血清堿性磷酸酶的活性測定

血清堿性磷酸酶活力的測定磷酸苯二鈉法

生化試驗(yàn)第三組實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.熟悉酶活力測定方法的一般原理2.掌握血清堿性磷酸酶(ALP)的測定原理與臨床意義。3.酶活力測定的目的是了解組織提取液、體液中酶的存在于含量。實(shí)驗(yàn)原理一.基本概念1.酶活力測定酶的催化功能可以用在一定條件下酶所催化的某一特定化學(xué)反應(yīng)的速度來表示。反應(yīng)速度越快，酶活力越高;反之，活力越低。測定酶活力實(shí)際上是測定酶促反應(yīng)速率。2.酶的活力單位a.國際在特定的條件下，1min內(nèi)將1μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量為1個國際單位(IU)。1IU=16.67×10-9Katalb.臨床上采用金氏（Kings）的定義：每100ml血清在37℃與底物作用15min，產(chǎn)生苯酚1mg的酶量為1個金氏單位。c.Kat單位在特定條件下，每秒鐘轉(zhuǎn)化1mol底物的酶量。1Kat=6×107IU實(shí)驗(yàn)原理二.測定方法1.終止測定法（定時法或終點(diǎn)法）是當(dāng)酶促反應(yīng)進(jìn)行到一定時間點(diǎn)，通過物理或化學(xué)方法(強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、蛋白沉淀劑）終止反應(yīng)。動力學(xué)分析法（連續(xù)監(jiān)測法或速率法）在酶促反應(yīng)過程中，用儀器連續(xù)監(jiān)測酶促反應(yīng)產(chǎn)物或底物的變化量，通過計(jì)算求出酶的活性。實(shí)驗(yàn)原理測定ALP活力分兩種1.測定底物解離下的磷酸根來計(jì)算。如β-甘油磷酸鈉法，但存在血清本身有磷酸根的缺點(diǎn)。2.測定底物解離后的羥基化合物A.在顯色劑的作用下顯色比色測定（本次）B.生成的酚化合物本身在一定條件下就可以顯色（對硝基苯磷酸二鈉法）實(shí)驗(yàn)原理三.核心原理ALP催化磷酸苯二鈉轉(zhuǎn)變成苯酚的速率可用分光光度計(jì)監(jiān)測，從而計(jì)算ALP活力的大小磷酸苯二鈉+H2O----------苯酚+磷酸氫二鈉苯酚+4-氨基安替比林--鐵氰化鉀---紅色醌亞胺衍生物ALPPH10試劑碳酸鹽緩沖液（0.1mol/LPH10.0)無水碳酸鈉6.36g、碳酸氫鈉3.36g、4-氨基安替比林1.5g溶于800ml蒸餾水中，定容至1L。棕色瓶貯存。磷酸苯二鈉底物液（20mmol/L)先將500ml蒸餾水煮沸，迅速加入磷酸苯二鈉2.18g，冷卻后加氯仿2ml，4℃冰箱保存。顯色液鐵氰化鉀K3[Fe(CN)6]2.5g、硼酸17g，各溶于400ml蒸餾水，混合后加蒸餾水至1L，棕色瓶避光保存。酚標(biāo)準(zhǔn)工作液0.05mg/ml實(shí)驗(yàn)操作試劑/ml測定管（T）標(biāo)準(zhǔn)管（S)空白管（B）對照管（C）血液0.100---------酚標(biāo)準(zhǔn)液---0.100------蒸餾水------0.100---PH10碳酸鹽緩沖液1.001.001.001.00混勻，37℃水浴保溫5min，同時將底物液預(yù)熱底物液1.001.001.001.00混勻，37℃水浴保溫15min鐵氰化鉀溶液3.003.003.003.00血清---------0.100立即混勻，在510nm波長處比色，以蒸餾水調(diào)零點(diǎn)，讀取各管吸光度計(jì)算公式

注意事項(xiàng)1.鐵氰化鉀應(yīng)避光保存，如出現(xiàn)藍(lán)綠色即作廢。鐵氰化鉀的水溶液受到光線的作用，就會分解成黃血鹽鉀K4[Fe(CN)6]2.底物液中不應(yīng)含有酚，如含有酚時空白管顯紅色，說明磷酸苯二鈉開始分解，不宜繼續(xù)使用3.加入鐵氰化鉀后必須迅速混勻，否則顯色不充分臨床意義1.生理性增加：如兒童、妊娠期、進(jìn)食高糖高脂肪食物等使ALP活性升高2.病理性改變A.升高：肝膽疾?。ㄖ饕娪谧枞渣S疸，急或慢性黃疸型肝炎，肝硬化，肝癌）