治療基因向腦內(nèi)遞送

關(guān)于治療基因向腦內(nèi)遞送第一頁，共72頁幻燈片2掌握要點(diǎn)1.血腦屏障的功能2.物質(zhì)透過血腦屏障的途徑第二頁，共72頁幻燈片3第一節(jié)血腦屏障及血腦腫瘤屏障一、阻止藥物進(jìn)入腦腫瘤內(nèi)的屏障

（一）腦屏障腦屏障是在生理情況下,存在于腦和脊髓內(nèi)的毛細(xì)血管與神經(jīng)組織之間的一個(gè)調(diào)節(jié)界面。它能選擇性地調(diào)節(jié)進(jìn)入神經(jīng)組織的物質(zhì),從而使神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞保持恒定的內(nèi)、外環(huán)境，保證正常的生理活動(dòng)。腦屏障包括：

血腦屏障

血腦脊液屏障

腦脊液-腦屏障第三頁，共72頁幻燈片4BloodSupplyoftheBrainArterialsupplyofthebrainisderivedfrom2pairsofvessels:

InternalCarotidArteries

andthe

VertebralArteries.第四頁，共72頁幻燈片5第五頁，共72頁幻燈片61.血-腦屏障血腦屏障（bloodbrainbarrier,BBB） 由腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、基膜和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的終足三層隔膜共同構(gòu)成。

第六頁，共72頁幻燈片7腦毛細(xì)血管：

總長：約600km

表面積：約20m2

每cm3腦組織：1km長每個(gè)神經(jīng)元都有自己的供給人腦血管鑄型圖第七頁，共72頁幻燈片8血腦屏障第八頁，共72頁幻燈片9TheBlood-BrainBarrierBodycapillaries:Loosejunctionbetweenendothelialcells.Permeabletomanysubstances.Braincapillaries:Tightjunctionbetweenendothelialcells.CoveredbyastrocytefeetImpermeabletomanysubstances.第九頁，共72頁幻燈片10第十頁，共72頁幻燈片11內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接(tightjunction,TJ)TJ是中樞神經(jīng)系統(tǒng)毛細(xì)血管特有的解剖學(xué)特征，也是BBB的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。TJ的存在極大的限制了BBB的細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)途徑。第十一頁，共72頁幻燈片12緊密連接第十二頁，共72頁幻燈片13Proteincomponents:ClaudinOccludinJunctionAdhesionMoleculesAccessoryproteins：ZO-1,2,3cingulin,etc第十三頁，共72頁幻燈片14TheTJconsistsofthreeintegralmembraneproteins:Claudin,OccludinandJunctionadhesionmolecules.Cytoplasmicaccessoryproteins:ZO-1(zonulaoccludens),ZO-2,ZO-3,cingulin,andothers.Theprimarycytoskeletalprotein,actin,hasknownbindingsitesonalloftheZOproteins,andonclaudinandoccludin.第十四頁，共72頁幻燈片15Claudins:makeupthebackboneofTightJunctionstrandsbyformingdimersandbindinghomotypicallytoclaudinsonadjacentcellstoproducetheprimarysealofthetightjunction.Occludin:functionsasadynamicregulatoryprotein,whosepresenceinthemembraneiscorrelatedwithincreasedelectricalresistanceacrossthemembraneanddecreasedparacellularpermeability.Zonulaoccludensproteins(ZO1,ZO2andZO3):belongtoafamilyofproteinsknownasMAGUKs(membraneassociatedguanylatekinase-likeproteins),whichserveasrecognitionproteinsforTightJunctionplacementandasasupportstructureforsignaltransductionproteins.

第十五頁，共72頁幻燈片16Cingulin:isadouble-strandedmyosin-likeproteinthatserveasascaffoldingproteinthatlinksTightJunctionaccessoryproteinstothecytoskeleton.Actin:AdensebandofactinandmyosinfilamentscircumscribethecellwithactinfilamentsthatextendintotheTightJunctions.ZO1bindstoactinfilamentsandtheCterminusofoccludin,whichcouplesactintotheparacellularbarrier.Severalstudiessuggestthattightjunctionalintegrityisdependentonstructuralorganizationofactin.第十六頁，共72頁幻燈片RegulationofTightJunctionsFactorswhichincreasepermeability(ExtracellularFactors):Membranepermeabilityincreasesafterexposureto:Cytokines:TNFα,IL-1βandIFN-γGrowthfactors:VEGF,FGF2NitricOxide,ATP,histamine,bradykinin,5-HT,Endothelin-1,thrombin,substanceP,plateletactivatingfactorandfreeradicalsAminoacids:glutamate,AspartateHypoxicinsultsleadingtoATPdepletion,suchaswouldoccurwithanischemicstrokeLeukocytemigrationintobrainhasbeenshowntotriggersignaltransductioncascadesleadingtolossofTightJunctionmoleculesincludingoccludinandzonulaoccludensandBBBbreakdown.第十七頁，共72頁幻燈片IntracellularsignalingFactorswhichincreasepermeabilityZOandoccludinmoleculesareprimaryregulatoryproteinsoftightJunctionsthatmodulatesBBBpermeability.OccludinandZO1arephosphorylatedonSerine,ThreonineandTyrosineresidues.Tyrosinephosphorylationcorrelateswithdecreasedoccludinexpression,andincreasedpermeability.IntracellularcGMPActivationoftheRhofamilyofsmallGTPbindingproteinstriggersreorganizationofperijunctionalactin,whichleadstoincreasedparacellulardiffusion.ATPdepletionleadstomarkedreorganizationofthecytoskeletonandincreasedpermeability.第十八頁，共72頁幻燈片F(xiàn)actorswhichdecreasepermeability(extracellular):GlialCellDerivedNeurotrophicFactorTransformingGrowthFactorβ1HydrocortisoneAstrocyteproximity

第十九頁，共72頁幻燈片Intracellularfactors:ProteinKinaseCisamajorregulatoroftightJunctionformationandregulation.RaisingextracellularcalciumincreasesresistanceacrossthemembraneanddecreasesthepermeabilitymediatedthroughheterotrimericGproteinandproteinkinaseC(PKC)signalingpathways.cAMP第二十頁，共72頁幻燈片21基膜（basementmembrane） 是圍繞在毛細(xì)血管內(nèi)皮周圍的一層完整連續(xù)的網(wǎng)狀膜，形成血腦屏障的第二道隔膜。 它主要由IV型膠原和層粘蛋白構(gòu)成，起支持作用，防止由于靜水壓和滲透壓改變引起的血管變形。第二十一頁，共72頁幻燈片22基膜第二十二頁，共72頁幻燈片23神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞：是血腦屏障的第三道隔膜。 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（主要是星形膠質(zhì)細(xì)胞）的突起形成偽足，伸向血管壁周圍，包繞基膜，起著機(jī)械的屏障作用，限制毛細(xì)血管的通透性。 星形膠質(zhì)細(xì)胞有誘導(dǎo)和維持血腦屏障完整性的作用。第二十三頁，共72頁幻燈片24周細(xì)胞

是BBB的重要細(xì)胞成分,在腦血管發(fā)生、內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接形成、BBB分化和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性中起著調(diào)節(jié)作用。持續(xù)產(chǎn)生轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)來誘導(dǎo)和上調(diào)BBB的功能。具有巨噬細(xì)胞功能,能夠積極參與BBB調(diào)控的神經(jīng)免疫網(wǎng)絡(luò)。第二十四頁，共72頁幻燈片25體外血腦屏障模型的建立第二十五頁，共72頁幻燈片26體外血腦屏障模型通透性的評(píng)價(jià)第二十六頁，共72頁幻燈片27Paracellulartransport/sodiumfluoresceine(Na-F,376Da)體外血腦屏障模型通透性的評(píng)價(jià)第二十七頁，共72頁幻燈片28Brainpericytesareplatedatthelowersideofinserts(A),astrocytesatthebottomofthewells(B),andbrainendothelialcellsattheuppersideofthesameinserts(C)toreconstitutetheBBBinvitroApericytesBastrocytesCendothelialcells體外血腦屏障模型建立的過程第二十八頁，共72頁幻燈片29體外血腦屏障模型特性的評(píng)價(jià)NakagawaS,DeliMA,NakaoS,HondaM,HayashiK,NakaokeR,KataokaY,NiwaM:

Pericytesfrombrainmicrovesselsstrengthenthebarrierintegrityinprimaryculturesofratbrainendothelialcells.CellularandMolecularNeurobiology27(6):678-694,2007第二十九頁，共72頁幻燈片30體外血腦屏障模型特性的評(píng)價(jià)第三十頁，共72頁幻燈片31SubstancesSubstancesthatenterintothebrain -O2,CO2,N2-glucose,aminoacids,certainions -smallfatsolublemolecules(ethanol) -watersolublemolecules(aqueouschannelprotein)第三十一頁，共72頁幻燈片32SubstancesSubstancesthatcannotenterintothebrain -largeprotein -toxins -antibodies -monoamines(e.g:neurotransmitter)第三十二頁，共72頁幻燈片33腦室周圍小器官（

Circumventricularorgans,CVO）或“腦的特殊區(qū)”

腦的某些部位：海綿竇、垂體后葉、正中隆起、松果體、視丘、穹隆下器官、腦極后區(qū)、脈絡(luò)叢等區(qū)域缺少血-腦屏障。第三十三頁，共72頁幻燈片34血腦屏障的功能1.阻止外源性毒素及全身性遞質(zhì)進(jìn)入腦內(nèi)。2.避免腦組織自身神經(jīng)遞質(zhì)的流失。3.控制葡萄糖和乳酸鹽進(jìn)入腦內(nèi)。4.酶屏障阻止一些代謝產(chǎn)物進(jìn)入腦內(nèi)，選擇性地將腦內(nèi)一些有害物質(zhì)泵出腦外。第三十四頁，共72頁幻燈片352．血腦脊液屏障血腦脊液屏障（bloodcerebrospinalfluidbarrier） 是存在于血液與腦脊液之間的生理性屏障，主要位于腦室脈絡(luò)叢處?；窘Y(jié)構(gòu)由毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、軟腦膜和室管膜上皮三層組成。

毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞軟腦膜室管膜上皮：單層立方上皮，頂端連接緊密第三十五頁，共72頁幻燈片36Theventriclesareacomplexseriesofspacesandtunnelsthroughthecenterofthebrain.Theventriclessecretecerebrospinalfluid,whichsuspendsthebrainintheskull.CSFisproducedbystructurecalledthechoroidplexusinlateral,thirdandfourthventriclesTheventriclesalsoprovidearouteforchemicalmessengersthatarewidelydistributedthroughthecentralnervoussystem.TheVentricularSystem&CSF第三十六頁，共72頁幻燈片37TheVentricularsystemCSFflowsfromlateralventricle-3rdventriclethroughIVF3rdventricle&4thventricleareconnectedbyCerebralaqueductCSFflowsintoSubarachnoidspacethroughforamenofLuschka第三十七頁，共72頁幻燈片38血腦脊液屏障第三十八頁，共72頁幻燈片39血-腦脊液屏障的作用：1.維持腦脊液成分恒定。2.阻止血液中的有害 物質(zhì)進(jìn)入腦脊液內(nèi)。3.特殊轉(zhuǎn)運(yùn)的酶系統(tǒng)，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。4.伸長細(xì)胞有主動(dòng)運(yùn)輸物質(zhì)的作用。第三十九頁，共72頁幻燈片40室管膜細(xì)胞（伸長細(xì)胞）第四十頁，共72頁幻燈片413．腦脊液-腦屏障腦脊液-腦屏障（braincerebrospinalfluidbarrier）位于腦室和蛛網(wǎng)膜下隙的腦脊液與腦、脊髓的神經(jīng)細(xì)胞之間，其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)為室管膜上皮、基膜和星型膠質(zhì)細(xì)胞。

能阻止腦脊液中的有害物質(zhì)進(jìn)入腦脊髓實(shí)質(zhì)。室管膜上皮間僅有縫隙連接和中間連接，一般無緊密連接。第四十一頁，共72頁幻燈片42第四十二頁，共72頁幻燈片43（二）血腫瘤屏障血腫瘤屏障（bloodtumorbarrier,BTB） 是存在于腦腫瘤細(xì)胞與腦毛細(xì)血管及神經(jīng)組織之間的物質(zhì)交換屏障?；窘Y(jié)構(gòu)包括：毛細(xì)血管內(nèi)皮基膜腫瘤細(xì)胞膜第四十三頁，共72頁幻燈片44BBBBTBBTB第四十四頁，共72頁幻燈片45在體血腫瘤屏障模型的建立第四十五頁，共72頁幻燈片46腦腫瘤模型的評(píng)價(jià)第四十六頁，共72頁幻燈片47血-瘤屏障通透性復(fù)雜多樣腦腫瘤有時(shí)會(huì)出現(xiàn)復(fù)雜的血管變化： 血管密度增加、管徑增大，血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量增加、吞飲小泡增加、小泡運(yùn)輸功能亢進(jìn)、毛細(xì)血管缺乏連續(xù)性等。第四十七頁，共72頁幻燈片48血-瘤屏障存在異質(zhì)性和個(gè)體差異

不同腫瘤的組織間液壓

腦腫瘤內(nèi)微血管結(jié)構(gòu)、微血流動(dòng)力學(xué)、血 管內(nèi)及間質(zhì)氧分壓、間質(zhì)pH

不同類型的腫瘤以及同一腫瘤的不同生長 階段第四十八頁，共72頁幻燈片49第二節(jié)物質(zhì)通過血-腦屏障的方式和途徑

腦的毛細(xì)血管長643.6km，其表面積達(dá)20平方米，毛細(xì)血管內(nèi)每分鐘擴(kuò)散藥物的距離可達(dá)40μm。物質(zhì)透過血-腦屏障主要有四條途徑：1.小分子直接經(jīng)細(xì)胞間隙擴(kuò)散2.脂溶性分子的融膜擴(kuò)散3.特異受體介導(dǎo)的吞飲轉(zhuǎn)運(yùn)4.特異載體通道和酶系統(tǒng)第四十九頁，共72頁幻燈片TransportmechanismsattheBBB.1=paracellulardiffusion,2=transcellulardiffusion,3=ionchannel4=ion-symportchannel5=ion-antiportchannel6=facilitateddiffusion,7=activeeffluxpump8=active-antiporttransport,9=receptormediatedendocytosis第五十頁，共72頁幻燈片51（一）被動(dòng)擴(kuò)散(Simplediffusion

)

一些物質(zhì)以被動(dòng)擴(kuò)散方式通過血腦屏障。通透率：

物質(zhì)分子量的大小

分子的極性

與血漿蛋白的結(jié)合程度第五十一頁，共72頁幻燈片52（二）易化擴(kuò)散(Facilitateddiffusion)

通過“鑲嵌”在血腦屏障界面上的蛋白載體或離子通道來完成。易化擴(kuò)散的特點(diǎn)：

順濃度差：不需消耗能量

需要載體和酶系統(tǒng)參與

競爭性

專一性

飽和性第五十二頁，共72頁幻燈片53（三）主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)(Activetransport

)

細(xì)胞直接或間接利用代謝產(chǎn)生的能量將物質(zhì)逆濃度梯度或電位梯度進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的過程，是物質(zhì)通過血腦屏障的主要方式。載體種類：(1)氨基酸載體；(2)胺類載體；

(3)單羧酸載體；(4)腺苷載體；

(5)Na+-K+-ATP酶轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)；(6)P-糖蛋白

(7)有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(OAT)

主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的特點(diǎn)：

逆濃度差和逆電化學(xué)梯度：需要消耗能量

競爭性

專一性第五十三頁，共72頁幻燈片Themostimportanteffluxtransporterswhichsofaridentifiedattheblood–brainbarrierbelongtotheclassofATPbinding-cassette(ABC)transportersPharmacolRev60:196–209,2008第五十四頁，共72頁幻燈片P-GlycoproteinIHC-MidBrainCapillariesClinCancerRes16692007;13(6)March15,2007第五十五頁，共72頁幻燈片P-GlycoproteinDoesmakeaDifference:Paclitaxel+Valspodar(ValspodarisapotentinhibitorofP-gp)PaclitaxelAloneEffectofvalspodarcoadministrationonthepaclitaxelbrainlevelsinnudemiceafterintravenousinjectionEffectofvalspodar/paclitaxelcoadministrationontheintracerebralgrowthofthehumanU118MGglioblastomainnudemice.第五十六頁，共72頁幻燈片57（四）吞飲

也稱為受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)(receptormediatedtransport,RMT)，是指大分子物質(zhì)或物質(zhì)的團(tuán)塊借助于細(xì)胞膜形成吞飲泡的方式進(jìn)入細(xì)胞的過程。

蛋白質(zhì)受體： 轉(zhuǎn)鐵蛋白質(zhì)受體、胰島素受體、低密度脂蛋白受體等。第五十七頁，共72頁幻燈片58第五十八頁，共72頁幻燈片59（五）酶屏障

腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上含有部分酶系統(tǒng)，可以使來自循環(huán)系統(tǒng)中的神經(jīng)遞質(zhì)或藥物降解轉(zhuǎn)化，阻止其進(jìn)入腦內(nèi)發(fā)揮作用，維持腦內(nèi)神經(jīng)傳遞及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。含有的酶包括：單胺氧化酶γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶多巴氨脫羧酶假性膽堿酯酶第五十九頁，共72頁幻燈片60（六）特殊部位轉(zhuǎn)運(yùn)腦室周圍小器官(CVO)特點(diǎn)： 缺乏血腦屏障，血竇多，竇外無膠質(zhì)突，僅有網(wǎng)狀纖維包裹，毛細(xì)血管內(nèi)皮有小孔，基膜不連續(xù)并與鄰近膠質(zhì)分開，有較大的通透性第六十頁，共72頁幻燈片61第六十一頁，共72頁幻燈片62第三節(jié)治療基因向腦及腦腫瘤內(nèi)的遞送

常用的治療基因遞送途徑及方式：（一）直接遞送1、直接定向接種（inoculation） 將治療基因或病毒載體通過各種方式直接注入到活體靶組織內(nèi)。 目前在動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)中使用最多的遞送方式就是腦或腦腫瘤內(nèi)局部注射。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中最常見的：腺病毒、單純皰疹病毒載體

第六十二頁，共72頁幻燈片63直接定向接種優(yōu)點(diǎn)：避開血-腦屏障和血-瘤屏障。直接定向接種缺點(diǎn)：接種的病毒擴(kuò)散能力有限(1-2mm)操作較困難靶向性差

目前在臨床腦腫瘤治療上，結(jié)合手術(shù)直接給予化療藥物比較