第三章基因工程常用的克隆載體

第三章基因工程常用的克隆載體載體的功能運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件第一節(jié)質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒的定義存在于細(xì)胞質(zhì)中的一類獨(dú)立于染色體，并能自主復(fù)制的遺傳成分（復(fù)制子）復(fù)制子:細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立存在的、能夠自我增殖的結(jié)構(gòu)單位染色體DNA質(zhì)粒DNA噬菌體DNA質(zhì)粒DNA編碼的表型抗性特性抗生素抗性：重金屬抗性：毒性陰離子：其他：AmprCmlrKanrStrrTetrHg、Ni、Co、Pd、Zn砷酸鹽、亞砷酸鹽、硼酸鹽、鉻酸鹽嵌入試劑（EB、吖啶）、輻射、噬菌體代謝特性：修飾寄主生活方式：植物冠癭病、發(fā)根病冠癭堿代謝二、質(zhì)粒DNA分子的特性結(jié)構(gòu)特性SC型共價(jià)閉合環(huán)形DNA（cccDNA，covalentlyclosedcircularDNA）OC型開環(huán)DNA（ocDNA，opencircularDNA）

L型線性DNA（L-DNA，lineDNA）染料結(jié)合特性：

呈平面結(jié)構(gòu)的染料（EB）可平嵌入DNA雙鏈堿基對(duì)之間。cccDNA由于結(jié)構(gòu)緊密，自由末端較少，可結(jié)合染料EB分子比L-DNA少，因此密度較大。提取純化質(zhì)粒DNA：氯化銫-溴乙錠密度梯度離心法（CsCl-EtBr）質(zhì)粒DNA純度高、周期長(zhǎng)、設(shè)備要求高、存在溴乙錠污染！變性特性cccDNA由于分子較小且結(jié)構(gòu)緊密，堿性條件下變性后，恢復(fù)pH條件即可復(fù)性。提取純化質(zhì)粒DNA：微量堿變性法裂解菌體細(xì)胞加堿調(diào)pH至12～12.5DNA變性離心加NaAc調(diào)pH至去除蛋白質(zhì)、RNA質(zhì)粒DNA純度較低、周期較短！復(fù)制特性拷貝數(shù)：生長(zhǎng)在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基條件下，每個(gè)細(xì)胞中所含有的質(zhì)粒DNA分子的數(shù)目嚴(yán)緊型復(fù)制：1-2個(gè)松弛型復(fù)制：10-100個(gè)制備質(zhì)粒：寄主細(xì)胞培養(yǎng)基中加入蛋白質(zhì)合成抑制劑，增加質(zhì)粒拷貝數(shù)！三、質(zhì)粒載體應(yīng)具備的條件具有復(fù)制起始位點(diǎn)具有至少兩種易被檢測(cè)的選擇性標(biāo)記具有多克隆位點(diǎn)（MCS）

多克隆位點(diǎn)（multi-cloning-site，MCS）：多種常用限制酶單一識(shí)別序列所組成的DNA序列具有盡可能小的相對(duì)分子質(zhì)量易于分離純化目的DNA裝載能力強(qiáng)拷貝數(shù)高多重酶識(shí)別位點(diǎn)幾率低應(yīng)屬于松弛型復(fù)制應(yīng)為非傳遞型四、幾種常用的質(zhì)粒載體pBR322來源：大腸桿菌Ori：標(biāo)記基因：apr、tcr分子大小：4363bp拷貝數(shù)：50-100/cellpBR3224363bpOriginofReplicationROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIAprpUC18來源：大腸桿菌Ori：標(biāo)記基因：apr、lacZ’MCS：分子大?。?686bp拷貝數(shù)：1000-2000/cell第二節(jié)λ噬菌體載體λ噬菌體DNA可以作為克隆載體的原因：高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增λDNA缺失達(dá)總量20%的DNA時(shí)，仍不影響其特性，可為外源基因提供裝載空間一、基本概念噬菌體感染周期：吸附注入復(fù)制包裝裂解整合溫和噬菌體烈性噬菌體原噬菌體營養(yǎng)體溶源菌溶菌途徑溶源途徑二、λ噬菌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)及繁殖特性形態(tài)結(jié)構(gòu)頭部：正二十面體、直徑約55nmλDNA：線性、約48kb尾部：長(zhǎng)約150nm、粗12nm繁殖特性λ噬菌體溶源菌裂解侵染渾濁噬菌斑三、λDNA的結(jié)構(gòu)及功能5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos頭部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因(cΙ、cⅡ)早期控制基因阻遏基因重組基因刪除與整合基因l-DNAANRJ左臂區(qū)：A→J中間區(qū)：J→N右臂區(qū)：N→RcΙ基因：編碼阻遏蛋白，使參與溶菌周期活動(dòng)的基因失活cΙ基因表達(dá)：溶源途徑cΙ基因不表達(dá)：溶菌途徑形成渾濁噬菌斑形成噬菌斑四、λ噬菌體載體的構(gòu)建消除多余的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)點(diǎn)突變基因組置換、缺失增加單一酶切位點(diǎn)去除非必要區(qū)段λ噬菌體頭部蛋白可包裝DNA大小：75～105%λDNA長(zhǎng)度（38～52kb）增加篩選標(biāo)記基因五、λ噬菌體載體的主要類型插入型載體：

λDNA缺失部分非必要基因，只含有一個(gè)或兩個(gè)可供外源DNA插入的酶切位點(diǎn)特點(diǎn)：承載能力較?。?lt;10kb）篩選標(biāo)記：基因插入失活免疫功能失活的插入型載體β-半乳糖苷酶基因失活的插入型載體表達(dá)阻遏蛋白免疫功能失活的插入型載體CΙ基因體外包裝插入片段CΙ基因不表達(dá)阻遏蛋白β-半乳糖苷酶失活的插入型載體表達(dá)酶LacZ基因無色混濁噬菌斑插入片段LacZ基因不表達(dá)酶藍(lán)色混濁噬菌斑替換型載體：又稱取代型載體。在λDNA可替換片斷兩端具有兩個(gè)限制酶位點(diǎn)，酶切后可替換片斷與左右翼分開，由外源DNA片斷取代特點(diǎn)：承載能力大篩