實驗二十四 抗酸染色

實驗二十四抗酸染色篇一：抗酸染色法抗酸染色法目錄1簡介2抗酸染色的原理3抗酸染色一般步驟?1）初染?2）脫色?3）復染4抗酸染色的染液配制簡介編輯抗酸染色法acid－faststainingmethod1882年由埃利希（F．ehrlich）首創(chuàng)并經(jīng)F．齊爾（Ziehl）改進而創(chuàng)造出的細菌染色法。其中最具代表性的為對結(jié)核菌的齊爾-尼爾森（Ziehl－neelsen）染色法和齊爾-加貝特（Ziehl－gabbet）染色法。用石炭酸復紅染色后，用鹽酸乙醇分色，再用美藍進行對比染色，即不再脫色而呈現(xiàn)石炭酸復紅的紅色?？顾崛旧脑砭庉嫹种U菌的細胞壁內(nèi)含有大量的脂質(zhì)，包圍在肽聚糖的外面，所以分枝桿菌一般不易著色，要經(jīng)過加熱和延長染色時間來促使其著色。但分枝桿菌中的分枝菌酸與染料結(jié)合后，就很難被酸性脫色劑脫色，故名抗酸染色。齊-尼氏抗酸染色法是在加熱條件下使分枝菌酸與石炭酸復紅牢固結(jié)合成復合物，用鹽酸酒精處理也不脫色。當再加堿性美蘭復染后，分枝桿菌仍然為紅色，而其他細菌及背景中的物質(zhì)為藍色?？顾崛旧话悴襟E編輯1）初染用玻片夾夾持涂片標本，滴加石炭酸復紅2-3滴，在火焰高處徐徐加熱，切勿沸騰，出現(xiàn)蒸汽即暫時離開，若染液蒸發(fā)減少，應再加染液，以免干涸，加熱3-5分鐘，待標本冷卻后用水沖洗。2）脫色3%鹽酸酒精脫色30秒~1分鐘；用水沖洗。3）復染用堿性美蘭溶液復染1分鐘，水洗，用吸水紙吸干后用油鏡觀察?？顾崛旧娜疽号渲凭庉?、石炭酸復紅堿性復紅酒精飽和溶液10mL5%石炭酸90mL2、3%鹽酸酒精濃鹽酸3mL95%酒精97mL3、呂氏美蘭液美蘭酒精飽和液30mL氫氧化鉀（1:10000）100mL篇二：實驗二十四抗酸染色-jpkchnadlcn課程名稱：微生物學檢驗技術授課專業(yè)：醫(yī)學檢驗學時：2學時實驗十七結(jié)核桿菌檢驗(m.TuberculosisTest)一、實驗目的⒈掌握結(jié)核桿菌的菌落特征，鏡下形態(tài)、染色特性⒉掌握抗酸染色的原理、操作步驟，結(jié)果報告二、實驗器材與試劑⒈菌種：bcg⒉試劑：抗酸染液⒊其他：三腳架、鐵片、木夾子等三、實驗內(nèi)容㈠微生物學診斷⒈標本采取根據(jù)病灶器官取材,包括痰,尿,腦脊液,糞便等。⒉直接涂片抗酸染色鏡檢濃縮集菌:無其他雜菌污染的腦脊液、胸腹水等標本,可直接離心沉淀集菌。有雜菌的標本如痰、尿、糞等標本,先經(jīng)4%naoh或3%hcl或6%h2so4處理30分鐘,殺死雜菌并使粘稠性有機物溶解之后,再離心沉淀集菌。⒊抗酸染色⒋培養(yǎng)鑒定⒌動物試驗(豚鼠):將集菌后的材料注于豚鼠腹股溝皮下,3-4周后若局部淋巴結(jié)腫大,結(jié)核菌素試驗陽轉(zhuǎn),即可進行解剖。觀察肺、肝、淋巴結(jié)等器官有無結(jié)核病變,并作形態(tài)、培養(yǎng)等檢查。若6-8周仍不見發(fā)病,亦應進行解剖檢查。⒍結(jié)核菌素試驗⑴用途:測定機體對結(jié)核桿菌有無變態(tài)反應性─免疫性。⑵方法:用舊結(jié)核菌素(oT)或純蛋白衍生物(ppD)注射前臂皮內(nèi),48小時-72小時觀察有無紅腫硬結(jié)。⑶結(jié)果:出現(xiàn)紅腫硬結(jié)直徑大于5mm者為陽性,說明機體對結(jié)核桿菌有免疫性;反之,紅腫硬結(jié)直徑小于5mm者為陰性,說明機體對結(jié)核桿菌無免疫性。大于15mm者為強陽性反應,表明可能有活動性結(jié)核感染,應進一步追查病灶。⑷實際應用:①選擇卡介苗接種對象和測定卡介苗接種后的免疫效果。結(jié)核菌素試驗陰性者應接種或補種卡介苗。②在未接種卡介苗的人群中作結(jié)核桿菌感染的流行病學調(diào)查,了解人群自然感染率。③作為嬰幼兒(尚未接種過卡介苗者)結(jié)核病的輔助診斷。④測定腫瘤患者的細胞免疫功能。㈡培養(yǎng)特性（示教）1.營養(yǎng)要求高常用的有Lowenstein-Jensen培養(yǎng)基,內(nèi)含蛋黃、甘油、馬鈴薯、無機鹽和孔雀綠等?？兹妇G可抑制雜菌生長,便于;分離和長期培養(yǎng)。蛋黃含脂質(zhì)生長因子,能刺激生長。2.需氧,加6-8%co2可促進生長。3.生長緩慢:繁殖一代需18小時左右,形成菜花樣菌落需時兩周以上。㈢形態(tài)染色（示教）1.形態(tài)細長,著色不勻,排列成分枝或索狀。2.著色抗酸性─抗酸性染色。㈣抗酸染色法(acid-faststain)：⒈原理:結(jié)核分枝桿菌含脂質(zhì)多,不易著色,先用石炭酸復紅初染,染色時間要稍長,且需要加溫。一旦細菌染上顏色，由于脂質(zhì)的存在，即使強脫色劑也不能使之脫色,其它細菌均脫色,經(jīng)堿性美蘭復染,所以結(jié)核分枝桿菌呈紅色,其它呈藍色.⒉方法：取痰液→涂片（略厚）→干燥→固定→5％石炭酸復紅染色30分鐘（冷染）后→用3%的鹽酸酒精脫色約1~2分鐘，脫色時輕搖玻片，直到涂片顏色脫去為止→水洗后，用堿性美藍復染1分鐘→水洗，待干→鏡檢⒊結(jié)果：抗酸桿菌呈紅色(+)，其他細菌和背景物質(zhì)為藍色(-)，如下圖⒋萋尼氏染色鏡檢結(jié)果分級報告標準抗酸桿菌陰性(－)：連續(xù)觀察300個不同視野未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌。報告抗酸桿菌菌數(shù)：1～8條/300視野?？顾釛U菌陽性（1＋）：3～9條/100視野?？顾釛U菌陽性（2＋）：1～9條抗酸桿菌/10視野?？顾釛U菌陽性（3＋）：1～9條抗酸桿菌/每視野?？顾釛U菌陽性（4＋）：≥10條抗酸桿菌/每視野⒌注意事項痰涂片抗酸染色檢查要注意預防假陽性和假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。假陽性是指將陰性涂片錯誤判讀為陽性，假陰性是指將陽性涂片錯誤判讀為陰性。屬于技術因素的影響要通過一系列實驗室內(nèi)和實驗室間的質(zhì)量控制不斷改善。Ⅰ假陽性結(jié)果的預防措施⑴必須使用新的載玻片進行痰涂片檢查。⑵每個標本均使用一個新竹簽完成制片涂抹。⑶所有染液均經(jīng)過過濾。⑷染色時玻片彼此之間保持一定距離，相互徹底分隔開。⑸嚴禁使用染色缸將玻片放置一起染色。⑹染色時勿使玻片上的染液干燥。⑺滴加鏡油時，嚴禁容器滴口直接接觸玻片痰膜。⑻嚴禁物鏡鏡頭直接接觸玻片痰膜。⑼完整、準確的標注痰盒、玻片和實驗室登記本的各項內(nèi)容。⑽登記前、后對檢驗單和標本盒上的標注進行仔細核對。⑾認真按照要求讀片，準確記錄和報告結(jié)果。Ⅱ假陰性結(jié)果的預防措施⑴確認標本是痰而非唾液。⑵確認每份標本至少有3ml。⑶選擇膿樣、干酪樣、粘液分泌物涂抹制備玻片。⑷制備玻片時標本涂抹均勻，不要太厚或太薄。⑸使用高質(zhì)量染料、嚴格按照配方配制染液。⑹嚴格按照操作程序完成染色過程。⑺判斷結(jié)果為“陰性”前，必須閱讀規(guī)定要求的視野數(shù)。⑻作為對照，可采用已知結(jié)果為陽性的玻片，完成染色鏡檢過程。⑼完整、準確地標注痰盒、玻片和實驗室登記本。⑽登記前對檢驗單和標本盒上的標注進行仔細核對。四、實驗安排每人取痰標本做抗酸染色，記錄結(jié)果。五、實驗準備抗酸染液2套／教室三腳架、鐵片、木夾子、玻片若干篇三：實驗二十四抗酸染色-湖南省高等學校精品課程網(wǎng)課程名稱：微生物學檢驗技術授課專業(yè)：醫(yī)學檢驗學時：2學時實驗十七結(jié)核桿菌檢驗(m.TuberculosisTest)一、實驗目的⒈掌握結(jié)核桿菌的菌落特征，鏡下形態(tài)、染色特性⒉掌握抗酸染色的原理、操作步驟，結(jié)果報告二、實驗器材與試劑⒈菌種：bcg⒉試劑：抗酸染液⒊其他：三腳架、鐵片、木夾子等三、實驗內(nèi)容㈠微生物學診斷⒈標本采取根據(jù)病灶器官取材,包括痰,尿,腦脊液,糞便等。⒉直接涂片抗酸染色鏡檢濃縮集菌:無其他雜菌污染的腦脊液、胸腹水等標本,可直接離心沉淀集菌。有雜菌的標本如痰、尿、糞等標本,先經(jīng)4%naoh或3%hcl或6%h2so4處理30分鐘,殺死雜菌并使粘稠性有機物溶解之后,再離心沉淀集菌。⒊抗酸染色⒋培養(yǎng)鑒定⒌動物試驗(豚鼠):將集菌后的材料注于豚鼠腹股溝皮下,3-4周后若局部淋巴結(jié)腫大,結(jié)核菌素試驗陽轉(zhuǎn),即可進行解剖。觀察肺、肝、淋巴結(jié)等器官有無結(jié)核病變,并作形態(tài)、培養(yǎng)等檢查。若6-8周仍不見發(fā)病,亦應進行解剖檢查。⒍結(jié)核菌素試驗⑴用途:測定機體對結(jié)核桿菌有無變態(tài)反應性─免疫性。⑵方法:用舊結(jié)核菌素(oT)或純蛋白衍生物(ppD)注射前臂皮內(nèi),48小時-72小時觀察有無紅腫硬結(jié)。⑶結(jié)果:出現(xiàn)紅腫硬結(jié)直徑大于5mm者為陽性,說明機體對結(jié)核桿菌有免疫性;反之,紅腫硬結(jié)直徑小于5mm者為陰性,說明機體對結(jié)核桿菌無免疫性。大于15mm者為強陽性反應,表明可能有活動性結(jié)核感染,應進一步追查病灶。⑷實際應用:①選擇卡介苗接種對象和測定卡介苗接種后的免疫效果。結(jié)核菌素試驗陰性者應接種或補種卡介苗。②在未接種卡介苗的人群中作結(jié)核桿菌感染的流行病學調(diào)查,了解人群自然感染率。③作為嬰幼兒(尚未接種過卡介苗者)結(jié)核病的輔助診斷。④測定腫瘤患者的細胞免疫功能。㈡培養(yǎng)特性（示教）1.營養(yǎng)要求高常用的有Lowenstein-Jensen培養(yǎng)基,內(nèi)含蛋黃、甘油、馬鈴薯、無機鹽和孔雀綠等?？兹妇G可抑制雜菌生長,便于;分離和長期培養(yǎng)。蛋黃含脂質(zhì)生長因子,能刺激生長。2.需氧,加6-8%co2可促進生長。3.生長緩慢:繁殖一代需18小時左右,形成菜花樣菌落需時兩周以上。㈢形態(tài)染色（示教）1.形態(tài)細長,著色不勻,排列成分枝或索狀。2.著色抗酸性─抗酸性染色。㈣抗酸染色法(acid-faststain)：⒈原理:結(jié)核分枝桿菌含脂質(zhì)多,不易著色,先用石炭酸復紅初染,染色時間要稍長,且需要加溫。一旦細菌染上顏色，由于脂質(zhì)的存在，即使強脫色劑也不能使之脫色,其它細菌均脫色,經(jīng)堿性美蘭復染,所以結(jié)核分枝桿菌呈紅色,其它呈藍色.⒉方法：取痰液→涂片（略厚）→干燥→固定→5％石炭酸復紅染色30分鐘（冷染）后→用3%的鹽酸酒精脫色約1～2分鐘，脫色時輕搖玻片，直到涂片顏色脫去為止→水洗后，用堿性美藍復染1分鐘→水洗，待干→鏡檢⒊結(jié)果：抗酸桿菌呈紅色(+)，其他細菌和背景物質(zhì)為藍色(-)，如下圖⒋萋尼氏染色鏡檢結(jié)果分級報告標準抗酸桿菌陰性(－)：連續(xù)觀察300個不同視野未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌。報告抗酸桿菌菌數(shù)：1～8條/300視野?？顾釛U菌陽性（1＋）：3～9條/100視野?？顾釛U菌陽性（2＋）：1～9條抗酸桿菌/10視野?？顾釛U菌陽性（3＋）：1～9條抗酸桿菌/每視野?？顾釛U菌陽性（4＋）：≥10條抗酸桿菌/每視野⒌注意事項痰涂片抗酸染色檢查要注意預防假陽性和假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。假陽性是指將陰性涂片錯誤判讀為陽性，假陰性是指將陽性涂片錯誤判讀為陰性。屬于技術因素的影響要通過一系列實驗室內(nèi)和實驗室間的質(zhì)量控制不斷改善。Ⅰ假陽性結(jié)果的預防措施⑴必須使用新的載玻片進行痰涂片檢查。⑵每個標本均使用一個新竹簽完成制片涂抹。⑶所有染液均經(jīng)過過濾。⑷染色時玻片彼此之間保持一定距離，相互徹底分隔開。⑸嚴禁使用染色缸將玻片放置一起染色。⑹染色時勿使玻片上的染液干燥。⑺滴加鏡油時，嚴禁容器滴口直接接觸玻片痰膜。⑻嚴禁物鏡鏡頭直接接觸玻片痰膜。⑼完整、準確的標注痰盒、玻片和實驗室登記本的各項內(nèi)容。⑽登記前、后對檢驗單和標本盒上的標注進行仔細核對。⑾認真按照要求讀片，準確記錄和報告結(jié)果。Ⅱ假陰性結(jié)果的預防措施⑴確認標本是痰而非唾液。⑵確認每份標本至少有3ml。⑶