食品安全地方標準 蔬菜中阿維菌素殘留的測定 酶聯(lián)免疫吸附法

食品安全地方標準蔬菜中阿維菌素殘留的測定酶聯(lián)免疫吸附法范圍本標準規(guī)定了蔬菜中阿維菌素殘留量的酶聯(lián)免疫吸附測定法。本標準適用于蔬菜中阿維菌素殘留量的測定。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法原理采用直接競爭酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）方法，在微孔條上包被偶聯(lián)抗原，試樣中殘留的阿維菌素與酶標板上的偶聯(lián)抗原競爭酶標記的阿維菌素抗體后，顯色劑顯色，終止液終止反應(yīng)。用酶標儀在450nm處測定吸光度，吸光值與阿維菌素殘留量呈負相關(guān)，與標準曲線比較，再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出阿維菌素殘留含量。試劑和材料4.1阿維菌素試劑盒4.1.196孔板（12條×8孔）包被有阿維菌素偶聯(lián)抗原。4.1.2阿維菌素標準溶液（至少有5個倍比稀釋濃度水平，外加1個空白）。4.1.3過氧化物酶標記阿維菌素抗體溶液。4.1.4過氧化物酶標記物。4.1.5底物顯色溶液A液：過氧化尿素。4.1.6底物顯色溶液B液：四甲基聯(lián)苯胺。4.1.7反應(yīng)終止液：1mol/L硫酸。4.1.8復(fù)溶液（2倍濃縮液）。4.1.9洗滌液（20倍濃縮液）。4.2甲醇（分析純）4.3水GB/T6682規(guī)定的一級水。4.4復(fù)溶液工作液用水將2倍的濃縮復(fù)溶液按1∶1體積比進行稀釋（1份2倍濃縮復(fù)溶液＋1份水），用于溶解干燥的殘留物及稀釋試樣，復(fù)溶液工作液在4℃可保存一個月。4.5洗滌液工作液用水將20倍的濃縮洗滌液按1∶19體積比進行稀釋（1份20倍濃縮洗滌液＋19份水），用于酶標板的洗滌，洗滌液工作液在4℃可保存一個月。儀器酶標儀配有450nm濾光片。均質(zhì)器天平感量0.01g。渦旋儀離心機轉(zhuǎn)速≥3000r/min。氮氣吹干裝置恒溫箱恒溫箱微量移液器單道20μL～200μL、100μL～1000μL可調(diào)，多道250μL。試樣制備與保存取蔬菜樣品，剪碎，10000r/min均質(zhì)1min。制備好的試樣，應(yīng)即刻進行提取和檢測。試樣測定提取稱取蔬菜試樣1.0g±0.05g于50mL聚苯乙烯離心管中，加10mL甲醇，渦動5min，3000r/min以上，20～25℃離心5min，取上層澄清液1mL于10mL潔凈干燥的玻璃試管中，于50～60℃水浴氮氣流下吹干，加入100μL甲醇，渦動30s，再加入900μL復(fù)溶工作液，渦動1min，充分混合，取50μL用于分析。測定使用前將試劑盒在20～25℃下放置1～2h。7.2.1將標準和試樣（至少按雙平行實驗計算）所有數(shù)量的孔條插入微孔架，記錄標準和試樣的位置。7.2.2加100μL系列標準溶液（4.1.2）或處理好的試樣溶液到各自的微孔中。標準和試樣至少做兩個平行試驗。7.2.3加過氧化物酶標記阿維菌素抗體溶液（4.1.3）100μL到每一個微孔中，充分混合，于25℃恒溫箱中孵育30min。7.2.4倒出孔中液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去孔中的液體。用250μL洗滌液工作液充入孔中，再次倒掉微孔中的液體，再重復(fù)操作兩遍以上（或用洗板機洗滌）。7.2.5加50μL底物顯色溶液A液（4.1.4）和50μL底物顯色溶液B液（4.1.5），混合并在25℃恒溫箱避光顯色15min。7.2.6加50μL反應(yīng)終止液（4.1.6），輕輕振蕩混勻，用酶標儀在450nm處測量吸光度值。結(jié)果計算用所獲得的標準溶液和試樣溶液吸光度值與空白溶液吸光度值的比值進行計算，見式（1）： （SEQ標準自動公式\*ARABIC1）式中：Ar——相對吸光度值，%；B——標準（試樣）溶液的吸光度值；B0——空白（濃度為0的標準溶液）的吸光度值。將計算的相對吸光度值（%）對應(yīng)阿維菌素（μg/L）的自然對數(shù)做半對數(shù)坐標系統(tǒng)曲線圖，對應(yīng)的試樣濃度可從校正曲線算出，見式（2）： （SEQ標準自動公式\*ARABIC2）式中：X——試樣中阿維菌素的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；A——試樣中相對吸光度值（%）對應(yīng)的阿維菌素含量，單位為微克每升（μg/L）；f——試樣稀釋倍數(shù)；m——試樣的取樣量，單位為克（g）。計算結(jié)果表示到小數(shù)點后兩位。陽性結(jié)果應(yīng)用確證法確證。檢測限、準確度和精密度檢測限本標準的方法檢測限：