微生物生理學第四章

第四章

異養(yǎng)微生物的生物氧化代謝概論葡萄糖酵解途徑發(fā)酵作用呼吸作用能量產(chǎn)生生物大分子的降解其他單糖物質(zhì)的分解其他化合物的生物氧化自養(yǎng)微生物利用無機物異養(yǎng)微生物利用有機物生物氧化能量微生物直接利用儲存在高能化合物（如ATP）中以熱的形式被釋放到環(huán)境中生物氧化（biologicaloxidation）：發(fā)生在活細胞內(nèi)的一系列產(chǎn)能性氧化反應的總稱。最初能源有機物還原態(tài)無機物日光化能異養(yǎng)微生物化能自養(yǎng)微生物光能營養(yǎng)微生物通用能源（ATP）一切生命活動都是耗能反應，能量代謝是新陳代謝中的核心問題。生物氧化與燃燒的區(qū)別比較項目燃燒生物氧化步驟一步式快速反應多步式梯級反應條件激烈溫和催化劑無酶產(chǎn)能形式熱、光大部分為ATP能量利用率低高生物氧化的形式脫氫失去電子某物質(zhì)與氧結(jié)合生物氧化的過程遞氫（或電子）受氫（或電子）脫氫（或電子）生物氧化的類型無氧呼吸發(fā)酵有氧呼吸生物氧化的功能產(chǎn)還原力［H］產(chǎn)小分子中間代謝物產(chǎn)能（ATP）第一節(jié)代謝概論代謝（metabolism）：細胞內(nèi)發(fā)生的各種化學反應的總稱代謝分解代謝(catabolism)合成代謝(anabolism)復雜分子（有機物）分解代謝合成代謝簡單小分子ATP[H]一、代謝類型

新陳代謝＝分解代謝＋合成代謝

一切生物，在其新陳代謝的本質(zhì)上具有高度的統(tǒng)一性和明顯的多樣性。

根據(jù)代謝過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對生物體的作用不同，可分為：初級代謝:產(chǎn)物有氨基酸、糖、核苷酸、維生素等

次級代謝：產(chǎn)物有色素、抗生素、毒素等

對于同一種物質(zhì)來說，其分解代謝和合成代謝的途徑并不是可逆反應，而是通過不同的中間反應或不同的酶實現(xiàn)的。

A→B→CC→Bˊ→AABCE1E2E1'E2

'二、微生物代謝的研究方法1、靜息細胞法靜息細胞：收集菌體洗滌后懸浮在生理鹽水中培養(yǎng)呈饑餓狀態(tài)的細胞，這是以整體細胞水平進行的研究方法。主要研究內(nèi)容：判斷代謝過程；發(fā)現(xiàn)新的生長素不足之處：不能了解代謝途徑和中間過程；誤差大，因有些物質(zhì)不能透過細胞膜并不是不能參與代謝?？朔椒ǎ河脽o細胞制劑進行研究。2、瓦勃氏呼吸儀法原理：Boyles定律和Henry定律即氣體定律。測定時測定一定條件下反應中氧的吸收量或CO2的放出量，還可測出它們的吸收或放出速度。應用：研究微生物代謝過程呼吸、發(fā)酵、酶的活性等。例如，測定大腸桿菌的呼吸作用及碘乙酸對呼吸的影響。測定谷氨酸含量。優(yōu)點：操作簡便，準確度高，所需材料少，應用范圍廣泛。3、酶抑制劑法（enzymeinhibitor）酶的抑制劑可使代謝途徑受到阻斷，造成某一代謝中間物的積累，從而可以推測代謝途徑。4、同位素示蹤法（isotopictracermethod）常用的放射性同位素有H、C、P、S、I優(yōu)點：①可以解決一些其他方法不能解決的難題。②具有高度靈敏性，可以測量極微量的物質(zhì)，可以測到10-16~10-14g物質(zhì)。③在微生物生長期間進行連續(xù)追蹤觀察。

3143235131含同位素的化合物與不含同位素的同一物質(zhì)化學性質(zhì)和生理功能完全相同5、突變株的應用營養(yǎng)缺陷型突變株：初級代謝物合成受阻特異營養(yǎng)突變型：次級代謝物合成受阻共合成法

：生長因子的微生物分析法：利用營養(yǎng)缺陷型的生長量和其所必需的生長因子的濃度在一定范圍內(nèi)呈正比的關系來測定的。AB維生素濃度生長量。。三、生物力能學基本原理1、自由能（freeenergy）凡是能夠用于做功的能量稱為自由能，總能量中只有一部分能轉(zhuǎn)化為功即表現(xiàn)為自由能。在生物體中通過化學反應放出自由能可供機體利用，

A+B→C+D+能當ΔG＜0時，反應能自發(fā)進行，并能放出能量；當ΔG＝0時，反應達到平衡；當ΔG＞0時，反應不能自發(fā)進，必須“注入”能量才能進行。化合物所含的自由能決定于化合物中所含基團的能量，一般不穩(wěn)定的、活潑的化學鍵具有高的自由能。在化學反應中：0ΔG'＝ΔG'＋RTlnKeq

ΔG＝ΔG＋RTlnKeq

ΔG=-RTlnKeq

00△G的單位以焦耳/摩爾（J/mol）或千焦耳/摩爾（kJ/mol）表示ΔG：標準自由能變化

0ΔG'：pH＝7.0時的標準自由能變化02、氧化還原電位氧化還原反應：氧化型還原型還原劑失掉電子的傾向（氧化劑得到電子的傾向）稱為氧化還原電勢（oxidation-reductionpotential），也稱氧化還原電位（V）。能斯特（Nernst）公式：

氧化還原體系標準氧化還原電位E0’（V）氧化還原體系標準氧化還原電位E0’（V）乙酸/乙醛－0.58草酰乙酸/蘋果酸－0.1653－磷酸甘油酸/3－磷酸甘油醛

－0.55延胡索酸/琥珀酸+0.031乙酰CoA/丙酮酸－0.48CoQ/CoQH2+0.0352H+/H2

－0.42細胞色素box/細胞色素bred+0.08NAD+/NADH+H+

－0.32細胞色素cox/細胞色素cred

+0.235FMN/FMNH2－0.22細胞色素a3ox/細胞色素a3red+0.385乙醛/乙醇

－0.197?O2/H2O+0.816丙酮酸/乳酸－0.185生物體內(nèi)一些氧化還原體系的標準氧化還原電位3、高能磷酸化合物最普遍的是ATP

。

ATP是能量的攜帶者，通過磷酸基團的傳遞而傳遞能量。能量貨幣

化合物△G0'（kJ/mol）

化合物△G0'（kJ/mol）磷酸烯醇式丙酮酸－61.9腺苷三磷酸（ATP→ADT+Pi）－30.5氨甲酰磷酸－51.51-磷酸葡萄糖－20.9

1，3-二磷酸甘油酸－49.36-磷酸果糖－15.9磷酸肌酸－43.16-磷酸葡萄糖－13.8乙酰磷酸－42.31-磷酸甘油－9.2磷酸精氨酸－32.2一些磷酸化合物水解的標準自由能值

第二節(jié)葡萄糖酵解途徑糖酵解（glycolysis）：生物體內(nèi)葡萄糖被降解成丙酮酸的過程。EMPHMPEDWD葡萄糖直接氧化五種途徑

HKPK一、EMP途徑（Embden-Meyerhof-Parnaspathway）又稱己糖二磷酸途徑概述：大多數(shù)生物的主流代謝途徑。它以1分子葡萄糖為底物，經(jīng)過10步反應而產(chǎn)生2分子丙酮酸、2分子NADH+H+和2分子ATP的過程。2階段、3種產(chǎn)物和10個反應。EMP途徑的簡圖和總反應式：ATPADPATPADPADPATPADPATPNAD+NADH+H+aa:耗能階段bb:產(chǎn)能階段底物水平磷酸化底物水平磷酸化EMP途徑EMP途徑意義：為細胞生命活動提供ATP和NADH及碳骨架通過逆向反應進行多糖合成。葡萄糖葡糖-6-磷酸果糖-6-磷酸果糖-1，6-二磷酸磷酸二羥丙酮甘油醛-3-磷酸1，3-二磷酸甘油酸3-磷酸甘油酸2-磷酸甘油酸磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸特征性酶：1，6-二磷酸果糖醛縮酶運輸調(diào)節(jié)突變株氨基酸分泌共合成信號肽假說自由能生物氧化氧化還原電位新陳代謝高能磷酸化合物分解代謝糖酵解合成代謝EMP初級代謝次級代謝靜息細胞瓦氏呼吸儀同位素示蹤法二、HMP途徑（hexose

monophosphatepathway）又稱單磷酸己糖途徑、戊糖磷酸途徑概述：另一重要途徑。其特點是葡萄糖不經(jīng)過EMP途徑和TCA循環(huán)而得到徹底氧化，并能產(chǎn)生大量NADP+H+形式的還原力以及多種重要中間代謝物。HMP途徑的簡圖和總反應式：分為兩個階段：非氧化階段：5-磷酸核酮糖在轉(zhuǎn)酮酶和轉(zhuǎn)醛酶催化下使部分碳鏈進行相互轉(zhuǎn)換，經(jīng)三碳、四碳、七碳和磷酸酯等，最終生成2分子6-磷酸果糖和1分子3-磷酸甘油醛。氧化階段：3個分子6-磷酸葡萄糖經(jīng)氧化脫羧生成6個分子NADPH+H+，3個分子CO2和3個分子5-磷酸核酮糖氧化階段非氧化階段HMP途徑生理功能：為生物合成提供大量的還原力（NADPH）和各種不同長度的重要的中間代謝產(chǎn)物。在同一微生物中往往同時存在HMP和EMP途徑，單獨有HMP或EMP的微生物少見，這兩種途徑所占比例隨種類和環(huán)境條件不同。測定時可采用同位素標記法。C6/C1的比值越小，說明HMP占得比重越大。不同微生物中葡萄糖降解途徑的分布

微生物EMP（%）HMP（%）ED（%）釀酒酵母8812－產(chǎn)朊假絲酵母66～8119～34－灰色鏈霉菌973－產(chǎn)黃青霉7723－大腸桿菌7228－銅綠假單胞菌－2971嗜糖假單胞菌－－100枯草芽孢桿菌7426－氧化葡糖桿菌－100－真養(yǎng)產(chǎn)堿菌－－100運動發(fā)酵單胞菌－－100藤黃八疊球菌7030－三、ED途徑（Entner-Doudoroffpathway）概述：存在于某些缺乏完整EMP途徑的微生物中的一種代替途徑，為微生物所特有，特點是葡萄糖只經(jīng)過4步反應即可快速獲得丙酮酸。生理功能：主要是提供能量與還原力NADPH。特點:a、步驟簡單、快速

b、產(chǎn)能效率低：1ATPc、關鍵中間產(chǎn)物KDPG，特征酶：2-酮3-脫氧磷酸葡萄糖酸醛縮酶。

d、主要存在于Gˉ特別是假單胞菌屬的一些細菌，如銅綠、熒光假單胞菌,運動發(fā)酵單胞菌等，根瘤菌，固氮菌。

1分子的葡萄糖徑EMP和ED途徑都產(chǎn)生2分子丙酮酸，如何區(qū)分？鑒定特征酶即1，6-二磷酸果糖醛縮酶和2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡萄糖酸醛縮酶，比較二種酶活性的高低。利用放射性同位素14C標記葡萄糖，測定14CO2來源，EMP途徑14CO2來自第3、4位碳原子，ED途徑來自第1、4位碳原子

EMP和ED途徑中CO2的來源途徑EMPHMPED特征酶1,6-二磷酸果糖醛縮酶（FDA）轉(zhuǎn)酮酶（TK）轉(zhuǎn)醛酶（TA）2-酮-3-脫氧-6-磷酸萄糖酸醛縮酶（KDPGA）首先脫羧部位C3，C4C1C1，C4產(chǎn)生ATP數(shù)目211還原輔酶NADHNADPHNADHNADPHEMP、HMP、ED途徑（葡萄糖降解為丙酮酸）的特點四、WD途徑（Warburg-Dickenspathway）又稱磷酸解酮酶途徑（Phosphoketolasepathway）根據(jù)解酮酶不同分為兩種途徑：PK途徑（分解磷酸戊糖）HK途徑（分解磷酸已糖）在腸膜狀明串珠菌和兩岐雙歧桿菌中基本上不存在EMP、HMP、ED三條途徑。PK途徑（腸膜明串珠菌、番茄乳桿菌、甘露醇乳桿菌、短桿乳桿菌）或乙醇特征酶：磷酸戊糖解酮酶

1G乳酸+乙醇+1ATP

+NADPH+H+HK途徑（兩歧雙歧桿菌）

2葡萄糖

2葡萄糖-6-磷酸6-磷酸果糖

6-磷酸-果糖同EMP4-磷酸-赤蘚糖乙酰磷酸2木酮糖-5-磷酸磷酸戊糖解酮酶逆HMP途徑2甘油醛-3-磷酸2乙酰磷酸2乳酸2乙酸乙酸乙酸激酶景天庚酮糖-7-磷酸甘油醛-3-磷酸磷酸己糖解酮酶1G乳酸+1.5乙酸+2.5ATP

ATP4ATP2ATP五、葡萄糖直接氧化途徑特點：有些細菌中不具備已糖激酶，利用氧化酶，消耗氧，把葡萄糖直接氧化成葡萄糖酸再磷酸化后降解。（某些假單胞菌、氣桿菌和醋桿菌）

第三節(jié)發(fā)酵作用（fementation）發(fā)酵（狹義）：在沒有外源電子受體時，微生物將有機物氧化放出的電子直接交給底物本身未完全氧化的某一中間產(chǎn)物，產(chǎn)生各種不同的代謝產(chǎn)物，同時放出能量的過程。

ADPATP底物-H底物中間代謝物中間代謝物-H2工業(yè)上（廣義）：發(fā)酵是指任何利用好氧或厭氧微生物來生產(chǎn)有用代謝物的一類生產(chǎn)方式。無氧下特點：通過底物水平磷酸化產(chǎn)ATP；葡萄糖氧化不徹底，大部分能量存在于發(fā)酵產(chǎn)物中；產(chǎn)能率低；產(chǎn)多種發(fā)酵產(chǎn)物。

發(fā)酵過程中的碳流和電子流①

乙醇發(fā)酵②

乳酸發(fā)酵③丙酸發(fā)酵④混合酸發(fā)酵⑤丁二醇發(fā)酵⑥

丁酸型發(fā)酵一、發(fā)酵平衡

發(fā)酵時產(chǎn)生了多種不同的末端產(chǎn)物，它們有的是具有更高氧化態(tài)的，而有些是具有更高還原態(tài)的，末端產(chǎn)物的平均氧化水平與底物的氧化水平是相平衡的，表明發(fā)酵過程是能夠保持氧化還原平衡的。發(fā)酵過程的氧化還原平衡要求限制了發(fā)酵降解的有機化合物種類，即底物既不能有太高的氧化水平，也不能有太高的還原水平，碳水化合物是主要的發(fā)酵底物?？偡磻狢6H12O6→2CH3CH2OH+2CO2

碳的氧化-還原態(tài)0-2+4氧化-還原平衡6×0＝2〔2×（－2）〕＋2×4

葡萄糖的乙醇發(fā)酵

葡萄糖2×丙酮酸EMP途徑丙酮酸脫羧酶2×乙醛2×CO2乙醇脫氫酶2×乙醇NAD+NADH2NADH2NAD+關鍵酶1分子2分子二、乙醇發(fā)酵和甘油發(fā)酵1、酵母菌發(fā)酵（1）酵母菌的第一型發(fā)酵（乙醇發(fā)酵）※該乙醇發(fā)酵過程只在pH3.5~4.5以及厭氧的條件下發(fā)生。C6H12O6+2ADP+2Pi→2CH3CH2OH+2CO2+2ATP葡萄糖丙酮酸EMP途徑丙酮酸脫羧酶乙醛CO2磷酸甘油脫氫酶NAD+NADH2NADH2NAD+磷酸二羥丙酮3－P－甘油甘油EMP途徑NAD+NADH2難溶復合物NaHSO3（2）酵母菌的第二型發(fā)酵（甘油發(fā)酵）※亞硫酸氫鈉必須控制亞適量（3%）

SO3NaC6H12O6+NaHSO3→CH2OHCHOHCH2OH+CH3CHOH+CO2葡萄糖丙酮酸EMP途徑丙酮酸脫羧酶乙醛CO2磷酸甘油脫氫酶乙醇NAD+NADH2NADH2NAD+磷酸二羥丙酮乙酸3－P－甘油甘油EMP途徑NAD+NADH2歧化反應

（3）酵母菌的第三型發(fā)酵（甘油發(fā)酵）※該反應只在弱堿性條件下發(fā)生。2C6H12O6

→CH3COOH+CH3CH2OH+2CO2+2CH2OHCHOHCH2OH酵母菌的酒精發(fā)酵（均在厭氧條件下）第三型發(fā)酵——pH7.6左右（微堿性）第一型發(fā)酵——pH3.5～4.5（弱酸性）第二型發(fā)酵——亞適量NaHSO3（3％）甘油、少量的乙醇、乙酸和CO2，0個ATP甘油和少量乙醇，0個ATP乙醇，2個ATP通過酵母菌的三個類型發(fā)酵的分析，可以看出工藝條件對發(fā)酵工業(yè)的重要性。工藝條件不同，發(fā)酵的產(chǎn)品性質(zhì)和數(shù)量不同，其他類型的發(fā)酵也是如此。酒精工業(yè)發(fā)展趨向一是利用廢料、垃圾來代替淀粉原料，利用纖維素、半纖維素原料生產(chǎn)乙醇是當今研究的一個熱點。二是應用高溫菌種來生產(chǎn)，利用耐高酒精度的菌種來生產(chǎn)。三是用固定化細胞連續(xù)發(fā)酵。四是在真空條件下邊發(fā)酵邊蒸餾，使發(fā)酵液中酒精濃度始終處于很低水平。2、細菌的乙醇發(fā)酵

發(fā)酵單胞菌和嗜糖假單胞菌

1G2丙酮酸

特點：代謝速率高，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率高，發(fā)酵周期短等。缺點是生長pH較高，較易染雜菌，并且對乙醇的耐受力較酵母菌低.

（ED）乙醇+

1ATP乳酸菌、腸道菌和一些嗜熱細菌1G2丙酮酸

乙醇+

2ATP（EMP）酶抑制劑

發(fā)酵作用同位素示蹤

發(fā)酵平衡共合成

乙醇發(fā)酵自由能氧化還原電位高能磷酸化合物糖酵解EMPHMPEDWD

乳酸發(fā)酵進行乳酸發(fā)酵的都是細菌：如短乳桿菌，乳鏈球菌等

細菌積累乳酸的過程是典型的乳酸發(fā)酵。我們熟悉的牛奶變酸，生產(chǎn)酸奶，漬酸菜，泡菜，青貯飼料都是乳酸發(fā)酵三、乳酸發(fā)酵

乳酸發(fā)酵在工業(yè)上用于生產(chǎn)乳酸，在農(nóng)業(yè)上用于青貯飼料的發(fā)酵，在食品加工業(yè)上也有廣泛的應用。因此，乳酸是一種需求量很大的發(fā)酵產(chǎn)品。全世界每年乳酸的消費量為13～15萬噸，我國的乳酸生產(chǎn)量11，000噸。目前發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸的產(chǎn)酸水平普遍在9～10％，中試報道也達到12～14％，國外的產(chǎn)酸水平是18％。葡萄糖2×丙酮酸EMP途徑乳酸脫氫酶2×乳酸NAD+NADH2NAD+同型乳酸發(fā)酵（homolacticfermentation）

乳酸桿菌屬、鏈球菌屬C6H12O6+2ADP+2Pi→2CH3CHOHCOOH+2ATP

葡萄糖乙酰磷酸PK途徑乙醛乳酸脫氫酶乳酸NADH2NAD+3－P－甘油醛NAD+丙酮酸乙醇＋CO2異型乳酸發(fā)酵（heterolactic

ermentation）

腸膜明串珠菌

C6H12O6+ADP+Pi→CH3CHOHCOOH+CH3CH2OH+CO2+ATP雙歧發(fā)酵（兩歧雙歧桿菌）

2葡萄糖

2葡萄糖-6-磷酸6-磷酸果糖

6-磷酸-果糖4-磷酸-赤蘚糖乙酰磷酸2木酮糖-5-磷酸磷酸戊糖解酮酶2甘油醛-3-磷酸2乙酰磷酸2乳酸2乙酸乙酸乙酸激酶磷酸己糖解酮酶2C6H12O6+5ADP+5Pi→2CH3CHOHCOOH+3CH3COOH+5ATP四、丙酸發(fā)酵（費氏丙酸桿菌）產(chǎn)物除丙酸外，還有乙酸和CO2

琥珀酸－丙酸途徑關鍵中間產(chǎn)物乙酸+CO2丙酸丙酸及其鹽類對引起面包產(chǎn)生粘絲狀物質(zhì)的好氣性芽孢桿菌有抑制作用，但對酵母無效，因此國內(nèi)廣泛用于面包糕點的防腐。EMP五、丁酸與丙酮-丁醇發(fā)酵

這類發(fā)酵由專性厭氧菌梭狀芽孢桿菌分解葡萄糖進行。發(fā)酵終產(chǎn)物主要是丁酸、丙酮和丁醇。丁酸發(fā)酵：代表菌是丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum），發(fā)酵產(chǎn)物有丁酸、乙酸、CO2和H2。

丙酮-丁醇發(fā)酵:

在丁酸發(fā)酵過程中，當pH降至4.5時，CoA轉(zhuǎn)移酶被活化，生成丙酮和丁醇。這是嚴格厭氧菌進行的唯一能大規(guī)模生產(chǎn)的發(fā)酵產(chǎn)品（丙酮、丁醇、乙醇混合物，其比例3：6：1）。生產(chǎn)菌種是丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutyricum)2葡萄糖+4ADP+4Pi→

丁醇+丙酮+4H2+5CO2+4ATP葡萄糖＋3ADP＋3Pi→丁酸＋2CO2＋2H2＋3ATPCoA轉(zhuǎn)移酶葡萄糖2×丙酮酸EMP途徑丙酮酸鐵氧還蛋白氧化酶2×乙酰CoA丁醛脫氫酶NAD+NADH2NADH2NAD+丁酰CoA丙酮丁醛丁醇CO2NADH2NAD+丁醇脫氫酶丁酸CoA轉(zhuǎn)移酶乙酸乙酰CoACoA轉(zhuǎn)移酶高能磷酸化合物糖酵解EMPHMPEDWD發(fā)酵作用發(fā)酵平衡乙醇發(fā)酵甘油發(fā)酵乳酸發(fā)酵丙酸發(fā)酵丁酸發(fā)酵丙酮丁醇發(fā)酵

六、混和酸發(fā)酵和丁二醇發(fā)酵

進行這類發(fā)酵的是腸道菌，不同的腸道菌具有不同的酶系來作用于丙酮酸，所以終產(chǎn)物是不同的。以大腸桿菌為代表的一類腸道菌，例如，埃希氏菌、志賀氏菌、沙門氏菌等，發(fā)酵產(chǎn)物主要是甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸等有機酸和CO2、H2，所以稱為混合酸發(fā)酵。產(chǎn)氣桿菌、沙雷氏菌、歐文氏菌等等發(fā)酵產(chǎn)物主要是丁二醇，所以稱之為丁二醇發(fā)酵。

葡萄糖琥珀酸

草酰乙酸

磷酸烯醇式丙酮酸

乳酸

丙酮酸

乙醛

乙酰

CoA

甲酸

乙醇

乙酰磷酸

CO2H2

乙酸丙酮酸甲酸裂解酶乳酸脫氫酶甲酸-氫裂解酶磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶乙酸激酶PEP羧化酶乙醛脫氫酶+2HpH﹤6.2混合酸發(fā)酵

葡萄糖

乳酸

丙酮酸乙醛

乙酰CoA

甲酸乙醇

乙酰乳酸

二乙酰3-羥基丁酮

2,3-丁二醇CO2H2-乙酰乳酸合成酶-乙酰乳酸脫羧酶2,3-丁二醇脫氫酶EMP2,3-丁二醇發(fā)酵O2兩個重要的鑒定反應：1、甲基紅（M.R）反應2、V．P．實驗

E.coli：

V.P.試驗（-），甲基紅（+）產(chǎn)氣腸桿菌：

V.P.試驗（+），甲基紅（-）丙酮酸乙酰乳酸3-羥基丁酮乙二酰紅色物質(zhì)（OH-、O2）中性丁二醇胍基V.P.試驗的原理：

丙酮酸的發(fā)酵產(chǎn)物*表示含NADH+H+→NAD+的過程發(fā)酵菌種途徑產(chǎn)ATP數(shù)酒精發(fā)酵酵母菌細菌EMPEMP/ED22/1甘油發(fā)酵酵母菌3%NaHSO3pH7.6少量/00乳酸發(fā)酵鏈球菌腸膜明串珠菌兩歧雙歧桿菌EMPPKHK212.5丁酸發(fā)酵丁酸梭狀芽孢桿菌EMP3丁醇-丙酮發(fā)酵丙酮丁醇梭菌EMP2混合酸發(fā)酵大腸桿菌EMP2.5丁二醇發(fā)酵產(chǎn)氣桿菌EMP2丙酸發(fā)酵丙酸細菌琥珀酸-丙酸途徑2各種發(fā)酵類型比較

微生物通過氧化作用放出電子，并將釋放出的電子經(jīng)電子傳遞鏈傳給外源電子受體，從而生成水或其它還原型產(chǎn)物并釋放出能量的過程，稱為呼吸作用。

第四節(jié)呼吸作用（respiration）呼吸作用與發(fā)酵作用的根本區(qū)別：

底物在氧化過程中放出的電子不是直接交給底物降解的中間產(chǎn)物（有機物），而是通過一系列電子載體最終交給外源電子受體。以氧化型化合物作為最終電子受體有氧呼吸（aerobicrespiration）：無氧呼吸（anaerobicrespiration）：以分子氧作為最終電子受體

有氧呼吸過程中的碳流和電子流（a）化能異養(yǎng)型微生物（b）化能自養(yǎng)型微生物一、有氧呼吸（aerobicrespiration）

外源的電子受體是分子氧，而電子供體是微生物進行生物氧化的能源化合物（氧化底物）。異養(yǎng)微生物碳源和能源是一樣的，化能自養(yǎng)型微生物二者是分別不同的物質(zhì)。

這是一種遞氫和受氫都必須在有氧條件下完成的生物氧化作用，是一種高效產(chǎn)能方式。1、葡萄糖的有氧分解途徑是在有氧條件下進行的，好氧或兼性厭氧微生物將葡萄糖徹底氧化，分為四個階段：①葡萄糖降解為丙酮酸，與EMP途徑完成相同，在細胞質(zhì)中進行。②丙酮酸進入三羧酸循環(huán)之前氧化脫羧、脫氫生成乙酰CoA。③TCA循環(huán)。④電子傳遞鏈，NADH及FADH2被氧化并合成大量的ATP。（1）丙酮酸生成乙酰CoA

丙酮酸不能直接進入三羧酸循環(huán)，而是先要被氧化脫羧生成乙酰CoA：CH3COCOOH+NAD++CoA→CH3COCoA+NADH+H++CO2丙酮酸脫氫酶系：它是包含三個酶的大復合體：24個分子丙酮酸脫氫酶（E1），24個分子硫辛酸轉(zhuǎn)乙酰酶（E2）和12個分子二氫硫辛酸脫氫酶（E3）。特點：四步脫氫反應；兩次脫羧反應；一次底物水平磷酸化。關鍵酶：檸檬酸合成酶異檸檬酸脫氫酶α-酮戊二酸脫氫酶產(chǎn)能計算：1個葡萄糖完全分解生成CO2與H2O時可產(chǎn)生38個ATP。（2）TCA循環(huán)主要產(chǎn)物：C3CH3CO~CoANADH+4HFADHGTP3CO2呼吸鏈呼吸鏈（底物水平）12ATP2ATPATP工業(yè)發(fā)酵產(chǎn)物：檸檬酸、蘋果酸、延胡索酸、琥珀酸和谷氨酸TCA循環(huán)的生理功能：為細胞生理活動提供了大量能量；為細胞生物合成提供多種碳骨架；是糖類、脂肪酸和蛋白質(zhì)代謝的中心樞紐。“回補”問題：由于三羧酸循環(huán)為細胞生物合成提供了中間代謝物，使得三羧酸循環(huán)的中間代謝物“流失”，如果這些中間代謝物得不到補充，勢必影響TCA循環(huán)的正常運轉(zhuǎn)，所以有氧代謝中必須進行回補。厭氧條件下的三羧酸循環(huán)厭氧或兼性厭氧微生物在厭氧時缺乏丙酮酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶，這時有2條路可走：氧化和還原途徑延胡索酸還原酶TCA循環(huán)的樞紐地位發(fā)酵平衡有氧呼吸乙醇發(fā)酵TCA甘油發(fā)酵乳酸發(fā)酵丙酸發(fā)酵丁酸發(fā)酵丙酮丁醇發(fā)酵混合酸發(fā)酵丁二醇發(fā)酵呼吸作用2、電子傳遞鏈指由一系列氫和電子傳遞體組成的多酶氧化還原體系稱為呼吸鏈（電子傳遞鏈）。這些氫和電子傳遞體在線粒體內(nèi)膜中以4個載體復合物的形式按氧化還原電勢升高的順序排列，所以是定向有序的。呼吸鏈中電子或氫的傳遞順序一般為：NADH→FMN→Fe-S→CoQ→Cyt.b→Cyt.c1→

Cyt.c→Cyt.a→Cyt.a3→O2電子傳遞鏈載體：黃素蛋白：FMN或FAD

，氫載體

鐵-硫蛋白：分子量相對較小，電子載體

醌及其衍生物：泛醌（CoQ），甲基萘醌（MK），脫甲基萘醌（DMK），氫載體

細胞色素類蛋白：電子載體

質(zhì)子傳遞方式：氫載體＋2H氫載體-H2

電子載體-Fe+H電子載體-Fe+H

細胞在不斷的排出和吸收質(zhì)子的過程中建立了膜兩側(cè)的質(zhì)子梯度，所以質(zhì)子轉(zhuǎn)移是細胞呼吸過程中產(chǎn)生ATP的化學滲透假說的理論基礎。3+2++原核微生物電子傳遞鏈特點：（1）細菌的呼吸鏈位于細胞膜上；（2）電子供體多樣：HADH、H2、S、Fe2+其他有機質(zhì)等；（3）電子受體多樣：O2、NO3-、SO42-、S2-、CO32-等；

（4）呼吸鏈組分多變；（5）存在分支呼吸鏈：

細菌的電子傳遞鏈更短并P／O比更低，在電子傳遞鏈的幾個位置進入鏈和通過幾個位置的末端氧化酶而離開鏈。

E.coli

CoQCytb558→Cyto→O2

（通氧）

Cytb558→Cytd→O2（缺氧）細胞色素o分支對氧親和性低，在氧供應充足的條件下工作；細胞色素d分支對氧有很高的親和性，因此在氧供應不足的情況下起作用。二、無氧呼吸生物氧化時呼吸鏈末端的最終電子受體為分子氧以外的外源受體。有機物CO2氧化態(tài)NO3-、SO42-、CO32-(還原為NO2-、SO32-、CH4)碳流電子流特點：a.常規(guī)途徑脫下的氫，經(jīng)部分呼吸鏈傳遞；b.氫受體：氧化態(tài)無機物（個別：延胡索酸）c.產(chǎn)能效率低。電子受體的還原電勢比O2低。1、硝酸鹽呼吸（反硝化作用）

（nitraterespiration）無氧條件下，利用NO3-為最終氫受體。同化型硝酸鹽作用（assimilativenitratereduction）

：

NO3-

NO2-NH2OHNH3（氮源）異化型硝酸鹽作用（dissimilativenitratereduction）：

NO3-NO2-NON2ON2

（氧化產(chǎn)能）

只有在無氧條件下，才誘導出硝酸鹽呼吸中的還原酶。兼性厭氧細菌：銅綠假單胞、地衣芽孢桿菌等。亞硝酸還原酶氧化氮還原酶氧化亞氮還原酶硝酸鹽還原酶

2、硫酸鹽呼吸（硫酸鹽還原）（sulfaterespiration）厭氧時，SO42-

、SO32-、S2O32-等為末端電子受體的呼吸過程。特點：

a、厭氧細菌：脫硫脫硫弧菌、巨大脫硫弧菌等

b、最終產(chǎn)物為H2SSO42-SO32-SH2Sc、利用有機質(zhì)（有機酸、脂肪酸、糖醇類）作為氫供體或電子供體；

d、環(huán)境：富含SO42-的厭氧環(huán)境（土壤、海水、污水等）

3、碳酸鹽呼吸（carbonaterespiration）

以CO2、HCO3-

為末端電子受體。厭氧細菌。產(chǎn)甲烷菌：利用H2作電子供體（能源）、CO2為受體，產(chǎn)物CH4。產(chǎn)乙酸細菌：

H2/CO2

進行無氧呼吸，產(chǎn)物為乙酸。

4、延胡索酸呼吸（fumaraterespiration）

延胡索酸→琥珀酸，有電子傳遞鏈；供氫體有H2、甲酸、NADH、乳酸、蘋果酸等。甲酸琥珀酸→Cytb200→MK→Cytb20→CO2延胡索酸細菌：埃希氏桿菌、變形桿菌屬、沙門氏菌屬、產(chǎn)琥珀酸弧菌等、比較項目有氧呼吸無氧呼吸發(fā)酵遞氫體呼吸鏈（電子傳遞鏈）呼吸鏈（電子傳遞鏈）無受氫體O2無機或有機氧化物（NO3-

、SO42-

、CO2延胡索酸）中間代謝物（丙酮酸、乙醛等）終產(chǎn)物H20（

NO2-、SO32-

、CH4琥珀酸）還原后的中間代謝物（乙醇、乳酸等）產(chǎn)能機制氧化磷酸化氧化磷酸化底物水平磷酸化產(chǎn)能效率高中低有氧呼吸、無氧呼吸與發(fā)酵的比較乳酸發(fā)酵呼吸鏈丙酸發(fā)酵原核生物呼吸鏈丁酸發(fā)酵無氧呼吸丙酮丁醇發(fā)酵混合酸發(fā)酵丁二醇發(fā)酵呼吸作用有氧呼吸TCA第五節(jié)能量產(chǎn)生

微生物進行生命活動需要的能量最初來自化學能和光能，這些能量通過轉(zhuǎn)換變成能直接用于微生物生理活動的能量物質(zhì)。提供能量的物質(zhì)有多種，包括ATP、GTP、CTP、UTP、PEP、乙酰CoA和氨甲酰磷酸等，其中最直接最重要的是ATP。

ATP的產(chǎn)生方式：底物水平磷酸化、氧化磷酸化和光合磷酸化。一、底物水平磷酸化(substratelevelphosphorylation)

物質(zhì)在生物氧化過程中,常生成一些含有高能鍵的化合物,而這些化合物可直接偶聯(lián)ATP或GTP的合成。微生物代謝中的底物水平磷酸化高能化合物的底物水平磷酸化反應偶聯(lián)形成的高能分子1,3-二磷酸甘油酸

→3-磷酸甘油酸ATP磷酸烯醇式丙酮酸

→丙酮酸ATP琥珀酰輔酶A→琥珀酸GTP乙酰磷酸

→乙酸ATP丙酰磷酸

→丙酸ATP丁酰磷酸

→丁酸ATP氨甲酰磷酸

→CO2+NH3ATP物質(zhì)在氧化過程中放出的電子通過呼吸鏈傳遞到分子氧或其他氧化型物質(zhì)時偶聯(lián)著ATP合成。期間不產(chǎn)生高能的中間產(chǎn)物，能量的轉(zhuǎn)移是通過質(zhì)子的化學梯度起作用的。二、氧化磷酸化（oxidativephosphorylation）ATPATPATPNAD或NADPFAD或FMN鐵硫蛋白泛醌細胞色素系統(tǒng)氧化磷酸化產(chǎn)能機制

—化學偶聯(lián)假說、構(gòu)象偶聯(lián)假說、化學滲透假說

化學滲透學說---英國生物化學家Peter．Mitchell于1961年提出的。

該假說認為電子傳遞鏈的組成導致質(zhì)子從線粒體的基質(zhì)向外移動，電子向內(nèi)傳遞。質(zhì)子在膜兩側(cè)分布不均衡，即形成了質(zhì)子梯度差，從而將能量蘊藏在質(zhì)子勢（Protonmotiveforce,PMF）中，質(zhì)子勢推動質(zhì)子由膜外進入胞內(nèi)，釋放的能量通過F0-F1ATP酶偶聯(lián)ATP的形成。

氧化磷酸化（oxidativephosphorylation）氧化磷酸化的解偶聯(lián)和抑制①電子傳遞抑制劑：能阻斷呼吸鏈上電子的正常傳遞的化合物稱為抑制劑，如抗霉素A、阿米妥、CN-、CO等。②解偶劑：允許電子傳遞，阻斷ADP→ATP，即使產(chǎn)能過程和貯能過程相互脫離，并能促進ATP的水解，如2，4-二硝基苯酚（DNP）。③磷酸化抑制劑：不直接抑制呼吸鏈的任何載體，但能阻止能量轉(zhuǎn)移到ADP上，即直接干擾ATP的生成過程。如寡霉素既抑制氧的利用又抑制ATP的形成。注：解偶聯(lián)劑能刺激線粒體對氧的需要，增加電子傳遞的速度，而寡霉素對氧耗有抑制作用。氧化磷酸化的解偶聯(lián)和抑制④離子載體：把能量用于陽離子泵入基質(zhì)內(nèi)，不能制造ATP，如纈氨霉素。三、光合磷酸化第六節(jié)生物大分子的降解自然界中廣泛存在的大分子物質(zhì)淀粉、纖維素、果膠等需要分解成小分子物質(zhì)才能被微生物吸收利用，一般通過酶處理。一、多糖和二糖的分解1、淀粉（starch）的分解直鏈：α-1,4糖苷鍵支鏈：α-1,6糖苷鍵，α-1,4糖苷鍵淀粉淀粉酶作用示意圖Ο表示葡萄糖殘基，?表示帶有還原基的葡萄糖殘基α-1,4糖苷鍵

α-1,6糖苷鍵

2、纖維素（cellulose）和半纖維素（hemicellulose）的分解纖維素基本結(jié)構(gòu)是纖維二糖，β-1,4糖苷鍵，分子量比淀粉更大。天然的纖維素不溶于水，直鏈式存在。纖維素酶主要由真菌產(chǎn)生。半纖維素：各種聚戊糖和聚己糖，常見的有木聚糖、阿拉伯聚糖和半乳聚糖等。半纖維素較易被微生物分解。3、果膠（pectin）的分解

果膠是植物細胞壁間質(zhì)的主要成分，是甲基半乳糖醛酸的聚合體。不被甲基化的聚合體是果膠酸。由半乳糖醛酸以α-1，4糖苷鍵形成的直鏈狀高分子化合物，天然的果膠是水不溶性的，稱為原果膠。不溶性果膠→可溶性果膠→果膠酸→半乳糖醛酸。原果膠酶果膠甲酯水解酶果膠聚半乳糖醛酸酶4、幾丁質(zhì)（殼聚糖）的分解幾丁質(zhì)是由N-乙酰氨基葡萄糖通過β-1，4糖苷鍵聚合成的、不容易分解的含氮多糖類物質(zhì)，是昆蟲體壁和許多真菌細胞壁的組成成分。多數(shù)微生物分解幾丁質(zhì)的能力都不強。5、二糖的分解有兩種分解方式：一是被相應的二糖水解酶水解成單糖，另一種是被相應的磷酸化酶作用，使二糖經(jīng)磷酸化裂解。磷酸化酶催化的反應比水解酶催化的反應更有利?；旌纤岚l(fā)酵呼吸作用有氧呼吸TCA循環(huán)呼吸鏈細菌呼吸鏈無氧呼吸底物水平磷酸化氧化磷酸化淀粉分解纖維素分解二糖分解其他單糖分解蔗糖＋H2O葡萄糖＋果糖蔗糖水解酶蔗糖磷酸化酶麥芽糖水解酶β-半乳糖苷酶纖維二糖磷酸化酶蔗糖＋H3PO4

葡萄糖-1-磷酸＋果糖麥芽糖＋H2O2葡萄糖麥芽糖磷酸化酶麥芽糖＋H3PO4

葡萄糖-1-磷酸＋葡萄糖乳糖＋H2O葡萄糖＋半乳糖纖維二糖＋H3PO4

葡萄糖-1-磷酸＋葡萄糖第七節(jié)其他單糖物質(zhì)的分解一、果糖的分解大腸桿菌中果糖和葡萄糖分解的初始反應GlcG-6-PF-6-PF-1,6-2P半乳糖甘露糖果糖二、甘露糖的分解①甘露糖6-磷酸甘露糖6-磷酸果糖→EMP②產(chǎn)氣桿菌沒有激酶，通過偶聯(lián)反應磷酸化。產(chǎn)氣桿菌分解甘露糖的途徑甘露糖激酶異構(gòu)酶三、半乳糖的分解E1：半乳糖激酶；E2：葡萄糖－半乳糖磷酸尿苷轉(zhuǎn)移酶；E3：UDP－半乳糖差向異構(gòu)酶

嗜糖假單胞菌利用乳糖與一般的不同，進入與ED途徑類似的途徑，最終產(chǎn)物與ED途徑相同。四、戊糖的分解糖在分解時均先轉(zhuǎn)化成磷酸糖后再降解，說明磷酸化的糖在在分解時起重要作用?；旌纤岚l(fā)酵呼吸作用有氧呼吸TCA循環(huán)呼吸鏈細菌呼吸鏈無氧呼吸底物水平磷酸化氧化磷酸化淀粉分解纖維素分解二糖分解其他單糖分解第八節(jié)其他化合物的生物氧化

除了糖類物質(zhì)能作為微生物生長的碳源和能源物質(zhì)以外，還有許多其他物質(zhì)在一定條件下也能被某些微生物分解利用，例如脂類、烴類、氨基酸和核苷酸等，還有一些內(nèi)源性物質(zhì)都可被不同的微生物分解利用。一、含氮化合物的分解

含氮化合物主要指蛋白質(zhì)、核酸及其分解產(chǎn)物氨基酸、堿基等，主要作為氮源，一般不作為碳源和能源。1、氨基酸的分解三種方式：脫羧、脫氨和轉(zhuǎn)氨（1）脫羧作用氨基酸→胺→氨+醛→酸脫羧酶的特點①脫羧酶的專一性強，一般是一種氨基酸一種脫羧酶，而且只對L-氨基酸起作用。②大多是誘導酶，谷氨酸脫羧酶除外。③氨基酸脫羧酶的輔酶是磷酸吡哆醛，除組氨酸脫羧酶以外（不需要輔酶）。④反應不可逆，因此脫羧反應在氨基酸生物合成上是不重要的。利用脫羧酶的專一性，可測定不同的氨基酸含量：用瓦氏呼吸儀測出CO2的量，進一步計算氨基酸的含量。脫羧酶（2）脫氨作用氨基酸分解的重要方式：氨基酸失去氨基生成相應的α-酮酸（RCOCOOH）與氨。脫氨氧化脫氨

非氧化脫氨

氧化酶：FMN、FAD,專一性不高,不產(chǎn)生ATP脫氫酶：NAD、NADH，產(chǎn)生ATP

還原脫氨：加氫脫氨，氫化酶，厭氧條件水解脫氨：吲哚實驗和硫化氫實驗直接分解脫氨斯提克蘭反應：偶聯(lián)脫氨，專性厭氧菌

兩種谷氨酸脫氫酶斯提克蘭反應（Sticklandreaction）：一種氨基酸作為供氫體進行氧化脫氨，另一種氨基酸作為受氫體進行還原