DNA重組技術(shù)的基本工具(上課用)

專(zhuān)題1基因工程121.1DNA重組技術(shù)的基本工具基本工具：限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”DNA連接酶——“分子縫合針”基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車(chē)”34（一）限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”①來(lái)源：主要從原核生物中分離純化出來(lái)。②種類(lèi)：已從近300種微生物中分離出4000種限制酶。③作用：1.能識(shí)別雙鏈DNA的某種特定核苷酸序列2.使每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。5磷酸二酯鍵：6具有特異性。一種限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點(diǎn)上切割DNA分子，④作用特點(diǎn)：大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由6個(gè)核苷酸組成少數(shù)的識(shí)別序列由4、5或8個(gè)核苷酸組成⑤限制酶的識(shí)別序列：7EcoRI限制酶的切割：中軸線黏性末端黏性末端在G與A之間切割大腸桿菌的一種限制酶(EcoRⅠ)只能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開(kāi)。8什么叫黏性末端？被限制酶切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。9CCCG

GGGGGCCC中軸線SmaI限制酶的切割：CCCG

GGG

GGCCC平末端平末端只能識(shí)別CCCGGG序列，并在C和G之間切開(kāi)。10產(chǎn)生黏性末端或平末端。⑥限制酶的作用結(jié)果：11你能推測(cè)限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來(lái)病原微生物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。12如果把兩種來(lái)源不同的DNA用同一種限制酶來(lái)切割，會(huì)怎樣呢？會(huì)產(chǎn)生相同的黏性(平)末端，然后讓兩者的黏性(平)末端黏合起來(lái)，就似乎可以合成重組的DNA分子了。思考?13（二）“分子縫合針”——DNA連接酶1、種類(lèi)：⑴E·coliDNA連接酶⑵T4DNA連接酶2、作用：14可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶即恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵15

DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，但效率較低16相同點(diǎn)：形成磷酸二酯鍵不同點(diǎn)：1）DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵2）DNA聚合酶需要以一條DNA鏈為模板；而DNA連接酶不需要模板。不是一回事。17③類(lèi)型：類(lèi)型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來(lái)源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點(diǎn)差別18將外源基因送入受體細(xì)胞。(三)基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車(chē)”①載體的作用：質(zhì)粒λ噬菌體的衍生物動(dòng)植物病毒等②載體的種類(lèi)：19③作為載體的必要條件：有切割位點(diǎn)——供外源DNA片段(基因)插入。能自我復(fù)制——有遺傳標(biāo)記基因——供重組DNA的鑒定和選擇。載體DNA必需是安全的——不會(huì)對(duì)受體細(xì)胞有害，或不能進(jìn)入到除受體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去。載體DNA分子大小應(yīng)適合——以便提取和在體外進(jìn)行操作，太大就不便操作。20質(zhì)粒：裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的、獨(dú)立于細(xì)菌染色體（即擬核DNA）之外，并具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子。21質(zhì)粒：能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制有切割位點(diǎn)有標(biāo)記基因的存在，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基鑒別。221）不屬于質(zhì)粒被選為基因載體的理由是（）

A、能復(fù)制

B、有多個(gè)限制酶切點(diǎn)C、具有標(biāo)記基因D、它是環(huán)狀DNAD練習(xí)232）有關(guān)基因工程的敘述中，正確的是（）A、所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的載體C、載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與目的基因連接D、DNA連接酶使黏性末端的堿基之間形成氫鍵C243.下列四條DNA分子，彼此間具有粘性末端的一組是

A．①②B．②③C．③④D．②④答案：D25４、關(guān)于限制酶的說(shuō)法中，正確的是（）A、限制酶是一種酶，只識(shí)別GAATTC堿基序列B、EcoRI切割的是G—A之間的氫鍵C．限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD．限制酶只存在于原核生物中答案：C26５.（多選）有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是A、基因工程技術(shù)能定向地改造生物的遺傳性狀，培育生物新品種B、重組DNA的形成在細(xì)胞內(nèi)完成C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞D、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體答案：BD27思考與探究P72、為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？通過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列，或者通過(guò)甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開(kāi)。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。283、天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？提示：基因工程中作為載體使用的DNA分子很多都是質(zhì)粒（plasmid），即獨(dú)立于細(xì)菌擬核處染色體DNA之外的一種可以自我復(fù)制、雙鏈閉環(huán)的裸露的DNA分子。是否任何質(zhì)粒都可以作為基因工程載體使用呢？不是，作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件：291）載體DNA必需有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點(diǎn)所處的位置，還必須是在質(zhì)粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。2）載體DNA必需具備自我復(fù)制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。3）載體DNA必需帶有標(biāo)記基因，以便重組后進(jìn)行重組子的篩選。4）載體DNA必需是安全的，不會(huì)對(duì)受體細(xì)胞有害，或不能進(jìn)入到除受體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去。5）載體DNA分子大小應(yīng)適合，以便提取和在體外進(jìn)行操作，太大就不便操作。實(shí)際上自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進(jìn)行人工改造后才能用于基因工程操作。304、DNA連接酶有連接單鏈DNA的本領(lǐng)嗎？

迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的DNA連接酶都不具有連接單鏈DNA的能力，至于原因，現(xiàn)在還不清楚，也許將來(lái)會(huì)發(fā)現(xiàn)可以連接單鏈DNA的酶。31DNA聚合酶DNA連接酶區(qū)別1區(qū)別2相同點(diǎn)DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?1)只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵1)在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵2)以