酸性磷酸酶顯示方法的研究

PAGEPAGE4雞肝酸性磷酸酶顯示方法的研究酸性磷酸酶(acidphosphatase胞內(nèi)外物質代謝過程中起著十分重要的作用。ACP的活性變化直接體現(xiàn)溶酶體的功能狀態(tài)[1]。在大部分組織中，它主要定位于溶酶體內(nèi)。在溶酶體膜完整時，底物不易滲入，ACP活力微弱或無活性。經(jīng)固定后，在合適的pH條件下，膜本身變得不穩(wěn)定，逐漸改變其滲透性，底物可以滲入，酶活力被顯示。此酶在pH5.0的環(huán)境中發(fā)生作用，分解磷酸布[2]。國內(nèi)外也發(fā)布不少有關酸性磷酸酶在細胞中的定位研究的報道，例如：石長應等[3]已經(jīng)利用電鏡酶細胞化學方法，對大尾柱蟲(Urostylngrandis)、冠突偽尾柱蟲(Pseudorostyld(ParaurostylaACPase的陽性反應顆粒除分布在消化腔隙內(nèi)獨立的泡狀結構上和被消化的食物組織中外，在細胞質中的小圓泡內(nèi)也有分布。近年來研究人員應用超微結構酶細胞化學技術研究了家蠶幼蟲中腸ACPase活性的亞細胞分布[4]ACPase孫建梅等[5]首次報道了ACPACP消化道及生殖腺中均有分布。但對于雞肝酸性磷酸酶顯示的研究卻很少。肝臟它集有消化、合成、貯存、解毒、免疫等多種功能。雞如果發(fā)生疾病，首先受到損害的是肝臟，肝臟就會出現(xiàn)一些特征性的病理變化[6]。因此，可以通過酸性磷酸酶顯示的方法能測定雞肝中磷酸酶的含量，來判定雞的生理狀態(tài)。本實驗采用Gomori法（硝酸鉛法）定性的顯示雞肝細胞中酸性磷酸酶，旨在為大學細胞生物學實驗酸性磷酸酶的顯示方法提供依據(jù)。材料與方法材料試驗雞肝 在實驗室鄰近市場購買新鮮雞肝，裝入預備的生理鹽水中，并盡快往實驗室。AB主要試劑 10%中性福爾馬(pH6.8～7.1)；酸性磷酸酶作用液；2%硫化胺溶液0.05mol/L乙酸緩沖液(pH4.8)；0.8%生理鹽水。AB試驗儀器 數(shù)碼互動顯微鏡MoticBA200、低速離心機、恒溫水浴鍋、冰箱、注器(5mL)、中號離心管、載玻片、手術刀、剪刀等。方法試驗試劑的配制 酸性磷酸酶作用液（臨用時現(xiàn)配；福爾馬林固定液0.05mol/L乙酸緩沖液；2%硫化胺溶液（臨用時現(xiàn)配]試驗材料處理 用生理鹽水清洗購買的雞肝剪去結締組織及雜物稱取雞肝35g30mL肝懸液，分在兩支離心管中，每支各10mL，500r/min3min。取上清液1-24℃5-10min。酸性磷酸酶的顯示將玻片浸入酸性磷酸酶作用液，在水浴鍋中37℃孵育30min。10%福爾馬林(pH6.8～7.1)固定5min1min2%硫化銨處理3-5min蒸餾水漂洗，甩干。在顯微鏡下觀察。對照組的處理 對照組1：固定時10%的中性福爾馬林液4℃冰箱內(nèi)固定2min，其步驟同上；對照組2:染色時用硫化銨染色1min，其余步驟同上。結果與分析在數(shù)碼互動顯微鏡下分別對實驗組和對照組觀察結果見圖1。EEF圖1雞肝酸性磷酸酶顯示結果A-圖D401004001000E、F1、210001A-D401004001000373-5min110%雞肝細胞在漂洗的過程中會有損失，所以圖E21min，由于染色時間較短，雞肝細胞中酸性磷酸酶未能被充分顯示，圖中F雞肝細胞顏色較淺。討論酸性磷酸酶活性測定是前列腺疾病的診斷的重要技術手段，并且其同工酶的測定對血液病、骨骼肌病診斷與鑒別診斷具有重要的意義[8]。少精和(或)弱精癥的男子不育與精液中高濃度的白細胞以及鋅、酸性磷酸酶的下降有關。在腫瘤學中，常利用酸性磷酸酶的活力來反映腫瘤細胞的增殖狀態(tài)和數(shù)量[9]。血清酸性磷酸酶可以作為一個有用的巨細胞骨瘤的腫瘤標志物[10]。因此，酸磷酸酶的顯示不僅具有重要的生物學意義，而且有一定的臨床意義。本試驗結果，能在顯微鏡不同倍數(shù)下觀察到棕黑色沉淀，即酸性磷酸酶。圖片清晰明確，針對性較強。對試驗過程中影響雞肝細胞酸性磷酸酶的顯示操作以簡單討論如下：試驗材料的處理雞肝的處理很重要，如果雞肝處理不好，直接關系著細胞的獲得。雞肝的清洗和稀釋要使用生理鹽水，保持細胞形態(tài)的穩(wěn)定性。另外，還要用手術刀切除結締組織及雜物，獲得純凈的雞肝懸液。離心的目的是為了去除雞肝中較大的雜物，同時也應注意保持細胞的完整性，所以轉速和時間不宜設置過高。本實驗采用以500r/min離心3min。固定時間對試驗的影響試驗組雞肝細胞在10%福爾馬林液中固定5min，固定時間合適，固定的效果比較好，視野中細胞數(shù)量較合適。對照組1對雞肝細胞在10%的中性福爾馬林液中固定2min，由于固定的時間較短，固定效果不好，得到雞肝細胞量減少。酸性磷酸酶和硫化胺對雞肝細胞的影響的，尤其是在37℃pH值大于7的條件下活力喪失更快[10]，所以這就要求酸性磷酸酶作用液要現(xiàn)配現(xiàn)用。試驗中應該注意ACP不穩(wěn)定，活性易喪失，所以在涂片要用預冷的pHpH>7.0況下，酸性磷酸酶均會迅速失活，所以要求在得到雞肝細胞后，要迅速涂片放入4℃冰箱中。本試驗采用2%的硫化胺，對楊漢民酸性磷酸酶顯示的方法[11]進行了優(yōu)化,使反應得到的硫化鉛顏色更明顯。而硫化銨的處理時間也應注意，對照組2染色時用硫