高二生物月季的花藥培養(yǎng)

月季的花藥培養(yǎng)生殖細(xì)胞和體細(xì)胞一樣，在離體條件下也具有發(fā)育成完整植株的潛能，取植物的花藥離體培養(yǎng)可獲得單倍體植株，這樣的植株本身在生產(chǎn)上沒有應(yīng)用價值，但在育種工作中卻有重要的意義，這種育種方法就叫單倍體育種。它是先通過花藥離體培養(yǎng)獲得單倍體植株，再經(jīng)過人工誘導(dǎo)(如秋水仙素處理)使染色體數(shù)加倍，從而獲得能穩(wěn)定遺傳的具有優(yōu)良性狀的純合子，大大縮短了育種的年限。課題背景花的結(jié)構(gòu)：花梗、花托、萼片、花瓣、雌蕊和雄蕊被子植物花的結(jié)構(gòu)：花粉是小孢子母細(xì)胞經(jīng)過減數(shù)分裂而形成的，因此，花粉是單倍體的生殖細(xì)胞（一）被子植物的花粉發(fā)育②花粉粒的形成①經(jīng)歷時期：四分體時期、單核期、雙核期四分體時期（進(jìn)入單核期）有絲分裂單核靠邊期(小孢子)單核居中期(小孢子)

小孢子（單核花粉粒）花粉母細(xì)胞（小孢子母細(xì)胞）減數(shù)分裂精子精子有絲分裂花粉管細(xì)胞核生殖細(xì)胞核生殖細(xì)胞營養(yǎng)細(xì)胞雙核期兩個精子和一個營養(yǎng)核的基因型相同1花粉母細(xì)胞4個小孢子減分有分4個花粉管細(xì)胞核4個生殖細(xì)胞核有分8個精子③花粉粒類型二核花粉粒:成熟的花粉粒中，只含花粉管細(xì)胞核和生殖細(xì)胞核。（精子在花粉管中形成）三核花粉粒:有些植物的花粉，在成熟前，生殖細(xì)胞進(jìn)行一次有絲分裂，形成兩個精子，這樣的花粉在成熟時，含有一個營養(yǎng)核和兩個精子。（二）產(chǎn)生花粉植株的兩條途徑不同植物的誘導(dǎo)成功率很不相同，就同一種植物來說親本的生理狀況對誘導(dǎo)成功率也有直接影響②選擇合適的花粉發(fā)育時期是提高誘導(dǎo)成功率的重要因素因為并不是任何時期的花粉都可以經(jīng)過培養(yǎng)產(chǎn)生愈傷組織或胚狀體，花粉發(fā)育的過程中，只有某一個時期對離體刺激敏感。花期早期時的花藥比晚期的更容易產(chǎn)生花粉植株。①選材（三）影響花藥培養(yǎng)的因素一般來說，在單核期，細(xì)胞核由中央移向細(xì)胞一側(cè)的時期，花藥培養(yǎng)的成功率最高。即：最適合花藥培養(yǎng)的小孢子發(fā)育時期為單核靠邊期選擇單核期以前的花藥接種，質(zhì)地幼嫩，極易破碎；選擇單核期之后的花藥接種，花瓣已有些松動，又給材料的消毒帶來困難，且難以挑選到單核期的花藥。③花藥培養(yǎng)時期的選擇④其它時期選擇的缺點⑦花藥培養(yǎng)時間為了挑選到單核期的花藥，通常選擇完全未開放的花蕾。盛開的或略微開放的花，都不宜選作實驗材料。⑥選擇完全未開放花蕾的原因完全未開放的花蕾，可挑選到單核期的花藥，菌少、易消毒⑤單核期花藥的挑選一般月季的花藥培養(yǎng)時間選在五月初到五月的中旬，即月季的初花期。初花期的花蕾營養(yǎng)狀態(tài)及生理狀態(tài)會比較好，可能提高花粉的誘導(dǎo)成功率月季花藥培養(yǎng)時的花粉粒最好是（）

A、四分體時期B、單核居中期

C、單核靠邊期D、二核或三核花粉粒C2、培養(yǎng)基：花藥培養(yǎng)基所采用的培養(yǎng)基可能因植物的不同而有所變化小麥中為N6，馬鈴薯、月季中為MS，油菜中為B5培養(yǎng)基3、其他因素親本植株的生長條件、材料的低溫預(yù)處理以及接種的密度等對誘導(dǎo)成功都有一定的影響六、實驗操作（一）材料的選?、谀承┲参锏幕ǚ奂?xì)胞核不易著色，需采用焙花青-鉻礬法，這種方法能將花粉細(xì)胞核染成藍(lán)黑色。①最常用的方法有醋酸洋紅法1、方法①醋酸洋紅法染色機(jī)理醋酸洋紅為堿性染色劑，而花粉細(xì)胞內(nèi)有染色體，染色體主要成分是DNA和蛋白質(zhì),易被堿性染料著色染成紅色

。將體積分?jǐn)?shù)45％的醋酸100ml煮沸，緩緩加入1g洋紅，在加熱回流8h，冷卻至50℃，過濾即可。②醋酸洋紅的配置2、醋酸洋紅法將花藥放在載玻片上，加一滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)1％的醋酸洋紅，用鑷柄將花藥搗碎，蓋上蓋玻片在顯微鏡下檢查。③染色操作3、焙花青—鉻釩法將無水酒精與冰醋酸按體積比為3：1的比例混勻①卡諾氏固定液的配制方法花藥應(yīng)該在卡諾氏固定液中固定20min，然后取出放在載玻片上，加焙花青—鉻釩溶液染色，蓋上蓋玻片后在顯微鏡下檢查。將5g鉻明礬[K2SO4Cr2(SO4)·24H2O]加入90ml蒸餾水中，溶解后加入0.1g焙花青，混勻并加熱至沸騰，煮沸5分鐘后冷卻至室溫，過濾，加蒸餾水定容至100ml。②焙花青—鉻釩溶液的配制方法③染色操作（二）材料的消毒1、酒精處理①花蕾用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精浸泡30秒，立即取出。②無菌水清洗③無菌吸水紙吸干花蕾表面的水分2、消毒液處理（三）接種和培養(yǎng)①放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的氯化汞溶液中2~4分鐘（也可質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的次氯酸鈣溶液或飽和漂白粉溶液）②無菌水沖洗3~5次用于培養(yǎng)的花藥，實際上多數(shù)未熟，由于它的外面有花萼、花瓣或穎片保護(hù)，通常處于無菌狀態(tài)，所以只要將整個花蕾或幼穗消毒即可。在無菌條件下除去萼片和花瓣用鑷子取出花藥②要徹底去除花絲，因為與花絲相連的花藥不利于愈傷組織或胚狀體的形成立即將花藥接種于培養(yǎng)基上，通常每瓶接種花藥7-10個。1、剝?nèi)』ㄋ帰傥饟p傷花藥，以免誘導(dǎo)出非花粉愈傷組織2、接種注意：①培養(yǎng)條件：溫度控制在25℃左右，不需要光照。幼小植株形成后才需要光照。

3、培養(yǎng)②培養(yǎng)：一般經(jīng)過20-30天培養(yǎng)后，會發(fā)現(xiàn)花藥開裂，長出愈傷組織或釋放出胚狀體長出愈傷組織則將愈傷組織及時轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，以便進(jìn)一步分化出再生植株③注意：如果花藥開裂釋放出胚狀體，則一個花藥內(nèi)就會產(chǎn)生大量幼小植株，必須在花藥開裂后盡快將幼小植株分開，分別移植到新的培養(yǎng)基上，否則這些植株將很難分開。在花藥培養(yǎng)中，特別是通過愈傷組織形成的花粉植株，常常會出現(xiàn)染色體倍性的變化（主要原因是營養(yǎng)核和生殖核融合造成的），因此還需要對培養(yǎng)出來的植株作進(jìn)一步的鑒定和篩選。4、鑒定和篩選F1花粉單倍體

幼苗純合

植