高效液相色譜法維護

高效液相色譜操作及維護高效液相色譜儀(HPLC)目前常見的HPLC儀生產(chǎn)廠家國外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、島津公司等，國內(nèi)有大連依利特公司、上海分析儀器廠、北京分析儀器廠等。

美國Agilent美國Waters美國戴安日本島津美國VARIAN

日本島津Waters高效液相色譜儀

日本島津高效液相色譜儀開機前的準備工作1、將試驗要求的流動相配制好。2、流動相要過濾脫氣。3、裝好試驗要求的色譜柱。流動相:溶劑的沸點和粘度低沸點的溶劑通常其粘度低，但它在泵中易形成氣泡而影響泵的精度，還因易蒸發(fā)而改變混合流動相的組成。高沸點的溶劑通常會因其粘度而降低柱效。對于有締合傾向的溶劑（特別是水和乙腈，水和甲醇），它們的粘度隨組成的變化是不規(guī)律的。例如：水：乙腈（35：65），水：甲醇（50：50）時，其粘度最大。開機前的準備工作流動相要過濾:以除去其中的微粒物質(zhì)。濾膜：(0.45μm)①脂溶性濾膜（有機濾膜），②水溶性濾膜，③通用型濾膜(聚四氟乙烯能適用于所有溶劑)。HPLC級溶劑（色譜純）使用時不必再過濾了，因生產(chǎn)工藝中已用0.2μm的過濾裝置過濾過了。開機前的準備工作脫氣：為了防止在泵中、流路中、及檢測器中產(chǎn)生氣泡，而影響泵不穩(wěn)定性（使流速不穩(wěn)）和增加檢測器的噪聲，流動相必須脫氣。混合流動相比純?nèi)軇└苋芙饪諝?，極易飽和形成氣泡，有水的流動相特別明顯。脫氣方法：①氦氣脫氣，②真空脫氣（用真空過濾流動相脫氣，在線脫氣機脫氣），③超聲脫氣，④加熱脫氣。以不使流動相中混合物濃度發(fā)生變化為原則。貯液瓶貯液瓶是用來裝流動相的容器，里面還含有一個不銹鋼燒結(jié)過濾器。泵進液管路一般用聚四氟乙烯管。不銹鋼燒結(jié)過濾器套在進液管路上，有兩個功能：一是防止微粒物質(zhì)進入泵，二是作為進液管路的重物，所以常被稱為“沉子”。貯液瓶如被污染了可能會阻塞過濾片，影響泵的性能(使流速不穩(wěn))，出雜峰或產(chǎn)生噪聲。反相色譜法

一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為極性強的水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調(diào)節(jié)保留時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計，它占整個HPLC應用的80%左右。

反相色譜柱以硅膠為基質(zhì)的液相色譜填料多為反相柱，正相柱不太多。①常用硅膠健合C18、C8等填料柱。②對硅膠做堿性脫活的反相柱（在高溫下硅烷化封閉硅羥基），（這類填料對堿性物質(zhì)如對胺有很小的吸附性）。③高穩(wěn)定性反相柱（這種柱可以經(jīng)過酸和堿的作用）。硅膠為基質(zhì)的一些缺點：①在堿性介質(zhì)中（pH＞8）不穩(wěn)定。②在孔隙中大分子擴散困難，降低柱效。③硅膠表面上的剩余硅羥基有離子交換作用。反相色譜法中應注意：盡量不使用乙酸鹽緩沖溶液，因為它和帶陽離子的溶質(zhì)會形成非極性絡合物。不使用鹵化物，以免腐蝕液相色譜儀。對水的質(zhì)量要求很高。一般應用新鮮的高純水。樂百氏也可以用。每次試驗用水都應更換新鮮的水，因水易變質(zhì)，不能長時間不更換。正相色譜法采用極性固定相(如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相)；流動相為相對非極性的疏水性溶劑(烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性較強的化合物(如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。常用的有硅膠柱。

反相HPLC

極性:固定相<流動相固定相-極性弱流動相(甲醇,乙腈等)-極性強極性大物質(zhì)先出峰正相HPLC

極性:固定相>流動相固定相-極性強流動相(己烷,庚烷)-極性弱極性小物質(zhì)先出峰正相色譜20%反相色譜80%正相色譜20%反相色譜80%主流固定相與流動相物理性質(zhì)硅膠純度色譜柱尺寸顆粒形狀粒徑表面積孔徑鍵合類型碳覆蓋率封端化學性質(zhì)固定相-填充材料物理性質(zhì)硅膠純度色譜柱尺寸顆粒形狀粒徑表面積孔徑填料硅膠的純度與殘留金屬離子濃度固定相-填充材料鍵合類型碳覆蓋率封端化學性質(zhì)固定相-填充材料固定相-填充材料色譜柱常用的pH值:隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應用范圍逐漸擴大，現(xiàn)已應用于某些無機樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5（2~8），太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。有報告新商品柱可在pH1.5~10范圍操作。色譜柱色譜柱開機順序：1、打開主機，檢測器，色譜工作站等電源開關。2、將配制好的流動相放入流動相通道內(nèi)，旋開排液（或灌液）旋鈕，將流動相管路中存放的老溶劑替換掉。3、關上排液（或灌液）旋鈕，逐漸將流速升高。平衡至少30分鐘后準備進樣。替換掉管路中存放的老溶劑替換掉管路中存放的老溶劑進樣前準備——樣品過濾一次性注射器針式（頭）過濾器樣品瓶

六通閥/定量環(huán)進樣器儀器：手動進樣器-六通閥/定量環(huán)

手動進樣器工作原理

裝填狀態(tài)樣品注入手動進樣器

液相色譜中，用定量環(huán)進樣時，注射器的抽取量不得少于環(huán)容積的5倍。

儀器：檢測器UV/Vis雙燈，全波長檢測ＤＡＤ檢測器流路儀器：檢測器-紫外反射鏡1＃反射鏡2＃氘燈光源透鏡濾光片（鈥玻璃/遮光）入射狹縫光柵分光器參比光電二極管數(shù)模轉(zhuǎn)換板樣品光電二極管數(shù)模轉(zhuǎn)換板流通池紫外檢測器工作原理Agilent1100可變波長紫外檢測器(G1314A)熒光檢測器蒸發(fā)光檢測器質(zhì)譜檢測器基本概念和術(shù)語

色譜圖(chromatogram)——樣品流經(jīng)色譜柱和檢測器，所得到的信號-時間曲線，又稱色譜流出曲線(elutionprofile)?；€(baseline)——經(jīng)流動相沖洗，柱與流動相達到平衡后，檢測器測出一段時間的流出曲線。一般應平行于時間軸。噪音(noise)——基線信號的波動。通常因電源接觸不良或瞬時過載、檢測器不穩(wěn)定、流動相含有氣泡或色譜柱被污染所致。漂移(drift)——基線隨時間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產(chǎn)生漂移基本概念和術(shù)語色譜峰(peak)——組分流經(jīng)檢測器時響應的連續(xù)信號產(chǎn)生的曲線。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱形正態(tài)分布曲線（高斯Gauss曲線）。不對稱色譜峰有兩種：前延峰(leadingpeak)和拖尾峰(tailingpeak)。前者少見。峰底—基線上峰的起點至終點的距離。峰高(peakheight，h)—峰的最高點至峰底的距離。

基本概念和術(shù)語峰寬（peakwidth，W)—峰兩側(cè)拐點處所作兩條切線與基線的兩個交點間的距離。W＝4σ半峰寬（peakwidthathalf-height，W1/2)—峰高一半處的峰寬。W1/2＝2.355σ峰面積(peakarea，A)—峰與峰底所包圍的面積。保留時間(retentiontime，tR)——從進樣開始到某個組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時間。基本概念和術(shù)語理論塔板數(shù)(theoreticalplatenumber，N)——用于定量表示色譜柱的分離效率（簡稱柱效）。分離度(resolution，R)——相鄰兩峰的保留時間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。R≥1.5稱為完全分離?！吨袊幍洹芬?guī)定R應大于1.5。理論塔板數(shù)(N)分離度(R)基本概念和術(shù)語拖尾因子(tailingfactor，T)——用以衡量色譜峰的對稱性。也稱為對稱因子(symmetryfactor)或不對稱因子(asymmetryfactor)?！吨袊幍洹芬?guī)定T應為0.95~1.05。T＜0.95為前延峰，T＞1.05為拖尾峰。定性或定量通過與對照品保留時間的一致性來進行定性。定量常用:a:外標法b:內(nèi)標法液相色譜分離定量常用的基本公式a:外標法

含量（CX）=CR×AX/AR

CX為供試品濃度AX為供試品峰面積CR為對照品濃度AR為對照品峰面積液相色譜分離定量常用的基本公式b:內(nèi)標法

校正因子（f）=

AS×CR/CS×AR

含量（CX）=f×

AX×CS/ASAX為供試品峰面積CX為供試品濃度

AR為對照品峰面積

CR為對照品濃度

AS為內(nèi)標峰面積CS為內(nèi)標濃度對儀器的一般要求

:除另有規(guī)定外，柱溫為室溫，檢測器為紫外吸收檢測器。正文中各品種項下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得任意改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變，以適應具體品種并達到系統(tǒng)適用性試驗的要求。報告書書寫內(nèi)容：檢品名稱：******片批號：200702016檢驗項目：中國藥典2005年版二部附錄ⅤD標準規(guī)定：含******應為標示量的90.0%～110.0%儀器編號：YQ.H.測定日期：室溫：℃色譜柱編號：色譜柱規(guī)格：4.6mm×250mm色譜柱：固定相C18柱溫：25℃檢測器：紫外檢測器檢測波長：260nm流動相：水—乙腈（60∶40）流速：1ml/min進樣量：20μl報告書書寫內(nèi)容：理論板數(shù)規(guī)定值：按******峰計算不低于1000測定值：分離度規(guī)定值：大于1.5測定值：對照品名稱：******對照品批號：123-200701對照品來源：中國藥品生物制品檢定所報告書書寫內(nèi)容：試驗方法試驗計算試驗結(jié)果試驗結(jié)論HPLC日常維護－總結(jié)定期檢查溶劑過濾器查看過濾器是否變色．臨時取下過濾器，檢查柱前壓力是否正常．清潔溶劑過濾器將堵塞的溶劑過濾器從瓶頭組件中拿下。先用水沖洗殘留之溶劑，然后將過濾器放在裝有濃硝酸（35％）的燒杯里浸一小時，不要使用超聲波清洗。用二次蒸餾水徹底沖洗過濾器。建議不使用超聲波清洗機清洗。將過濾器重新裝好。定期檢查溶劑過濾器建議定期清洗溶劑過濾器及溶劑瓶，每三個月至少清洗一次。注意：不要使用沒有安裝溶劑過濾器的系統(tǒng)．可能會嚴重堵塞系統(tǒng).日常維護流動相應經(jīng)過0.45um或更小孔徑的濾器過濾，如果使用濾膜，注意有機膜與水膜的區(qū)別(聚四氟乙烯能適用于所有溶劑)注意不同檢測器流通池耐壓問題，盡量避免使用pH>9.5的流動相，以防腐蝕流通池石英窗，避免使用可能析晶的流動相，防止流通池堵塞使用PEEK（polyetheretherketone）管路和接頭需要注意什么問題？如果經(jīng)常需要改變流路或更換不同品牌的色譜柱，使用PEEK材料制成的管路和接頭會非常方便。PEEK管路容易連接；PEEK接頭不僅無需工具，手擰即可固定，而且容易調(diào)節(jié)錐箍之外的管路長度，方便與不同品牌或規(guī)格的色譜柱相連接。

使用此類材料的管路需要注意的是：PEEK對鹵代烷烴和四氫呋喃的兼容性不好。雖然未觀察到上述溶劑溶解PEEK材料的明顯跡象，但PEEK遇到上述溶劑會變脆。

使用PEEK管路和接頭需要注意什么問題？另一個需要考慮的因素是壓力限。不銹鋼管可耐受6000psi的壓力，但PEEK管只能耐受近4000psi（但多數(shù)HPLC應用系統(tǒng)壓力不會超過3000psi）。使用PEEK接頭時則無需擔心接頭耐溶劑性能，因為接頭幾乎或很少與溶劑直接接觸。但手擰固定的PEEK接頭壓力限低于不銹鋼管，因而壓力高時，可能會使接頭在管路上滑動而產(chǎn)生死體積或漏液。如何預防液相泵的故障:

要保持泵的良好操作性能,必須維護系統(tǒng)的清潔,保證溶劑和試劑的質(zhì)量,對流動相進行過濾和脫氣.下面列出預防泵故障的幾項措施:

1)用高質(zhì)量試劑和HPLC級溶劑；

2）過濾流動相和溶劑；

3）脫氣；

4）每天開始使用時放空排氣，工作結(jié)束后從泵中洗去緩沖液；

5）不讓水或腐蝕性溶劑滯留泵中；高效液相色譜中

常遇見的問題及處理方法

基線噪音大可能由那些原因引起

可能原因是：泵壓不穩(wěn)，流動池有氣泡，流動池被污染，對紫外檢測器可將流動池移走即可確認。色譜柱污染，系統(tǒng)管路污染。燈能量不足，光學系統(tǒng)老化或污染，參數(shù)設計不合理。外界因素影響，如電源，溫度和濕度，震動，等。峰面積重現(xiàn)性不好1.首先觀察壓力是否穩(wěn)定，以及觀察峰面積變化是否有規(guī)律。若壓力不穩(wěn)定，請檢查造成壓力不穩(wěn)定的因素，如：漏液，排液時間不足夠，鹽濃度過高導致鹽析，主動閥比例閥內(nèi)漏，等。

2.若壓力穩(wěn)定但峰面積呈無規(guī)律變化，請檢查樣品是否足夠，確認樣品的穩(wěn)定性，必要時重新配制。檢查進樣閥是否漏液。等。

3.若壓力穩(wěn)定且峰面積呈規(guī)律變化，多數(shù)為色譜柱未平衡好。保留時間不穩(wěn)定1.

首先觀察保留時間是否有規(guī)律的變化，并同時觀察壓力是否穩(wěn)定，若壓力穩(wěn)定而保留時間呈有規(guī)律變化，多數(shù)是色譜柱未平衡好，特別是含有的流動相，需較長的時間去平衡。2.若壓力穩(wěn)定而保留時間無規(guī)律變化，請檢查溶劑過濾頭及真空腔是否有堵塞。再平衡色譜柱足夠時間，如仍然不佳，可更換一色譜柱。3.若壓力不穩(wěn)定，請檢查造成壓力不穩(wěn)定的因素，如：漏液，排液時間不足夠，鹽濃度過高導致鹽析，主動閥比例閥內(nèi)漏，等。一、保留時間縮短

1.流速增加2.樣品超載3.鍵合相流失4.流動相組成變化5.溫度增加1.檢查泵,重新設定流速2.降低樣品量3.流動相PH值保持在3～7.5

檢查柱的方向4.防止流動相蒸發(fā)或沉淀5.柱恒溫二、保留時間延長

1.流速下降2.硅膠柱上活性點變化3.鍵合相流失4.流動相組成變化5.溫度降低1.管路泄漏,更換泵密封圈,排除泵內(nèi)氣泡2.用流動相改性劑,如加三乙胺,或采用堿至鈍化柱3.流動相PH值保持在3～7.5檢查柱的方向4.防止流動相蒸發(fā)或沉淀5.柱恒溫三

、出現(xiàn)肩峰或分叉

1.樣品體積過大2.樣品溶劑過強3.柱塌陷或形成短路通道4.柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效5.進樣器損壞1.用流動相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15%2.采用較弱的樣品溶劑3.更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件4.更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品5.更換進樣器轉(zhuǎn)子四、鬼峰

1.進樣閥殘余峰2.樣品中未知物3.柱未平衡4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽譜)5.水污染(反相)1.每次用后用強溶劑清洗閥,改進閥和樣品的清洗2.處理樣品3.重新平衡柱,用流動相作樣品溶劑

(尤其是離子對色譜)4.每天新配,用抗氧化劑5.通過變化