，分子篩純化DNA即得。第23頁/共33頁用1％瓊脂糖凝膠電泳法和分光光度法鑒定陽性對照品的DNA純度：應(yīng)無RNA和寡核苷酸存在；A260/A280比值應(yīng)在0.2～2.0之間(測定時將供試品稀釋至A260為0.2～1.0)。用于陽性對照和標記探針的DNA在使用前應(yīng)進行酶切或超聲波處理，使其片斷大小適合于DNA雜交和探針標記。第24頁/共33頁

陽性對照品的DNA濃度根據(jù)下式計算：

DNA濃度(ng/u1)=50×A260

陽性對照品可分裝于適宜的小管中，

-20℃以下保存，長期使用。探針的標記按試劑盒使用說明書進行。第25頁/共33頁測定法：

(1)蛋白酶K預(yù)處理按下表對供試品、陽性和陰性對照進行加樣，混合后37℃保溫4小時以上以保證酶切反應(yīng)完全。加樣量2％蛋白酶K溶液蛋白酶緩沖液3％牛血清白蛋白溶液加水至終體積供試品D1D2D3陰性100ul100ul100ul100ul100ul1ul1ul1ul1ul1ul20u120u120u120u120u1適量適量適量適量200u1200u1200u1200u1200u1第26頁/共33頁D1、D2、D3為稀釋的陽性DNA對照。用DNA稀釋液稀釋至每lml中含DNA1000ng。然后依次l0倍稀釋成10ng/100ul(D1)、lng/100ul(D2)、100pg/100ul(D3)三個稀釋度；如成品使用劑量較大，而且DNA限量要求(100pg/劑量)較嚴格時，則需要提高DNA檢測靈敏度，相應(yīng)的陽性DNA對照應(yīng)稀釋成100pg/100u1(D1)、10pg/100ul(D2)、lpg/100ul(D3)三個稀釋度。陰性對照為DNA稀釋液，空白對照為未進行蛋白酶K預(yù)處理的TE緩沖液。第27頁/共33頁注意事項：供試品的稀釋根據(jù)成品最大使用劑量，用DNA稀釋液將供試品(原液)稀釋至每100u1含1人份劑量；如成品最大使用劑量較大，而供試品的蛋白含量較低，可用DNA稀釋液將供試品稀釋至每100ul含1/lO人份劑量或每100ul含1/100人份劑量。2％蛋白酶K溶液和蛋白酶緩沖液的比例為1/20，蛋白酶緩沖液和終體積的比例為1/lO。第28頁/共33頁加入3％牛血清白蛋白溶液適量，是為了使陽性對照和陰性對照中含有一定的蛋白質(zhì)與供試品(通常為蛋白質(zhì))的酶切條件保持一致；如供試品為其他物質(zhì)，則應(yīng)改用其他相應(yīng)物質(zhì)。若預(yù)處理后的供試品溶液中的蛋白質(zhì)干擾本試驗，可用上述飽和酚溶液抽提法或其他適宜方法提取供試品DNA(陽性對照、陰性對照也應(yīng)再次提取DNA，與供試品溶液平行)。第29頁/共33頁(2)點膜用TE緩沖液浸潤雜交膜后，將預(yù)處理的供試品、陽性對照、陰性對照與空白對照置100℃水浴加熱l0分鐘，迅速冰浴冷卻，以每分鐘8000轉(zhuǎn)離心5秒。用抽濾加樣器點樣于雜交膜(因有蛋白質(zhì)沉淀，故要視沉淀多少確定加樣量，以避免加入蛋白質(zhì)沉淀。所有供試品與陽性對照、陰性對照、空白對照加樣體積應(yīng)一致，或按同樣比例加樣)。晾干后置80℃真空干烤1小時以上。第30頁/共33頁(3)雜交及顯色按試劑盒使用說明書進行。結(jié)果判定陽性對照應(yīng)顯色，其顏色深度與DNA含量相對應(yīng)，呈一定的顏色梯度；陰性、空白對照應(yīng)不顯色，或顯色深