細(xì)胞生物學(xué)：第二章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法

第二章細(xì)胞生物學(xué)研究方法PreparatoryobserveputforwardtheoriesDesigncontroltestsCollectdataExplainresultsDeviseconclusion

Refertoknowledge

第一節(jié)顯微成像技術(shù)第二節(jié)細(xì)胞工程技術(shù)第三節(jié)細(xì)胞組分的分離技術(shù)第四節(jié)細(xì)胞組分的分析方法內(nèi)容提要第一節(jié)顯微成像技術(shù)

一、光學(xué)顯微鏡二、電子顯微鏡顯微成像技術(shù)

顯微成像技術(shù)

一、光學(xué)顯微鏡分辨率/力(resolution)

是指能夠區(qū)別開的兩個質(zhì)點(diǎn)的最小距離。分辨力的最終限度是決定于光的波長。對任何顯微鏡而言，最重要的是分辨力，而不是放大倍數(shù)。顯微成像技術(shù)分辨率(resolution，R)：R=0.61λ/(nsinα/2)R=0.61x0.5/1.5=0.2μmn介質(zhì)折射率空氣：1

油：1.5顯微成像技術(shù)μm(micrometer)=10-6mnm(nanometer)=10-9m?(?ngstr?munit)=10-10m顯微成像技術(shù)a.普通光學(xué)顯微鏡顯微成像技術(shù)顯微成像技術(shù)取材－固定－脫水－包埋－切片－脫蠟－復(fù)水－染色－脫水－透明－封片－觀察顯微成像技術(shù)b.熒光顯微鏡顯微成像技術(shù)Fluorescentdyes顯微成像技術(shù)FruitflyembryoCellnucleus顯微成像技術(shù)c.激光共聚焦掃描顯微鏡顯微成像技術(shù)Comparisonofconventionalandconfocalfluorescencemicroscopy.Thesetwomicrographsareofthesameintactgastrula-stageDrosophilaembryothathasbeenstainedwithafluorescentprobeforactinfilaments.顯微成像技術(shù)Beclin1RTN3Merged.相差顯微鏡Twowaystoobtaincontrastinlightmicroscopy顯微成像技術(shù)密度Fourtypesoflightmicroscopy.(A)Theimageofafibroblastincultureobtainedbycommonlightmicroscopy(B)phase-contrastmicroscopy(相差),(C)differential-interference-contrastmicroscopy（微分干涉）,(D)dark-fieldmicroscopy.顯微成像技術(shù)e.Electronicimageprocessing顯微成像技術(shù)Limitofresolutionoftheelectronmicroscope.Electronmicrographofathinlayerofgoldshowingtheindividualfilesofatomsinthecrystalasbrightspots.Thedistancebetweenadjacentfilesofgoldatomsisabout0.2nm(2?).二、電子顯微鏡顯微成像技術(shù)顯微成像技術(shù)光鏡與電鏡的基本區(qū)別類型分辨力光源透鏡真空光鏡200nm可見光

波長300-700nm玻璃透鏡不要求100nm紫外光

波長200nm玻璃透鏡電鏡0.1nm電子束波長0.01-0.9nm電磁透鏡要求顯微成像技術(shù)電鏡技術(shù)的基本特點(diǎn)1）電子束照明系統(tǒng)，包括電子槍、聚光鏡。電子束比可見光的波長短得多，提高了分辨力。2）電磁透鏡成像系統(tǒng)聚焦成像。3）真空系統(tǒng)：電子運(yùn)行中如遇到氣體分子將會被散射，所以電鏡鏡筒中要求高真空。4）記錄系統(tǒng)：電子像是人眼看不到的，因此要用熒光屏來顯示或感光膠片作記錄。顯微成像技術(shù)顯微成像技術(shù)電鏡種類1.透射電子顯微鏡2.掃描電子顯微鏡顯微成像技術(shù)Electronmicrographofaroot-tipcellstainedwithosmiumandotherheavymetalions.顯微成像技術(shù)Immunogoldelectronmicroscopy.顯微成像技術(shù)1.超薄切片（40～50nm）。2.固定→包埋→切片→染色等過程要求高。3.重金屬鹽染色或噴鍍，以形成不同程度的

反差，提高分辨力。4.負(fù)染技術(shù)5.冰凍斷裂和冰凍蝕刻技術(shù)電鏡技術(shù)的基本要求：顯微成像技術(shù)SpecimenPreparationforElectronMicroscopy顯微成像技術(shù)Chemicalfixation顯微成像技術(shù)

Diagramofthecoppergridusedtosupportthethinsectionsofaspecimeninthetransmissionelectronmicroscope.顯微成像技術(shù)ElectronmicrographsofindividualmyosinproteinmoleculesMetalShadowingAllowsSurfaceFeaturestoBeExamined顯微成像技術(shù)Electronmicrographofnegativelystainedactinfilaments.顯微成像技術(shù)Freeze-fractureelectronmicrographofthethylakoidmembranesfromthechloroplastofaplantcell.Freeze-FractureandFreeze-EtchElectronMicroscopy顯微成像技術(shù)顯微成像技術(shù)Regulararrayofproteinfilamentsinaninsectmuscle.顯微成像技術(shù)Scanningelectronmicroscope(SEM)ImagesofsurfacescanbeobtainedbySEM;Critical-pointdrying;Range:15－150,000X.Resolution:5nm顯微成像技術(shù)Scanningelectronmicrographofthestereociliaprojectingfromahaircellintheinnerearofabullfrog(A).Thesamestructureisshownbydifferential-interference-contrastlightmicroscopy(B)andbythin-sectionelectronmicroscopy(C).顯微成像技術(shù)內(nèi)耳毛細(xì)胞掃描電鏡圖片J.CellBiol.,2010顯微成像技術(shù)第二節(jié)

細(xì)胞工程技術(shù)一、細(xì)胞培養(yǎng)二、細(xì)胞融合三、顯微操作細(xì)胞工程技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)（cellculture）概念是指從活體中取出的細(xì)胞或其他建系細(xì)胞，在體外給予一定的條件進(jìn)行培養(yǎng)，使其能繼續(xù)生存、生長和繁殖的一種方法。細(xì)胞工程技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)的用途1）直接觀察活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生命活動的過程。

2）直接施加物理、化學(xué)和生物因子，觀察對細(xì)胞影響。

3）可將不同種類的細(xì)胞混合培養(yǎng)，研究細(xì)胞間的相互作用。

4）配合其他的實驗技術(shù)可作大量的研究工作，如細(xì)胞周期與調(diào)控、細(xì)胞衰老等。

5）為植物育種開辟新途徑，為疫苗生產(chǎn)、藥物研制提供新手段。細(xì)胞工程技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)的條件1）溫度

2）pH值

3）營養(yǎng)物質(zhì)

4）無菌條件細(xì)胞工程技術(shù)A.動物細(xì)胞培養(yǎng)B.植物細(xì)胞培養(yǎng)C.非細(xì)胞體系D.細(xì)菌的培養(yǎng)E.病毒的培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的種類細(xì)胞工程技術(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)

1）能顯示來源組織的分化特征。例如：成纖維細(xì)胞仍能分泌膠原;神經(jīng)細(xì)胞伸展

出具有電興奮作用的軸突。

2）可從組織的不同類型的細(xì)胞混合群體中

純化某種類型的細(xì)胞，便于單因素的分

析。

3）取材容易，使用方便。細(xì)胞工程技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)的方法1）貼附型：能在玻璃或塑料瓶壁上平展

生長，形成單層細(xì)胞層。如上皮型細(xì)胞、成纖維型細(xì)胞等。2）懸浮型：不貼附于支持物上，懸浮生

長，胞體呈球形。如淋巴細(xì)胞等。細(xì)胞工程技術(shù)原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)（primaryculture）1）概念

直接取材于有機(jī)體組織的細(xì)胞培養(yǎng)。2）步驟

取材→剪碎→胰酶消化將細(xì)胞分散→置合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)，一般數(shù)小時即可貼壁生長、增殖，直到相互接觸鋪滿瓶壁，形成單層細(xì)胞。第一代細(xì)胞稱為原代細(xì)胞。細(xì)胞工程技術(shù)傳代培養(yǎng)（secondaryculture）：將原代培養(yǎng)的細(xì)胞取出，轉(zhuǎn)移到另一盛有新鮮培養(yǎng)液的器皿中進(jìn)行培養(yǎng)的過程稱傳代培養(yǎng)。用這種方法可重復(fù)傳代。

細(xì)胞工程技術(shù)細(xì)胞系(cellline)概念培養(yǎng)的細(xì)胞中產(chǎn)生了具有無限繁殖能力的變異細(xì)胞，這種細(xì)胞可被無限地傳代，稱為細(xì)胞系細(xì)胞工程技術(shù)常用細(xì)胞系：細(xì)胞系

細(xì)胞類型來源

3T3成纖維細(xì)胞小鼠

BHK-21成纖維細(xì)胞倉鼠

Hela上皮細(xì)胞人宮頸癌

PTK1上皮細(xì)胞袋鼠

L6成肌細(xì)胞大鼠

SP2漿細(xì)胞小鼠細(xì)胞工程技術(shù)植物細(xì)胞培養(yǎng)A單倍體培養(yǎng)B原生質(zhì)培養(yǎng)細(xì)胞工程技術(shù)Preparationofhybridomasthatsecretemonoclonalantibodiesagainstaparticularantigen(X).MonoclonalAntibodies細(xì)胞工程技術(shù)Thetechniqueforthetakeapartandgatherupofcell,andmicroscopemanipulation

Transgenicmice10weeks44gand29g細(xì)胞工程技術(shù)Methodstointroduceamembrane-impermeantsubstanceintoacell.細(xì)胞工程技術(shù)GeneKnockoutmiceMarioCapecchi(Late1980s)(UniversityofUtah)embryonicstemcellsininnercellmassastargetcells1/104cellsundergoaprocessofhomologousrecombination.細(xì)胞工程技術(shù)細(xì)胞組分分離技術(shù)第三節(jié)細(xì)胞組分分離技術(shù)一、差速離心二、密度梯度離心Step-by-stepprocedureforthepurificationoforganellesbydifferentialcentrifugation.1.差速離心（differentialcentrifugation）細(xì)胞組分分離技術(shù)細(xì)胞組分分離技術(shù)

差速離心

在密度均一的介質(zhì)中，不同大小的顆粒沉降速度不同，大顆粒沉降快，先到管底，逐步加大離心力，延長離心時間，可分離細(xì)胞的不同組分。細(xì)胞組分分離技術(shù)組織勻漿沉淀小塊含整個細(xì)胞核和細(xì)胞骨架低速離心1000g10min細(xì)胞組分分離技術(shù)將上清中速離心20000g20min沉淀小塊含線粒體、溶酶體、過氧化物酶體細(xì)胞組分分離技術(shù)沉淀小塊含微粒體小泡將上清高速離心80000g1小時細(xì)胞組分分離技術(shù)沉淀小塊含核糖體、病毒、大分子將上清超高速離心150000g3小時細(xì)胞組分分離技術(shù)2.密度梯度離心(densitygradientcentrifugation)

在離心管中制備由上到下逐漸增加密度的蔗糖溶液（5%—20%），形成密度梯度，細(xì)胞勻漿放最上面，這樣不同組分以不同速率沉降，形成不同的沉降帶，分別收集，進(jìn)行分析。細(xì)胞組分分離技術(shù)密度梯度離心細(xì)胞組分分離技術(shù)

Theseparationofsmallmoleculesbypaperchromatography.3.Paperchromatography細(xì)胞組分分離技術(shù)Theseparationofmoleculesbycolumnchromatography.4.Columnchromatography細(xì)胞組分分離技術(shù)細(xì)胞組分分離技術(shù)5.chromatography細(xì)胞組分分離技術(shù)第四節(jié)細(xì)胞組分的分析方法一、組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)法二、免疫化學(xué)法三、分子細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)細(xì)胞組分的分析方法1.金屬沉淀法2.福爾根(Feulgen)反應(yīng)3.聯(lián)苯胺反應(yīng)4.脂溶染色法5.茚三酮反應(yīng)一、組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)法細(xì)胞組分的分析方法二、免疫化學(xué)法細(xì)胞組分的分析方法蛋白印跡法(westernblot)細(xì)胞組分的分析方法SDSpolyacrylamide-gelelectrophoresis細(xì)胞組分的分析方法SDSpolyacrylamide-gelelectrophoresis(SDS)細(xì)胞組分的分析方法（一）DNA序列分析（二）核酸分子雜交技術(shù)

Northernblot，Southernblot（三）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR)（四）放射自顯影術(shù)三、分子細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)

細(xì)胞組分的分析方法雙氧鏈末端終止法測序原理示意圖細(xì)胞組分的分析方法細(xì)胞組分的分析方法細(xì)胞組分的分析方法PCR反應(yīng)過程示意圖細(xì)胞組分的分析方法InsituhybridizationforRNAlocalizationintissues.TracingandAssayingMoleculesInsideCells細(xì)胞組分的分析方法Theresultsofapulse-chaseexperimentinwhichpancreaticbetacellswerefed3H-leucinefor5minutesfollowedbyexcessunlabeledleucine(thechase).細(xì)胞組分的分析方法VisualizingintracellularCa2+concentrationsusingafluorescentindicator.

細(xì)胞組分的分析方法Fluorescentanaloguecytochemistry.Fluorescencemicrographoftheleadingedgeofalivingfibroblastthathasbeeninjectedwithrhodamine-labeledtubulin.